用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的展示il－5、il－3或嗜酸细胞活化趋化因子的抗原阵列的制作方法

专利名称：用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的展示il－5、il－3或嗜酸细胞活化趋化因子的抗原阵列的制作方法
背景技术：
发明领域本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是包含IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子(eotaxin)蛋白或肽的阵列。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含一种病毒样颗粒和至少一个与之结合的IL-5、IL-13和/或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。本发明也提供一种分别生产该偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于生产治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病的疫苗，以及预防或治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病、有效诱导免疫应答、特别是抗体应答的药物疫苗(pharmaccine)。此外，本发明的组成物尤其可用于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答。
相关技术许多变应性疾病，包括哮喘、鼻炎、鼻息肉、嗜酸细胞增多综合征和特应性皮炎，具有以显著的嗜酸细胞浸润为特征的主要炎性成分。
在这些疾病中，变应性哮喘是医学上最重要的一组疾病，它被认为是一种呼吸道的慢性炎症性疾病，其临床特征在于阵发性气流阻塞、呼吸道炎症和支气管对非特异性变应原的反应性增强。呼吸道阻塞和过度反应的程度通常与呼吸道炎症水平相关。这些临床特征是哮喘严重程度的指标(Kay，A.B.，J Allergy Clin Immunol，1991，87893；De Monchy，J.G.等人，Am Rev Respir Dis，1985，131373；Beasley，R.等人，Am Rev Respir Dis，1989，139806；Azzawi，M.等人，Am Rev Respir Dis，1990，1421407；Ohashi，Y.等人，Am RevRespir Dis，1992，1451469；Nakajima，H.等人，Am Rev Respir Dis，1992，146374；Broide，D.H.等人，J Allergy Clin Immunol，1991，88637；Warlaw，A.J.等人，Am Rev Respir Dis，1988，13762)。细胞浸润与疾病进展相关并作为呼吸道炎症的标志，而后者是发病机理和病理学的一个主要影响因素。哮喘的炎性浸润复杂；然而，现在普遍认为，具有Th2细胞因子表达谱(Th2细胞)的CD4+Th淋巴细胞在这种疾病的临床表现和发病机理中起关键作用(Robinson，D.S.等人，J Allergy Clin Immunol，1993，92397；Walker，C.等人，JAllergy Clin Immunol，1991，88935)。Th2细胞通过释放多种细胞因子，如IL-4、-5、-9、-10、-13，调控呼吸道的变应性炎症，来调节疾病的进展和呼吸道的过度反应性(AHR)(Robinson，D.S.等人，NEng J Med，1992，326298；Robinson，D.S.等人，J Allergy ClinImmunol，1993，92313；Walker，C.等人，Am Rev Respir Dis，1992，146109；Drazen，J.M.等人，J Exp Med，1996，1831)。类似于Th2细胞，肺中嗜酸性粒细胞及其炎性产物的水平与疾病严重程度相关，在晚期哮喘反应中，呼吸道中这种白细胞的积累是支气管功能障碍的一个主要特征(Bousquet，J.等人，N Eng J Med，1990，3231033)。尽管Th2细胞调控变应性反应的多个方面，但是认为它们通过分泌IL-5调节嗜酸细胞增多的作用是哮喘中的一个主要促炎途径。
白介素-5(IL-5)是哮喘中高水平表达的一种促炎因子。而且，IL-5是主要与特应性疾病发病机理有关的一种细胞因子。它特异控制嗜酸性粒细胞的产生、激活和定位，而嗜酸性粒细胞是特应性疾病中组织损伤的主要原因。而且，IL-5是T细胞产生的诱导型细胞因子，具有显著的嗜酸性粒细胞系特异性。IL-5在转录水平上受控制，该基因的调节是治疗嗜酸性粒细胞依赖的变应性疾病(如哮喘、湿疹和鼻炎)的一个有前途的靶标。
有大量的证据表明，嗜酸性粒细胞是哮喘中变应性反应的一种主要成分。仅仅IL-5与嗜酸性粒细胞的产生有关，它与其它多种细胞因子如IL-13、趋化因子如嗜酸细胞活化趋化因子和其它因子控制嗜酸性粒细胞的激活、定位和存活。因此，IL-5已经成为新型抗哮喘药的一个重要药物靶标(Foster，P.S.等人，Pharmacol Ther，2002，94(3)253；Foster，P.S.等人，Trends Mol Med，2002，8(4)162)。
人与鼠蛋白质之间有71％的同源性(细胞因子手册)。除了与鼠白介素-3、鼠GM-CSF和鼠干扰素-γ蛋白中的短片段之外，IL-5与其它细胞因子不显示显著的氨基酸序列同源性。人和小鼠蛋白序列的预测分子量都是13.1kDa。具有生物活性的IL-5是二硫键连接的同型二聚体，通过高度保守的半胱氨酸残基(44-86’和86-44’)共价连接，使两单体定向于头-尾构型(Takahashi T.等人，Mol.Immunol.27911-920，1990)。尽管野生型单体IL-5没有生物活性，但是通过插入诱变构建了功能性的IL-5单体(Dickason RR等人，J.Mol.Med74535-461996)。人IL-5晶体结构的分析证实它是一种新型的两结构域构型，每个结构域需要两条链的参与，与GM-CSF、白介素-3和白介素-4中发现的细胞因子折叠有高度相似性(Milburn M.V.等人，Nature 363172-176)。对于结合IL-5受体和生物活性，IL-5的C端区似乎是非常重要的(Proudfoot等人，J.Protein Chem.15(5)491-9，1996)。IL-5与其受体的结合被认为在螺旋A和D的重叠区域中发生，其中螺旋A主要参与结合受体的α-亚单位(Graber P.等人，J.Biol Chem 27015762-15769，1995)。天然人IL-5含有两个可能的糖基化位点，小鼠IL-5有三个。人IL-5在Thr3处N-糖基化并且O-糖基化。在真核系统中表达的重组IL-5由于不同的糖基化显示宽范围的分子量，从45-60kDa。去糖基化的IL-5和原核细胞中表达的IL-5保留全部的生物学活性(Tominaga A.等人，J.Immunol1441345-1352，1990)。
药物发现途径一般是基于筛选抑制IL-5产生的抑制剂、配体拮抗剂、受体表达和受体激活的控制剂。具体而言，对IL-5作用的抑制可能提供一种治疗哮喘和其它嗜酸性粒细胞相关疾病的方法。免疫治疗是控制IL-5水平和嗜酸性粒细胞相关疾病(如哮喘)的另一种极有吸引力的方法。
当前，用于预防哮喘症状的最常用的治疗是吸入皮质类固醇。使用这些药物通常是相当安全的，并且很便宜。然而，它们是通过诱导全身免疫抑制作用起效的，长期使用可能会有不利的副作用，包括高血压、骨质疏松及发展为白内障。皮质类固醇必须每天施用，因此患者的顺应性是成功使用这些药物的另一个问题。而且，用皮质类固醇难以治愈的哮喘患者必须采用替代治疗。用针对IL-5的免疫治疗剂选择性靶向于嗜酸性粒细胞可以克服使用具有多效性作用的普通免疫治疗剂引起的副作用。
未来对疾病(如哮喘)的可能的治疗包括被动免疫，以及使用IL-5特异性单克隆抗体。使用人源化抗IL-5单克隆抗体的临床试验正在进行，旨在减少哮喘患者的嗜酸细胞增多。具体而言，已经报告了使用SCH55700(eslizumab，Schering Plough)和SB240563(mepolizumab，Glaxo Smith Kline)的临床试验，前者是一种对来自不同种的IL-5有活性的人源化单克隆抗体(Egan，R.W.等人，Arzneimittel-Forschung，1999，49779)，后者是一种对人和灵长类动物的白介素-5特异性的人源化抗体[Hart，T.K.等人，Am JRespir Crit Care Med，1998，157A744；Zia-Amirhosseini，P.等人，J Pharmacol Exp Ther，1999，2911060]。这两种单克隆抗体在I期临床上都证明有可以接受的安全性(safety profiles)并导致嗜酸性粒细胞数量减少，但未观察到呼吸道过度反应性的降低。嗜酸性粒细胞对哮喘患者呼吸道造成的有害作用被认为是涉及组织重建的慢性现象。设计用来测试抗IL-5治疗在这种疾病中效果的研究方法还有待考验并且正在发展中。
然而，单克隆抗体治疗也有几个缺点。单克隆抗体是昂贵的治疗剂，必须每个月或每两个月施用一次。为了施用注射性药物而反复就诊所造成的患者不顺应性是一个重要问题。此外，患者与治疗抗体之间的异型差异也可导致单克隆抗体治疗最终无效。高剂量的单克隆抗体和形成免疫复合物的可能性也可以降低被动免疫的效果。主动接种策略可以限制这些问题。
WO 97/45448描述了为慢性哮喘或证实有嗜酸细胞增多的其它疾病或与IL-5有关的其它疾病提供治疗剂的另一种方法。其中提出了利用“能够拮抗IL5活性的IL5分子的修饰和变体形式”改善、缓解或减少由IL5天然或突变形式引起的异常作用。据报告，拮抗作用是IL5变体形式与IL5受体的低亲和力链结合但不与高亲和力受体结合的结果。通过这种作用方式，该变体与IL5竞争结合其受体，而不发挥IL5的生理学作用。
嗜酸细胞活化趋化因子是趋化因子受体3特异的一种趋化因子，存在于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞上。然而，嗜酸细胞活化趋化因子具有高度的嗜酸性粒细胞特异性(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。在嗜酸细胞活化趋化因子-1敲除小鼠中，嗜酸性粒细胞迁移减少70％，但是仍能发展为嗜酸细胞增多症(Rotherberg等人，J.Exp.Med.185785-90(1997))。IL-5似乎负责嗜酸性粒细胞从骨髓到血液的迁移，而嗜酸细胞活化趋化因子负责组织中的局部迁移(Humbles等人，J.Exp.Med.186601-12(1997))。因此除IL-5外，靶向于嗜酸细胞活化趋化因子可以增强旨在降低嗜酸细胞增多的免疫治疗。
人类基因组含有3种嗜酸细胞活化趋化因子基因—嗜酸细胞活化趋化因子1-3，它们有30％的同源性。对于小鼠，迄今为止已知2种基因嗜酸细胞活化趋化因子1和嗜酸细胞活化趋化因子2(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。它们有38％的同源性。鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2与人嗜酸细胞活化趋化因子-2有59％的同源性。在小鼠中，嗜酸细胞活化趋化因子-1似乎在胃肠道中广泛表达，而嗜酸细胞活化趋化因子-2似乎主要在空肠中表达(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。嗜酸细胞活化趋化因子-1存在于支气管肺泡液中(Teixeira等人，J.Clin.Invest.1001657-66(1997))。人嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列示于SEQ ID NO242(aa 1-23对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列示于SEQ ID NO243(aa 1-26对应于信号肽)，人嗜酸细胞活化趋化因子-3的序列示于SEQ ID NO244(aa 1-23对应于信号肽)，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-1的序列示于SEQ ID NO245(aa1-23对应于信号肽)，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2的序列示于SEQID NO246(aa 1-23对应于信号肽)。
嗜酸细胞活化趋化因子单体的分子量为8.3kDa，与二聚体的嗜酸细胞活化趋化因子在广泛条件下存在平衡。37℃下估计的Kd为1.3mM，而单体是主要形式(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。嗜酸细胞活化趋化因子的结构已经通过NMR光谱阐明。与其受体CCR3的结合位点位于N端，第一个半胱氨酸之前的区域是关键的(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9，1998)。来源于与嗜酸细胞活化趋化因子结合的趋化因子受体的肽证实了这一发现。嗜酸细胞活化趋化因子含有4个半胱氨酸，形成两个二硫键，并且能够化学合成(Clark-Lewis等人，Biochemistry 303128-3135，1991)。嗜酸细胞活化趋化因子1在Thr71上有不同的O-糖基化形式(Noso，N.等人，Eur J.Biochem.253114-122)。嗜酸细胞活化趋化因子1在大肠杆菌细胞液中的表达也已经描述(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。曾经报告了嗜酸细胞活化趋化因子-2在大肠杆菌中表达为包涵体，随后重折叠(Mayer等人，Biochemistry398382-95(2000))，以及在昆虫细胞中的表达(Forssmann等人，J.Exp.Med.1852171-6(1997))。
白介素-13(IL-13)作为一种生物活性的单体Th2细胞因子被分泌。人IL-13的成熟形式包含112个氨基酸，小鼠的包含111个氨基酸。计算的该蛋白质的分子量约为12.4kDa。IL-13能够被N-连接地糖基化(Fitzgerald K.A.等人，《细胞因子实用手册》，第二版，Academic Press)。IL-13由Th2细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和自然杀伤细胞产生(Brombacher F，2000 BioessaysJul；22(7)646-56)。功能性IL-13受体是一种异二聚体，由白介素4受体α链(IL-4Rα链)和两种IL-13受体α结合蛋白之一组成(Brombacher F，2000 Bioessays Jul；22(7)646-56)。
IL 13在哮喘的病理学中起重要作用。已经证实，IL 13与该疾病的关键特征有关。它对变应原诱导的呼吸道过度反应性(AHR)和粘液产生具有直接作用，与嗜酸细胞增多有关(Kuperman D.A.2002Nature Medicine待印刷)。在小鼠中IL-13的选择性中和显著减弱了哮喘症状。此外，施用IL-13使未致敏的T细胞缺陷小鼠或幼稚小鼠分别具有哮喘样症状(Grünig G.等人，1998 Science，282(5397)2261-3，Wills-Karp，M.等人，1998 Science 282(5397)2258-61)。定向缺失IL-13的小鼠不能发生变应原诱导的AHR，粘液产生显著减少(Walter，D.M.等人，2001 J Immunol 167(8)4668-75)。由于在鼠哮喘模型中IL-13也影响嗜酸细胞增多(Grünig G.等人，1998Science，282(5397)2261-3)，IL-13可能与嗜酸细胞增多相关的许多其它变应性疾病有关，中和其活性可能提供一种对患者有前途的治疗。
另外，在多种肿瘤类型(例如，迄今为止检测的所有何杰金氏淋巴疾病细胞系)中已经发现IL-13和IL-13受体的正调节。因此，针对IL-13免疫可提供一种治疗过量表达IL-13的肿瘤患者的方法。
提高接种效率的一种方法是提高所使用的抗原的重复程度。与分离的蛋白质不同，在不使用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒均能诱发快速、有效的免疫应答(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。尽管病毒通常几乎不含蛋白质，但它们比其分离成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，众所周知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和顺序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示有序的表位阵列，可有效交联B细胞上表位特异的免疫球蛋白(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today 17553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，T辅助细胞随后诱导B细胞从产生IgM抗体向产生IgG抗体转换，以及产生长期B细胞记忆—这是所有接种的目标(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。病毒结构甚至与自身免疫病中抗抗体的产生有关，并且作为对病原体的自然应答的一部分(参见Fehr，T.等人，JExp.Med.1851785-1792(1997))。因此，高度组织的病毒表面呈现的抗体能够诱发强烈的抗抗体应答。
然而，如上所述，免疫系统通常不能产生抗自身来源结构的抗体。对于低浓度存在的可溶性抗原，这是由于Th细胞水平上的耐受。在这些条件下，将自身抗原与一种能够输送T辅助的载体偶联可以打破这种耐受。对于高浓度存在的可溶性蛋白质或低浓度的膜蛋白，B和Th细胞可能耐受。然而，B细胞耐受是可逆转的(无反应性)，施用与外源载体偶联的高度组织形式的抗原能够打破这种耐受(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。
发明概述我们现在发现，与具有固有重复组织结构的核心颗粒结合，在这里具体地分别与病毒样颗粒(VLP)和VLP亚单位结合的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，产生高度有序、重复的偶联物，是诱导IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子特异抗体的强免疫原。另外，在小鼠哮喘模型中，这些自身反应性抗体抑制嗜酸细胞增多。因此，本发明提供一种治疗变应性嗜酸细胞增多症的治疗方法，它基于有序、重复的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽-核心颗粒阵列，具体的分别是VLP-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽偶联物和阵列。这种治疗剂在接种的动物中能够诱导高滴度的抗IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子抗体，在小鼠哮喘模型中抑制嗜酸细胞增多。
本发明因此提供一种组成物，其包含(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；和(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇和所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序重复的抗原阵列。适用于本发明的核心颗粒的优选实施方案有病毒、病毒样颗粒、噬菌体、细菌菌毛或鞭毛，或具有能够形成根据本发明的有序重复抗原阵列的固有重复结构的其它任何核心颗粒。
更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含有序重复的抗原或抗原决定簇阵列，在这里特别是IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽-VLP偶联物。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和与之结合的至少一个(一种)IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。本发明也提供一种分别生产该偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于生产治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病的疫苗，以及预防或治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病、有效诱发免疫应答、特别是抗体应答的药物疫苗(pharmaccine)。而且，在所述情形下，本发明的组成物尤其可用于有效诱发自身特异的免疫应答。
在本发明中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽一般以定向方式分别与核心颗粒和VLP结合，产生有序重复的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽抗原阵列。而且，核心颗粒和VLP的高度重复、组织的结构分别介导IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽以高度有序重复的方式展示，产生高度组织、重复的抗原阵列。此外，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP的结合提供T辅助细胞表位，因为对于分别用核心颗粒-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽阵列和VLP-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽阵列免疫的宿主而言，核心颗粒和VLP是外源的。这些阵列在其高度组织结构、大小和阵列表面的抗原重复性方面不同于现有技术的偶联物。
本发明的一个方面，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽在与IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽的正确折叠相容的适当表达宿主中表达，或者合成，而核心颗粒和VLP分别从分别适于核心颗粒和VLP折叠和装配的表达宿主中表达和纯化。IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽可以化学合成。然后通过IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合，装配成IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽阵列。
另一方面，本发明提供一种组成物，其包含(a)一种病毒样颗粒，和(b)至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，还提供一种药物组合物，其包含(a)权利要求1或权利要求22的组成物，和(b)一种药物可接受的载体。
另一方面，本发明提供一种疫苗组合物，其包含一种含下列成分的组成物(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与第一附着位点连接；其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供一种包含一种组成物的疫苗组合物，其中所述组成物含有(a)一种病毒样颗粒；和(b)至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽；其中所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种生产权利要求1的组成物的方法，包括(a)提供一种病毒样颗粒；(b)提供至少一个(一种)抗原或IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽；(c)将所述病毒样颗粒与所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇混合，使得所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
另一方面，本发明提供一种生产权利要求22的组成物的方法，包括(a)提供含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)提供含有至少一个第二附着位点的至少一个(一种)抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇自然存在的附着位点；其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；(c)将所述核心颗粒与所述至少一个(一种)抗原或抗原决定簇混合，其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。
另一方面，本发明提供一种免疫方法，包括对动物或人施用权利要求1或权利要求22或权利要求74的组成物。
另一方面，本发明提供权利要求1或权利要求22或权利要求74的组成物在生产用于治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病的药物中的应用。
另一方面，本发明提供权利要求1或权利要求22或权利要求74的组成物在制备用于治疗或预防性处理具有嗜酸细胞成分的变应性疾病(优选哮喘)的药物中的应用。此外，另一方面，本发明也提供权利要求1或权利要求22或权利要求74的组成物单独或与其它试剂组合在生产用于治疗或预防具有嗜酸细胞成分的变应性疾病(特别是哮喘)的组合物、疫苗、药物中的应用。
因此，本发明具体提供适于预防和/或缓解具有嗜酸细胞成分的变应性疾病或相关疾病的疫苗组合物。本发明还分别提供在动物，特别是母牛、绵羊和牲畜，以及在人类中，用于预防和/或缓解具嗜酸细胞成分的变应性疾病或相关病症的免疫和接种方法。本发明的组合物可用于预防或治疗。
在具体实施方案中，本发明提供用来预防和/或缓解由“自身”基因产物，即如此处所用的“自身抗原”引起或加重的具嗜酸细胞成分的变应性疾病或相关疾病的方法。在相关实施方案中，本发明提供分别在动物和个体中诱发免疫应答的方法，导致可预防和/或缓解由“自身”基因产物引起或加重的具嗜酸细胞成分的变应性疾病或相关疾病的抗体产生。
本领域普通技术人员会理解，当对动物或人施用本发明的组成物时，它们可以是在含有盐、缓冲液、佐剂或希望用来提高组成物效能的其它物质的组合物中。在大量资料中提供了适于在制备药物组合物中应用的材料的实例，包括Remington’s Pharmaceutical Sciences(Osol，A编著，Mack Publishing Co.，(1990))。
如果接受个体能够耐受本发明的组合物的施用，则称该组合物是“药理可接受的”。进而，本发明的组合物将以“治疗有效量”(即产生希望的生理学作用的量)施用。
本发明的组合物可以通过本领域周知的多种方法施用，但是通常通过注射、输液、吸入、口服或其它适当的物理方法施用。这些组合物也可肌肉内、静脉内或皮下施用。用于施用的组合物成分包括无菌水(例如生理盐水)或非水溶液和悬液。非水性溶剂的实例包括丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄榄油，和注射用有机酯，如油酸乙酯。可以利用载体或封闭敷裹提高皮肤通透性并提高抗原吸收。
根据本领域所知、下列附图和发明描述以及权利要求书，本领域普通技术人员会了解本发明的其它实施方案。
附图简述

图1.小鼠His-C-IL5的表达。如上所述，在使用或不使用IPTG的条件下培养pMODC6-IL5/BL21-DE3之后，从获得的不可溶细胞级分中制备提取物。将等量提取物加样到16％SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，电泳，用考马斯蓝染色。M道分子量标志(NEB，预染色的宽范围标记)，1道未诱导培养物的提取物，2道IPTG诱导4小时的培养物的提取物。
图2.用Ni-NTA纯化的His-C-IL-5的SDS-PAGE分析。将不同纯化阶段的样品加样到16％SDS-PAGE上，在还原条件下电泳。蛋白质用考马斯蓝染色。M分子量标志；1溶解的包涵体；2流出液(未结合的物质)；3洗液1pH 6.5；4洗液2pH 6.5；5洗液3pH 5.9；6-8洗脱液pH4.5；9纯重组小鼠IL-5。
图3.显示重组小鼠His-C-IL5纯化的SDS-PAGE。在含(左起第2道)或不含(左起第3道)二硫苏糖醇的16％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离5μg等份的纯化小鼠His-C-IL5。凝胶用考马斯蓝R-250染色(对蛋白质)。M道含有分子量标志(NEB，预染色的宽范围标准)。
图4.His-C-IL-5对BCL1细胞增殖的影响。在下列成分存在下，BCL1细胞与3H-胸苷一起温育鼠IL-5(30ng/ml)，His-C-IL5(30ng/ml)；Qβ(200ng/ml)；与无关细胞因子化学交联的Qβ(200ng/ml)或Qβ-His-C-IL5(105ng/ml)。未稀释的初始浓度在括号中标出，从指定的初始浓度开始进行5倍连续稀释。3H-胸苷的掺入通过液闪计数测定。
图5.通过考马斯蓝染色的SDS-PAGE对偶联反应的分析。M道预染色的分子量标志，1道纯化的His-C-IL-5，2道用化学交联剂SMPH衍化后的Qβ，3道偶联反应产物，4道透析后的偶联反应产物。偶联反应物中不同种类分子的身份在图右侧标出。
图6.通过Western-blot对偶联反应的分析。M道分子量标志；1道纯化的His-C-IL-5；2道用化学交联剂SMPH衍化后的Qβ；3道偶联反应产物。检测His-C-IL5的第一抗体是大鼠抗His抗体，随后与HRP偶联的抗大鼠抗体一起温育。如下检测Qβ用抗Qβ的兔多克隆抗血清染色，随后用HRP偶联的抗兔抗体染色。相同的印迹如上所述染色。
图7四重ELISA。A.捕获ELISA的示意图。该试验中的不同成分是1，山羊抗兔IgG；2，兔抗Qβ多克隆抗血清；3，Qβ-His-C-IL5、Qβ或PBS；4，抗IL5单克隆抗体、TREK 4或5；5，抗小鼠IgG-HRP。B.四重ELISA的结果。中和性单克隆抗体与共价偶联于有序抗原阵列的His-C-IL5相互作用的能力通过ELISA测定。
图8.抗IL-5血清的ELISA。ELISA板用His-C-IL5包被，与免疫前或第21天从接种Qβ-His-C-IL5(4只小鼠)或接种与His-C-IL5混合的Qβ的小鼠(5只小鼠)中采集的血清温育。血清的初始稀释度为1∶50，进行5倍稀释。IL-5特异性抗体的结合用与HRP偶联的抗小鼠IgG和显色底物检测。
图9.重组GST-EK-IL13-C1-His在BL21中的诱导表达。16％SDS-PAGE的考马斯蓝染色。加样量对应于所示细菌裂解液的0.1OD600。IL-13融合蛋白的表达用0.75mM IPTG诱导，4小时后通过SDS-PAGE分析样品。注意，在相应质粒(pMod-GST-EK-IL13-C1-His)转化并用IPTG诱导的细菌中，IL-13融合蛋白强表达(见箭头)。
图10.变性条件下GST-EK-IL13-C1-His的纯化。两个16％SDS-PAGE的考马斯蓝染色。加样量相当于5μl所述级分。IL-13融合蛋白从包涵体获得，溶解于盐酸胍变性缓冲液中，上样到以相同缓冲液平衡的Ni2+-琼脂糖柱上。结合的蛋白质用不同pH分两步洗脱。该图显示TCA沉淀的用pH 4.5的第二种缓冲液洗脱下来的所述级分(#5-#30)等份的分析。注意，由于C端His尾的存在，IL-13融合蛋白与Ni2+-琼脂糖柱高效结合，通过降低pH洗脱。
图11.重折叠后可溶性IL-13融合蛋白的分析。GST-EK-IL13-C1-His融合蛋白如18D部分所述重折叠。重折叠反应结束后，蛋白质溶液等份通过SDS-PAGE分析，随后进行考马斯蓝染色(A)或Westernblot(B)。所述第一抗体分别购自R&D Systems(α-IL13，AF-413-NA)、Qiagen(α-PentaHis，34660)和Amersham Biosciences(α-GST，24-4577)。抗体以使用手册所述浓度使用。
图12.小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1的表达。用1mM IPTG诱导9小时后，用pmEo-C1转化的BL21/DE3细胞的细胞裂解液的上清液在16％ PAGE凝胶上电泳，印迹到硝酸纤维素膜上，与山羊抗小鼠嗜酸细胞活化趋化因子抗体(R&D System)反应。1道预染色的蛋白质标记(New England Biolabs)。2道用1mM IPTG诱导9小时后，用pmEo-C1转化的BL21/DE3细胞的细胞裂解液的上清液。3道预染色的蛋白质标记(New England Biolabs)。4道与2道相同的裂解液的Western blot，用抗小鼠嗜酸细胞活化趋化因子抗体探针杂交。
发明详述除非另外定义，此处使用的所有技术与科学术语与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同。尽管在本发明的实施与测试中可以使用与本文所述相似或相当的任何材料和方法，但是下文只对优选的材料和方法加以描述。
1.定义具有嗜酸细胞成分的变应性疾病具有嗜酸细胞成分的变应性疾病这一术语在此是指循环血液或身体组织和体液中嗜酸性粒细胞数量增多的疾病状态或病症。嗜酸性粒细胞增多并且对疾病状态有直接或间接作用的疾病包括哮喘，枯草热，鼻炎，鼻息肉，特发性嗜酸细胞增多综合征，特应性皮炎，皮肤病和皮疹，肺病如L_efflers综合征，慢性嗜酸细胞性肺炎，Churg-Strauss综合征和未知原因的嗜酸细胞过多综合征。本领域技术人员能够识别具有嗜酸细胞成分的变应性疾病。
氨基酸接头在此使用时，本说明书中的“氨基酸接头”，也被称为“接头”，它使抗原或抗原决定簇与第二附着位点连接，或者更优选地，已经包含或含有第二附着位点，一般—但不是一定—是一个氨基酸残基，优选的是半胱氨酸残基。然而，在此使用的术语“氨基酸接头”并非意味着这种氨基酸接头只是由氨基酸残基组成，但是由氨基酸残基组成的氨基酸接头是本发明的一个优选实施方案。氨基酸接头的氨基酸残基优选地包含本领域公知的天然存在的氨基酸或非天然氨基酸，所有L-或所有D-氨基酸或其混合物。然而，本发明也包括一种含有一个含巯基或半胱氨酸残基的分子的氨基酸接头。该分子优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分。然而，除了氨基酸接头外，本发明范围内也包括优选地含有C1-C6烷基、环烷基(C5，C6)、芳基或杂芳基部分且不含任何氨基酸的接头。抗原或抗原决定簇或任选地第二附着位点与氨基酸接头的连接优选地是通过至少一个共价键，更优选地是通过至少一个肽键。
动物在此使用的术语“动物”包括例如人、绵羊、麋鹿、鹿、长耳鹿、貂、哺乳动物、猴、马、牛、猪、山羊、狗、猫、大鼠、小鼠、鸟类、鸡、爬行动物、鱼、昆虫和蜘蛛类动物。
抗体在此使用的术语“抗体”是指能够结合表位或抗原决定簇的分子。该术语包括整个抗体及其抗原结合片段，包括单链抗体。最优选地，抗体是人抗原结合性抗体片段，包括但不限于Fab、Fab’和F(ab’)2、Fd、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)，以及包含VL或VH域的片段。抗体可来源于任何动物，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡抗体。在此使用的“人”抗体包括具有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，包括从人免疫球蛋白文库分离的抗体，或者来自不表达内源免疫球蛋白的一种或多种人免疫球蛋白转基因的动物，如Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598所述。
抗原在此使用的术语“抗原”是指如果由MHC分子呈递，即能够被抗体或T细胞受体(TCR)结合的分子。在此使用的术语“抗原”也包括T细胞表位。抗原还能够被免疫系统识别，并且/或者能够诱发体液免疫应答和/或细胞免疫应答，导致B和/或T淋巴细胞的激活。然而，至少在某些情况下，这可能需要抗原含有或连接于Th细胞表位，并且使用佐剂。一个抗原可包含一个或多个表位(B和T表位)。上述特异性反应是指抗原通常以高选择性方式优选地与其相应的抗体或TCR反应，而不与可能由其它抗原诱导的其它许多抗体或TCR反应。此处使用的抗原也可以是几种不同抗原的混合物。
抗原决定簇在此使用的术语“抗原决定簇”是指可被B或T淋巴细胞特异识别的抗原部分。B淋巴细胞对抗原决定簇的响应是产生抗体，而T淋巴细胞通过增殖和建立介导细胞和/或体液免疫所必需的效应功能来响应抗原决定簇。
连接(association)在此使用的术语“连接”当用于第一和第二附着位点时，是指第一与第二附着位点优选地通过至少一个非肽键结合。连接的性质可以是共价、离子、疏水、极性的或其任意组合，优选地，连接的性质是共价结合。
第一附着位点在此使用的短语“第一附着位点”是指非天然或天然来源的一种元件，位于抗原或抗原决定簇上的第二附着位点可与之连接。第一附着位点可以是蛋白质、多肽、氨基酸、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。第一附着位点通常且优选地位于核心颗粒(优选地如病毒样颗粒)的表面。核心和病毒样颗粒的表面上分别存在多个一般为重复构型的第一附着位点。
第二附着位点在此使用的短语“第二附着位点”是指与抗原或抗原决定簇连接的一种元件，位于核心颗粒和病毒样颗粒表面的第一附着位点分别可与之连接。抗原或抗原决定簇的第二附着位点可以是蛋白质、多肽、肽、糖、多核苷酸、天然或合成聚合物、次级代谢物或化合物(生物素、荧光素、视黄醇、洋地黄毒苷、金属离子、苯甲基磺酰氟)或其组合，或者是其化学反应性基团。抗原或抗原决定簇上至少存在一个第二附着位点。因此，术语“含有至少一个第二附着位点的抗原或抗原决定簇”是指至少含有抗原或抗原决定簇和第二附着位点的抗原或抗原构建体。然而，特别是对于非天然来源的第二附着位点，即抗原或抗原决定簇内非天然存在的位点，这些抗原或抗原构建体含有“氨基酸接头”。
结合(bound)在此使用的术语“结合”是指结合或附着，它们可以是共价的，例如化学偶联，或者是非共价的，例如离子相互作用、疏水相互作用、氢键等。共价键例如可以是酯、醚、磷酯、酰胺、肽、酰亚胺、碳-硫键、碳-磷键等。术语“结合”比术语如“偶联”、“融合”和“附着”范围更广，并且包括后者。
外壳蛋白在此使用的术语“外壳蛋白”是指噬菌体或RNA噬菌体的蛋白质，它们能够参与噬菌体或RNA噬菌体的衣壳装配。然而，当指RNA噬菌体的外壳蛋白基因的具体基因产物时，使用术语“CP”。例如，RNA噬菌体Qβ的外壳蛋白基因的具体基因产物被称为“Qβ CP”，而噬菌体Qβ的“外壳蛋白”包含“Qβ CP”以及A1蛋白。噬菌体Qβ的衣壳主要由Qβ CP组成，含有少量A1蛋白。同样，VLP Qβ外壳蛋白主要含有Qβ CP，以及少量A1蛋白。
核心颗粒在此使用的术语“核心颗粒”是指具有固有重复组织的刚性结构。此处使用的核心颗粒可以是合成方法的产物或生物学方法的产物。
偶联的在此使用的术语“偶联的”是指通过共价键或通过强非共价相互作用附着，一般且优选地指通过共价键附着。本领域技术人员常用的偶联生物活性物质的任何方法都能在本发明中使用。
有效量在此使用的术语“有效量”是指足以达到希望的生物学效应的量或必需的量。组成物的有效量是获得这种选择结果的量，此量可由本领域技术人员常规确定。例如，治疗免疫系统缺陷的有效量是引起免疫系统激活、在暴露于抗原后产生抗原特异性免疫应答所必需的量。该术语也与“足量”同义。
用于任何具体用途的有效量根据如下因素而不同，如所治疗的疾病或病症、施用的具体组成物、患者体重和/或疾病或病症的严重程度。本领域普通技术人员能够根据经验确定本发明的具体组成物的有效量，而不需要过多的实验。
嗜酸细胞活化趋化因子蛋白在此使用的术语“嗜酸细胞活化趋化因子蛋白”是指由嗜酸细胞活化趋化因子基因编码的蛋白质。嗜酸细胞活化趋化因子蛋白的不同变体可能分别是由于核苷酸点突变和多态性以及一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换引起的，明确地包括于本发明范围内。进一步的变异性可能由翻译后修饰引起，如嗜酸细胞活化趋化因子的不同糖基化形式，以及嗜酸细胞活化趋化因子的蛋白水解切割形式。在此使用的术语“嗜酸细胞活化趋化因子蛋白”也包括嗜酸细胞活化趋化因子蛋白变体，包括但不限于上述优选实例。
嗜酸细胞活化趋化因子肽在此使用的术语“嗜酸细胞活化趋化因子肽”被广泛定义为作为嗜酸细胞活化趋化因子蛋白的一部分的任一种肽，其含有原始嗜酸细胞活化趋化因子蛋白的至少两个、优选地至少三个、更优选地至少四个、更优选地至少五个、更优选地至少六个连续氨基酸，代表嗜酸细胞活化趋化因子蛋白的一部分，最优选地代表含有B细胞表位的嗜酸细胞活化趋化因子的折叠部分，更优选地是含有中和表位的嗜酸细胞活化趋化因子的部分。
术语“嗜酸细胞活化趋化因子肽”优选地还包括所述嗜酸细胞活化趋化因子肽的任一部分，其中优选地可以通过在嗜酸细胞活化趋化因子蛋白的N端和/或C端删除一个或多个氨基酸产生所述部分。嗜酸细胞活化趋化因子肽能够在真核或原核表达系统中重组表达为单独的嗜酸细胞活化趋化因子肽或与其它氨基酸或蛋白质的融合体，例如，这种融合是为了利于嗜酸细胞活化趋化因子肽的折叠、表达或可溶性，或利于嗜酸细胞活化趋化因子肽的纯化。为了使嗜酸细胞活化趋化因子肽能够与VLP或衣壳的亚单位蛋白偶联，优选地可向嗜酸细胞活化趋化因子肽中添加至少一个第二附着位点。此外，嗜酸细胞活化趋化因子肽也可以用本领域周知的方法合成。在此使用的术语嗜酸细胞活化趋化因子肽优选地也包括模拟嗜酸细胞活化趋化因子三维表面结构的肽。这种嗜酸细胞活化趋化因子肽不一定来源于嗜酸细胞活化趋化因子的连续氨基酸序列，而是可由来自嗜酸细胞活化趋化因子的不连续氨基酸残基形成。这类肽甚至可以含有在相应嗜酸细胞活化趋化因子蛋白中不存在的氨基酸。
表位在此使用的术语“表位”是指在动物、优选地哺乳动物、最优选地在人中具有抗原或免疫原活性的多肽的连续或不连续部分。表位被抗体或通过MHC分子内的T细胞受体被T细胞识别。在此使用的“免疫原表位”定义为能在动物中引发抗体应答或诱发T细胞应答的多肽的一部分，这可通过本领域公知的任何方法测定。(参见，例如Geysen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 813998-4002(1983))。在此使用的术语“抗原性表位”定义为抗体能够免疫特异性结合作为其抗原的蛋白质部分，这种特异性结合可用本领域公知的任何方法测定。免疫特异性结合不包括非特异性结合，但是不一定排除与其它抗原的交叉反应性。抗原表位不一定必须是免疫原性的。抗原表位也可以是T细胞表位，此时它们能被MHC分子内的T细胞受体免疫特异性地结合。
一个表位可以包含具有该表位唯一的空间构象的3个氨基酸。一个表位通常由至少约5个这样的氨基酸组成，更常见地由至少约8-10个这样的氨基酸组成。如果表位是一种有机分子，它可以象硝基苯基一样小。
融合在此使用的术语“融合”是指通过编码核苷酸序列的框内组合，将不同来源的氨基酸序列组合于一条多肽链中。除了与多肽链的末端之一融合外，术语“融合”还明确包括内部融合，即不同来源的序列插入一条多肽链内。
免疫应答在此使用的术语“免疫应答”是指导致B和/或T淋巴细胞和/或抗原呈递细胞活化或增殖的体液免疫应答和/或细胞免疫应答。然而，在某些情况下，免疫应答可能是低强度的，只有在使用至少一种根据本发明的物质时才能检测到。“免疫原性”是指用来刺激活生物的免疫系统的一种试剂，使得免疫系统的一种或多种功能增强，并且针对该免疫原性剂。“免疫原性多肽”是引发细胞和/或体液免疫应答的多肽，无论它是单独的还是与载体相连接，使用或不使用佐剂。优选地可以激活抗原呈递细胞。
“增强”免疫应答的物质是指与不添加该物质时测定的相同免疫应答相比，添加该物质时观察到更强的或以任何方式增强的或偏离的免疫应答的物质。例如，应用51Cr释放试验，能够测定在免疫过程中使用或不使用该物质获得的样品中细胞毒性T细胞的裂解活性。与不含该物质的CTL裂解活性相比，使CTL裂解活性提高的物质的量被称为足以增强动物对该抗原的免疫应答的量。在一个优选实施方案中，免疫应答至少增强约2倍，更优选地约3倍或更高。分泌的细胞因子的数量或类型也可能改变。此外，诱导的抗体或其亚类的量也可能改变。
免疫在此使用的术语“免疫”或“免疫作用”或相关术语是指提供产生针对靶抗原或表位的基本免疫应答的能力(包括抗体和/或细胞免疫，如效应CTL)。该术语不要求产生完全免疫，而是产生大大高于基线的免疫应答。例如，如果在使用本发明的方法后哺乳动物产生针对靶抗原的细胞和/或体液免疫应答，则可认为针对该靶抗原免疫了该动物。
天然来源在此使用的术语“天然来源”是指其全部或部分都不是合成的，而是自然存在或产生的。
非天然的在此使用的该术语通常是指并非来源于自然，更具体而言，该术语是指来自人工。
非天然来源在此使用的术语“非天然来源”通常是指合成的或者并非来源于自然；更具体而言，该术语是指来自人工。
有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列在此使用的术语“有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列”通常是指抗原或抗原决定簇的重复模式，其特征在于抗原或抗原决定簇一般且优选地分别相对于核心颗粒和病毒样颗粒均匀空间排列。在本发明的一个实施方案中，这种重复模式可能是一种几何模式。合适的有序、重复抗原或抗原决定簇阵列的典型和优选实例具有严格重复的类结晶排列的抗原或抗原决定簇，优选地间隔1-30纳米，优选地5-15纳米。
菌毛在此使用的术语“菌毛”是指细菌细胞的胞外结构，它由蛋白质单体(例如菌毛蛋白单体)组成，这些单体组织成有序、重复的模式。此外，菌毛也是与多种过程有关的结构，如细菌细胞与宿主细胞表面受体的附着、细胞间基因交换和细胞-细胞识别。菌毛的实例包括1型菌毛、P-菌毛、F1C菌毛、S-菌毛和987P-菌毛。菌毛的其它实例在下文描述。
菌毛样结构在此使用的短语“菌毛样结构”是指具有类似于菌毛的特征、由蛋白质单体组成的结构。“菌毛样结构”的一个实例是表达修饰菌毛蛋白的一种细菌细胞所形成的一种结构，这种修饰菌毛蛋白形成与天然菌毛不相同的有序、重复阵列。
多肽在此使用的术语“多肽”是指由单体(氨基酸)通过酰胺键(也称为肽键)线性连接组成的分子。它是指氨基酸分子链，不是指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽和蛋白质都包含于多肽的定义内。该术语也指多肽的表达后修饰，如糖基化、乙酰化、磷酸化等。重组或衍生的多肽不一定由特定的核酸序列翻译而来。也可以用任何一种方法生产，如化学合成。
IL-5蛋白在此使用的术语“IL-5蛋白”是指由IL-5基因编码的蛋白质。IL-5蛋白的不同变体可以分别由核苷酸点突变和多态性以及一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换引起，并且明确地包括于本发明的范围内。进一步的变异性可以由翻译后修饰引起，如IL-5的不同糖基化形式，以及IL-5的蛋白水解切割形式。在此使用的术语“IL-5蛋白”也包括IL-5蛋白变体，包括但不限于上述优选实例。
IL-5肽在此使用的术语“IL-5肽”被广泛定义为代表IL-5蛋白一部分的任何肽，其含有原始IL-5蛋白的至少2个、优选地至少3个、更优选地至少4个、更优选地至少5个、更优选地至少6个连续氨基酸，代表IL-5蛋白的一部分，最优选地代表IL-5含有B细胞表位的折叠部分，更优选地代表IL-5的含有中和表位的部分。
术语“IL-5肽”优选地进一步包括所述IL5肽的任何部分，其中优选地可通过在IL-5蛋白N端和/或C端删除一个或多个氨基酸产生所述部分。IL-5肽能够在真核或原核表达系统中重组表达为单独的IL5肽或与其它氨基酸或蛋白质的融合体，例如，这种融合是为了有利于IL-5肽的折叠、表达或可溶性，或者利于IL-5肽的纯化。为了使IL-5肽能够与VLP或衣壳的亚单位蛋白偶联，优选地可以向IL-5肽中添加至少一个第二附着位点。此外，IL-5肽也可以用本领域周知的方法合成。在此使用的术语IL-5肽优选地也包括模拟IL5三维表面结构的肽。这种IL5肽不一定来源于IL5的连续氨基酸序列，也可以由IL5的不连续氨基酸残基组成。这些肽甚至可含有在相应IL5蛋白中不存在的氨基酸。
IL-13蛋白在此使用的术语“IL-13蛋白”是指由IL-13基因编码的蛋白质。IL-13蛋白的不同变体可以分别由核苷酸点突变和多态性以及一个或多个核苷酸的插入、缺失和/或置换引起，并且明确地包括于本发明的范围内。进一步的变异性能够由翻译后的修饰引起，如IL-13的不同糖基化形式，以及IL-13的蛋白水解切割形式。在此使用的术语“IL-13蛋白”也包括IL-13蛋白变体，包括但不限于上述优选实例。
IL-13肽在此使用的术语“IL-13肽”被广泛定义为代表IL-13蛋白一部分的任何肽，其含有原始IL-13蛋白的至少2个、优选地至少3个、更优选地至少4个、更优选地至少5个、更优选地至少6个连续氨基酸，代表IL-13蛋白的一部分，最优选地代表IL-13含有B细胞表位的折叠部分，更优选地代表IL-13的含有中和表位的部分。
术语“IL-13肽”优选地进一步包括所述IL-13肽的任何部分，其中优选地可通过在IL-13蛋白N端和/或C端删除一个或多个氨基酸产生所述部分。IL-13肽能够在真核或原核表达系统中重组表达为单独的IL-13肽或与其它氨基酸或蛋白质的融合体，例如，这种融合是为了有利于IL-13肽的折叠、表达或可溶性，或者利于IL-5肽的纯化。为了使IL-13肽能够与VLP或衣壳的亚单位蛋白偶联，优选地可以向IL-13肽中添加至少一个第二附着位点。此外，IL-13肽也可以用本领域周知的方法合成。在此使用的术语IL-13肽优选地也包括模拟IL-13三维表面结构的肽。这种IL-13肽不一定来源于IL-13的连续氨基酸序列，也可以由IL-13的不连续氨基酸残基组成。这些肽甚至可含有在相应IL-13蛋白中不存在的氨基酸。
残基在此使用的术语“残基”是指多肽骨架或侧链中的具体氨基酸。
自身抗原在此使用的术语“自身抗原”是指宿主DNA编码的蛋白质，宿主DNA编码的蛋白质或RNA产生的产物被定义为自身的。另外，两种或几种自身分子组合产生的蛋白质或是自身分子一部分的蛋白质以及与上述两种自身分子具有高度同源性的蛋白质(＞95％，优选地＞97％，更优选地＞99％)也可以认为是自身的。
治疗(处理)在此使用的术语“治疗(处理)”是指预防和/或治疗。例如，当用于传染病时，该术语是指提高患者对病原体感染的抗性，或者换句话说，降低患者感染病原体或表现感染所致病症的可能性的预防处理，以及患者感染后的抗感染处理，例如减轻或消除感染或阻止其恶化。当用于具有嗜酸细胞成分的变应性疾病时，术语“治疗(处理)”是指预防或治疗，尤其且优选地抑制或减少变应性嗜酸细胞性疾病相关的变应性炎症成分。
疫苗在此使用的术语“疫苗”是指包含本发明的组成物并且是能够对动物施用的形式的制剂。一般而言，疫苗包含常用的盐水或缓冲水溶液，本发明的组成物悬浮或溶解于其中。以这种形式，本发明的组成物能够方便地用于预防、改善或治疗疾病。在导入宿主后，疫苗能够引起免疫应答，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突状细胞和/或其它细胞应答的激活。
任选地，本发明的疫苗还包含一种佐剂，与本发明的化合物相比，它可能占一小部分或大部分。在此使用的术语“佐剂”是指免疫应答的非特异性刺激物，或可以在宿主中产生沉淀物，当沉淀物与本发明的疫苗组合时能够产生更强的免疫应答。有多种佐剂可以使用。实例包括完全和不完全弗氏佐剂、氢氧化铝和修饰的胞壁酰二肽。
病毒样颗粒(VLP)在此使用的术语“病毒样颗粒”是指一种类似于病毒颗粒的结构。而且，根据本发明的病毒样颗粒是非复制性和非传染性的，因为它缺乏全部或部分病毒基因组，特别是病毒基因组的复制性和传染性部分。根据本发明的病毒样颗粒可以含有与其基因组不同的核酸。根据本发明的病毒样颗粒的一个典型且优选的实施方案是病毒衣壳，如相应病毒、噬菌体或RNA-噬菌体的病毒衣壳。术语“病毒衣壳”或“衣壳”在此可以互换使用，是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体。一般且优选地，病毒蛋白质亚单位分别装配为病毒衣壳和衣壳，它们具有固有的重复组织结构，其中所述结构一般是球形或管状。例如，RNA-噬菌体或HBcAg的衣壳是二十面体对称的球形。在此使用的术语“衣壳样结构”是指由病毒蛋白质亚单位组成的大分子装配体，它在上述几方面类似于衣壳的形态，但是不同于典型的对称装配体，而保持足够的顺序和重复性。
噬菌体的病毒样颗粒在此使用的术语“噬菌体的病毒样颗粒”是指类似于噬菌体结构的病毒样颗粒，它是非复制性和非传染性的，至少缺乏编码噬菌体复制机制的基因，一般也缺乏编码负责病毒附着或进入宿主的蛋白质的基因。然而，该定义也包括这样的噬菌体病毒样颗粒，其中上述基因仍然存在但是无活性，于是也产生非复制性和非传染性的噬菌体病毒样颗粒。
RNA噬菌体外壳蛋白的VLP“RNA噬菌体外壳蛋白的VLP”指由RNA噬菌体外壳蛋白的180个亚单位自装配而成，任选地含有宿主RNA的衣壳结构。一个具体实例是Qβ外壳蛋白的VLP。在此情况下，Qβ外壳蛋白的VLP可能仅仅由Qβ CP亚单位装配而成(通过一种Qβ CP基因的表达产生，该基因例如含有一个通过抑制阻止更长A1蛋白表达的TAA终止密码子，参见Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))，或者在衣壳装配体中还含有A1蛋白亚单位。
病毒颗粒在此使用的术语“病毒颗粒”是指病毒的形态学形状。一些病毒类型含有一个由蛋白质衣壳围绕的基因组；其它的具有附加结构(例如包膜、尾等)。
一种(个)术语“一种(个)”在本公开内容中使用时，除非另外说明，是指“至少一种(个)”或“一种(个)或一种(个)以上”。
本领域技术人员应当清楚，本发明的某些实施方案涉及重组核酸技术的应用，如克隆、聚合酶链反应、DNA和RNA的纯化、重组蛋白质在原核和真核细胞中的表达等。这些方法为本领域技术人员公知，在出版的实验室方法手册中常见(例如，Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997))。应用组织培养细胞系进行的基本实验室技术(Celis，J.编著，《细胞生物学》，Academic Press，第二版，(1988))和基于抗体的技术(Harlow，E.和Lane，D.，抗体实验室手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Habor，N.Y.(1988)；Deutscher，M.P.，“蛋白质纯化指南”，Meth.Enzymol.128，Academic Press San Diego(1990)；Scopes，R.K.，《蛋白质纯化原理与实践》，第三版，Springer-Verlag，New York(1994))在文献中也有大量描述，这些文献全部在此引用作为参考。
2.增强免疫应答的组成物和方法本发明提供用于增强动物对IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的免疫应答的组成物和方法。本发明的组成物包含或者由下列成分组成(a)含有至少一个第一附着位点的核心颗粒；(b)含有至少一个第二附着位点的至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，其中所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇自然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；并且其中所述抗原或抗原决定簇与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。更具体而言，本发明的组成物包含或者由下列成分组成一种病毒样颗粒，和至少一个抗原或抗原决定簇，其中该抗原或抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与该病毒样颗粒结合，形成有序、重复的抗原-VLP阵列。而且，本发明也能够使技术人员方便地构建这种组成物，尤其用来治疗和/或预防具有嗜酸细胞成分的变应性疾病。
在一个实施方案中，核心颗粒包括病毒、细菌菌毛、细菌菌毛蛋白形成的结构、噬菌体、病毒样颗粒、病毒衣壳颗粒或其重组形式。可以选择本领域周知的具有有序、重复外壳和/或核心蛋白结构的任何病毒作为本发明的核心颗粒；合适的病毒的实例包括辛德毕斯病毒和其它甲病毒，弹状病毒(例如水泡性口炎病毒)，小RNA病毒(例如人鼻病毒、Aichi病毒)，披膜病毒(例如风疹病毒)，正粘病毒(例如索戈托病毒、贝特肯病毒、家禽流感病毒)，多瘤病毒(例如多瘤病毒BK、多瘤病毒JC、禽多瘤病毒BFDV)，细小病毒，轮状病毒，诺瓦克病毒，口蹄疫病毒，逆转录病毒，乙型肝炎病毒，烟草花叶病毒，禽兽棚病毒，和人乳头瘤病毒，以及优选地RNA噬菌体，噬菌体Qβ，噬菌体R17，噬菌体M11，噬菌体MX1，噬菌体NL95，噬菌体fr，噬菌体GA，噬菌体SP，噬菌体MS2，噬菌体f2，噬菌体PP7(例如，参见Bachman，M.F.和Zinkernagel，R.M.，Immunol.Today 17553-558(1996)中的表1)。
在另一个实施方案中，本发明利用病毒的基因改构产生有序、重复的病毒包膜蛋白与第一附着位点的融合体，其包含所选的异源蛋白质、肽、抗原决定簇或反应性氨基酸残基。在本发明的组成物的构建中可以使用本领域公知的其它基因操作；例如，希望通过基因突变限制重组病毒的复制能力。而且，由于化学或物理灭活，或者如所述的由于缺乏可复制的基因组，用于本发明的病毒不能复制。为了与第一附着位点融合而选择的病毒蛋白应当具有组织、重复的结构。在病毒表面上，这种有组织、重复的结构包括类晶体结构，其间距为5-30nm，优选地5-15nm。这类融合蛋白的产生将在病毒表面产生多个有序、重复的第一附着位点，反映原始病毒蛋白的正常结构。本领域技术人员应当理解，第一附着位点可以是任何合适的蛋白质、多肽、糖、多核苷酸、肽(氨基酸)、天然或合成聚合物、次级代谢物或其组合，或者是它们的一部分，它们可以用来特异性地附着抗原或抗原决定簇，产生有序、重复的抗原阵列。
在本发明的另一个实施方案中，核心颗粒是一种重组甲病毒，更具体而言，是一种重组辛德毕斯病毒。甲病毒是正链RNA病毒，它们在感染的细胞的细胞质中完整复制其基因组RNA，而不需要DNA中间物(Strauss，J.和Strauss，E.，Microbiol.Rev.58491-562(1994))。甲病毒科的几个成员，辛德毕斯病毒(Xiong，C.等人，Science 2431188-1191(1989)；Schlesinger，S.，TrendsBiotechnol.1118-22(1993))、西门利启森林病毒(SFV)(Liljestr_m，P.& Garoff，H.，Bio/Technology 91356-1361(1991))及其它病毒(Davis，N.L.等人，Virology 171189-204(1989))，在作为多种不同蛋白质的基于病毒的表达载体(Lundstrom，K.，Curr.Opin.Biotechnol.8578-582(1997)；Liljestr_m，P.，Curr.Opin.Biotechnol.5495-500(1994))以及作为疫苗研制的候选物方面已经受到极大关注。最近，公布了涉及甲病毒在异源蛋白质表达和疫苗研制中的用途的一些专利(参见美国专利号5,766,602；5,792,462；5,739,026；5,789,245；5,814,482)。本发明的甲病毒核心颗粒的构建可以利用重组DNA技术领域周知的方法进行，如上述文章所述，在此引用作为参考。
可以利用多种不同的重组宿主细胞生产用于抗原或抗原决定簇附着的基于病毒的核心颗粒。例如，已知甲病毒具有广泛的宿主谱；辛德毕斯病毒感染培养的哺乳动物、爬行动物和两栖动物细胞，以及某些昆虫细胞(Clark，H.，J.Natl.Cancer Inst.51645(1973)；Leake，C.，J.Gen.Virol.35335(1977)；Stollar，V.《披膜病毒》R.W.Schlesinger编著，Academic Press，(1980)，pp.583-621)。因此，有大量重组宿主细胞能够在本发明的实施中使用。BHK、COS、Vero、HeLa和CHO细胞特别适于异源蛋白质的生产，因为它们能够以类似于人细胞的方式糖基化异源蛋白质(Watson，E.等人，Glycobiology 4227(1994))并且能够被筛选(Zang，M.等人，Bio/Technology 13389(1995))或基因改构(Renner W.等人，Biotech.Bioeng，4476(1995)；Lee K.等人，Biotech.Bioeng.50336(1996))，在无血清培养基以及悬液中生长。
向宿主细胞中引入多核苷酸载体可以用标准实验室手册所述的方法实现(参见，例如Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Habor，N.Y.(1989)，第9章；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)，第16章)，包括如电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、转染、显微注射、阳离子脂质介导的转染、转导、scrape loading、轰击导入和感染等方法。向宿主细胞内导入外源DNA序列的方法在Felgner，P.等人，美国专利号5,580,859中有描述。
包装的RNA序列也可以用来感染宿主细胞。这些包装的RNA序列可以通过添加到培养基中而导入宿主细胞内。例如，在大量资料中描述了非传染性甲病毒颗粒的制备，包括“辛德毕斯表达系统”，C版(Invitrogen目录号K750-1)。
当利用哺乳动物细胞作为重组宿主细胞生产基于病毒的核心颗粒时，这些细胞通常在组织培养基中培养。在培养基中培养细胞的方法在本领域中众所周知(参见，例如Celis，J.编著，《细胞生物学》，Academic Press，第二版，(1998)；Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ausubel，F.等人编著，《现代分子生物学方法》，John H.Wiley & Sons，Inc.(1997)；Freshney，R.，《动物细胞培养》，Alan R.Liss，Inc.(1993))。
在本发明中适于作为核心颗粒的RNA病毒的其它例子包括但不限于呼肠孤病毒科的成员，包括正呼肠孤病毒属(哺乳动物和禽逆转录病毒的多个血清型)，环状病毒属(蓝舌病毒、Eugenangee病毒、克米罗沃病毒、非洲马疫病毒和科罗拉多蜱热病毒)，轮状病毒属(人轮状病毒、内布拉斯加牛腹泻病毒、鼠轮状病毒、猿轮状病毒、牛或绵羊轮状病毒、禽轮状病毒)；小RNA病毒科，包括肠道病毒属(脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒A和B，人肠道孤(ECHO)病毒，甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒，猿肠道病毒，鼠脑脊髓炎(ME)病毒，脊髓灰质炎病毒，牛肠道病毒，猪肠道病毒，心肌病毒属(脑心肌炎病毒(EMC)，门戈病毒)，鼻病毒属(人鼻病毒，包括至少113个亚型；其它鼻病毒)，鹅口疮病毒属(口蹄疫病毒(FMDV))；杯状病毒科，包括猪水泡疹病毒、圣米格尔海狮病毒、猫小RNA病毒和诺瓦克病毒；披膜病毒科，包括甲病毒属(东方马脑炎病毒，塞姆利基森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)，黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎病毒，远东蜱传脑炎病毒，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，乙型流感(多个人亚型)，丙型流感(可能分离的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒，辛德毕斯病毒，屈曲病毒，阿尼昂尼昂病毒，罗斯河病毒，委内瑞拉马脑炎病毒，西方马脑炎病毒)；黄病毒属(蚊传黄热病毒，登革热病毒，日本脑炎病毒，圣路易脑炎病毒，摩莱河谷脑炎病毒，西尼罗河病毒，库宁病毒，中欧蜱传脑炎，远东蜱传脑炎，科萨努尔森林病毒，跳跃病病毒，波沃森病毒，鄂木斯克出血热病毒)，风疹病毒属(风疹病毒)，瘟病毒属(粘膜病病毒，猪霍乱病毒，边界病病毒)；布亚病毒科，包括布亚病毒属(布尼亚维拉病毒及相关病毒，加利福尼亚脑炎病毒)，静脉病毒属(白蛉热西西里岛病毒，裂谷热病毒)，内罗病毒属(克里米亚-刚果出血热病毒，内罗毕羊疾病病毒)，乌库病毒属(Uukuniemi病毒及相关病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒属(甲型流感病毒，多种个人亚型)，猪流感病毒，禽及马流感病毒，乙型流感(多种个人亚型)，丙型流感(可能分离的属)；副粘病毒科，包括副粘病毒属(1型副流感病毒，仙台病毒，血细胞吸附病毒，2-5型副流感病毒，新城疫病毒，腮腺炎病毒)，麻疹病毒属(麻疹病毒，亚急性硬化性全脑炎病毒，瘟热病毒，牛瘟病毒)，肺病毒属(呼吸道合胞体病毒(RSV)，牛呼吸道合胞体病毒和小鼠肺炎病毒)；弹状病毒科，包括水泡性病毒属(VSV)，钱迪普拉病毒，佛朗德-哈特公园病毒，狂犬病病毒属(狂犬病病毒)，鱼弹状病毒，丝状病毒(马堡病毒和埃博拉病毒)；砂粒样病毒科，包括淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒复合物，拉萨病毒；冠状病毒科，包括传染性支气管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人肠道冠状病毒，猫传染性腹膜炎病毒(猫冠状病毒)。
可以用作核心颗粒的DNA病毒的例子包括但不限于痘病毒科，包括正痘病毒属(重型天花病毒、轻型天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、水牛痘病毒、兔痘病毒、小鼠脱脚病病毒)，野兔痘病毒属(粘液瘤病毒，纤维瘤病毒)，禽痘病毒属(鸡痘病毒，其它禽痘病毒)，羊痘病毒属(绵羊痘病毒，山羊痘病毒)，猪痘病毒属(猪痘病毒)，副痘病毒属(触染性脓疮性皮炎病毒，假牛痘病毒，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲猪瘟病毒，蛙病毒2和3，鱼淋巴囊肿病毒)；疱疹病毒科，包括α-疱疹病毒(1型和2型单纯疱疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，马流产病毒，马疱疹病毒2和3，假狂犬病病毒，传染性牛角膜结膜炎病毒，传染性牛鼻气管炎病毒，猫鼻气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒)和β-疱疹病毒(人巨细胞病毒和猪、猴、啮齿动物巨细胞病毒)；γ-疱疹病毒(EB病毒(EBV)，马雷克病病毒，松鼠猴疱疹病毒，蛛猴疱疹病毒，兔疱疹病毒，豚鼠疱疹病毒，勒克肿瘤病毒)；腺病毒科，包括乳腺病毒属(人A、B、C、D、E亚群和未分群的；猿腺病毒(至少23个血清型)，传染性犬肝炎，牛、猪、绵羊、蛙和其它许多种的腺病毒，禽腺病毒属(禽腺病毒)；不可培养的腺病毒；乳头多瘤空泡病毒科，包括乳头瘤病毒属(人乳头状瘤病毒，牛乳头瘤病毒，兔乳头瘤病毒，其它种的多种致病性乳头瘤病毒)，多瘤病毒属(多瘤病毒，猿空泡剂(SV-40)，兔空泡剂(RKV)，K病毒，BK病毒，JC病毒，以及其它灵长类动物多瘤病毒，如亲淋巴乳头瘤病毒)；细小病毒科，包括腺伴随病毒属，细小病毒属(猫全血细胞减少症病毒，牛细小病毒，犬细小病毒，阿留申水貂病病毒等)。最后，DNA病毒可包括如慢性传染性神经性病原体(CHINA病毒)的病毒。
在其它实施方案中，细菌菌毛蛋白、细菌菌毛蛋白的亚部分，或含有细菌菌毛蛋白或其亚部分的融合蛋白，可以用来分别制备本发明的组成物和疫苗组合物。菌毛蛋白的实例包括下列细菌产生的菌毛蛋白大肠杆菌、流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)。适用于本发明的菌毛蛋白的氨基酸序列包括GenBank报告AJ000636(SEQ ID NO1)、AJ132364(SEQ ID NO2)、AF229646(SEQ ID NO3)、AF051814(SEQ ID NO4)、AF051815(SEQ ID NO5)和X00981(SEQ ID NO6)所述的序列，其完整内容在此引用作为参考。
细菌菌毛蛋白在输入细菌周质之前，通常被加工，除去N端前导序列。此外，本领域技术人员应当认识到，分别用来制备本发明的组成物和疫苗组合物的细菌菌毛蛋白通常不含自然存在的前导序列。
适用于本发明的菌毛蛋白的一个具体实例是大肠杆菌的P-菌毛蛋白(GenBank报告AF237482(SEQ ID NO7))。适用于本发明的大肠杆菌1型菌毛蛋白的一个实例是含有GenBank报告P04128所述氨基酸序列(SEQ ID NO8)的菌毛蛋白，它由具有GenBank报告M27603所示核苷酸序列(SEQ ID NO9)的核酸编码。这些GenBank报告的完整公开内容在此引用作为参考。另外通常也用上述蛋白质的成熟形式分别制备本发明的组成物和疫苗组合物。
适于在本发明的实施中使用的细菌菌毛蛋白或菌毛蛋白亚部分通常能够连接形成有序、重复的抗原阵列。
在体外制备菌毛和菌毛样结构的方法在本领域周知。例如，Bullitt等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9312890-12895(1996)描述了大肠杆菌P-菌毛亚单位的体外重建。此外，Eshdat等人(J.Bacteriol.148308-314(1981))也描述了适于裂解大肠杆菌1型菌毛和菌毛重建的方法。简而言之，这些方法如下在饱和盐酸胍中37℃温育裂解菌毛。然后通过层析纯化菌毛蛋白，之后用5mM三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(pH 8.0)透析，形成菌毛蛋白二聚体。Eshdat等人还发现，在用含有5mM MgCl2的5mM三(羟甲基)氨基甲烷(pH 8.0)透析后，菌毛蛋白二聚体重装配形成菌毛。
另外，例如使用常规基因工程和蛋白质修饰方法，可以修饰菌毛蛋白，使之含有第一附着位点，抗原或抗原决定簇通过第二附着位点与之连接。此外，抗原或抗原决定簇也可以通过第二附着位点与这些蛋白质中自然存在的氨基酸残基直接连接。这些修饰的菌毛蛋白然后可以在本发明的疫苗组合物中使用。
分别用来制备本发明的组成物和疫苗组合物的细菌菌毛蛋白可以用类似于此处所述对HBcAg修饰的方法进行修饰。例如，可以将半胱氨酸和赖氨酸残基删除或置换为其它氨基酸残基，并且可以向这些蛋白质中添加第一附着位点。此外，菌毛蛋白也可以表达为修饰形式，或者可以在表达后化学修饰。类似地，也可以从细菌中收获完整的菌毛，然后化学修饰。
在另一个实施方案中，从细菌(例如大肠杆菌)中收获菌毛或菌毛样结构，用来形成本发明的组成物和疫苗组合物。适于制备组成物和疫苗组合物的一个实例是大肠杆菌1型菌毛，它由具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的菌毛蛋白单体构成。
本领域周知一些收获细菌菌毛的方法。例如，Bullitt和Makowski(Biophys.J.74623-632(1998))描述了一种从大肠杆菌中收获P-菌毛的菌毛纯化方法。根据该方法，从含有P-菌毛质粒的多菌毛大肠杆菌上剪切菌毛，通过溶解和MgCl2(1.0M)沉淀的循环纯化。
收获后，菌毛或菌毛样结构可用多种方式修饰。例如，可以向菌毛中添加第一附着位点，抗原或抗原决定簇可通过第二附着位点与之附着。换句话说，可以收获并修饰细菌菌毛或菌毛样结构，产生有序、重复的抗原阵列。
抗原或抗原决定簇能够与菌毛或菌毛样结构中所含的自然存在的半胱氨酸残基或赖氨酸残基连接。在这些情况下，自然存在的氨基酸残基的高度有序和重复性将引导抗原或抗原决定簇与菌毛或菌毛样结构偶联。例如，使用异双功能交联剂，菌毛或菌毛样结构能够与抗原或抗原决定簇的第二附着位点连接。
当利用生物自然合成的结构(例如菌毛)制备本发明的组成物和疫苗组合物时，遗传改造这些生物使它们产生具有所需要特征的结构通常是有利的。例如，当使用大肠杆菌1型菌毛时，可以修饰从中收获菌毛的大肠杆菌，使之产生具有特定特征的结构。可能的菌毛蛋白修饰的实例包括一个或多个赖氨酸残基的插入、一个或多个自然存在的赖氨酸残基的缺失或置换、一个或多个自然存在的半胱氨酸残基的缺失或置换(例如SEQ ID NO8位点44和84处的半胱氨酸残基)。
另外也可以对菌毛蛋白基因进行其它修饰，产生含有非赖氨酸残基的第一附着位点的表达产物(例如FOS或JUN域)。当然，合适的第一附着位点通常仅限于不妨碍菌毛蛋白形成适于在本发明的疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构的附着位点。
细菌细胞中自然存在的菌毛蛋白基因可以在体内修饰(例如通过同源重组)，或者具有特定特征的菌毛蛋白基因可以被插入到这些细胞内。例如，可以将菌毛蛋白基因导入细菌细胞中，作为复制型克隆载体或插入细菌染色体内的载体的一种组分。插入的菌毛蛋白基因也可以与表达调控序列(例如lac操纵子)连接。
在大多数情况下，分别在本发明的组成物和疫苗组合物中使用的菌毛或菌毛样结构由单一类型的菌毛蛋白亚单位构成。通常使用由相同亚单位组成的菌毛或菌毛样结构，因为它们预期能够形成表现为高度有序、重复抗原阵列的结构。
然而，本发明也包括这样的组成物和疫苗，其包含由不同的菌毛蛋白亚单位构成的菌毛或菌毛样结构。形成这些菌毛或菌毛样结构的菌毛蛋白亚单位可以由细菌细胞中自然存在的基因表达，或者由导入细胞内的基因表达。当自然存在的菌毛蛋白基因和导入的基因都在形成菌毛或菌毛样结构的细胞中表达时，结果通常是由这些菌毛蛋白的混合物构成菌毛或菌毛样结构。此外，当两种或多种菌毛蛋白基因在细菌细胞中表达时，每种菌毛蛋白基因的相对表达通常是决定菌毛或菌毛样结构中不同菌毛蛋白亚单位比例的因素。
当希望获得具有特定混合菌毛蛋白亚单位组成的菌毛或菌毛样结构时，至少一种菌毛蛋白基因的表达可以由一种异源诱导型启动子调节。这些启动子以及其它基因元件可以用来调节细菌细胞中产生的不同菌毛蛋白亚单位的相对含量，因而，调节菌毛或菌毛样结构的组成。
另外，抗原或抗原决定簇也能通过非肽键的键与细菌菌毛或菌毛样结构连接，产生在本发明的组成物中使用的菌毛或菌毛样结构的细菌细胞能够被遗传改造，产生与抗原或抗原决定簇融合的菌毛蛋白。形成菌毛或菌毛样结构的这些融合蛋白适于在本发明的疫苗组合物中使用。
本申请中的病毒样颗粒是指类似于病毒颗粒但是不致病的结构。病毒样颗粒通常缺乏病毒基因组，因此是非传染性的。病毒样颗粒也能通过异源表达大量生产，并且易于纯化。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒是一种重组病毒样颗粒。熟练技术人员能够利用重组DNA技术和公众易于获得的病毒编码序列生产VLP。例如，为了在杆状病毒表达载体中在病毒启动子的调控下利用可购得的杆状病毒载体表达，可以改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列，对序列进行适当修饰，使编码序列与调节序列功能性连接。例如，为了在细菌表达载体中表达，也可以改造病毒包膜或核心蛋白的编码序列。
VLP的实例包括但不限于乙型肝炎病毒(Ulrich等人，Virus Res.50141-182(1998))、麻疹病毒(Warnes等人，Gene 160173-178(1995))、辛德毕斯病毒、轮状病毒(美国专利号5,071,651和5,374,426)、口蹄疫病毒(Twomey等人，Vaccine 131603-1610(1995))、诺瓦克病毒(Jiang，X.等人，Science 2501580-1583(1990)；Matsui，S.M.等人，J.Clin.Invest.871456-1461(1991))的衣壳蛋白，逆转录病毒GAG蛋白(WO 96/30523)，逆转录转座子Ty蛋白p1，乙型肝炎病毒表面蛋白(WO 92/11291)、人乳头瘤病毒(WO98/15631)、RNA噬菌体、Ty、fr-噬菌体、GA-噬菌体和Qβ-噬菌体。
本领域技术人员应当理解，本发明的VLP不限于任何具体形式。此颗粒可以被化学合成或通过生物学方法生产，可以是天然的或是非天然的。例如，这类实施方案包括病毒样颗粒或其重组形式。
在一个更具体的实施方案中，VLP可包含或基本由或由选自下组的重组多肽或其片段组成重组轮状病毒多肽，重组诺瓦克病毒多肽，重组甲病毒多肽，重组口蹄疫病毒多肽，重组麻疹病毒多肽，重组辛德毕斯病毒多肽，重组多瘤病毒多肽，重组逆转录病毒多肽，重组乙型肝炎病毒多肽(例如HBcAg)，重组烟草花叶病毒多肽，重组禽兽棚病毒多肽，重组人乳头瘤病毒多肽，重组噬菌体多肽，重组RNA噬菌体多肽，重组Ty多肽，重组fr-噬菌体多肽，重组GA-噬菌体多肽和重组Qβ-噬菌体多肽。病毒样颗粒可以进一步包含或基本由或由这些多肽的一种或多种片段以及这些多肽的变体组成。多肽的变体与其野生型对应物在氨基酸水平上例如至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同。
在一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或者由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成。优选地，RNA-噬菌体选自a)噬菌体Qβ；b)噬菌体R17；c)噬菌体fr；d)噬菌体GA；e)噬菌体SP；f)噬菌体MS2；g)噬菌体M11；h)噬菌体MX1；i)噬菌体NL95；k)噬菌体f2；1)噬菌体PP7。
在本发明的另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA-噬菌体Qβ或RNA-噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，重组蛋白包含或基本由或由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。
因此，形成衣壳或VLP的RNA-噬菌体外壳蛋白，或者适于自装配为衣壳或VLP的噬菌体外壳蛋白的片段，是本发明的进一步优选的实施方案。例如，噬菌体Qβ外壳蛋白能够在大肠杆菌中重组表达。进而，这些蛋白质在表达后自发形成衣壳。另外，这些衣壳也能形成具有固有重复组织的结构。
能够用来制备本发明的组成物的噬菌体外壳蛋白的具体优选实例包括如下RNA噬菌体的外壳蛋白，例如噬菌体Qβ(SEQ ID NO10；PIR数据库，登录号VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登录号AAA16663指Qβ A1蛋白)，噬菌体R17(SEQ ID NO12；PIR登录号VCBPR7)，噬菌体fr(SEQ ID NO13；PIR登录号VCBPFR)，噬菌体GA(SEQ IDNO14；GenBank登录号NP-040754)，噬菌体SP(SEQ ID NO15；GenBank登录号CAA30374指SP CP，和SEQ ID NO16；涉及SP A1蛋白的登录号)，噬菌体MS2(SEQ ID NO17；PIR登录号VCBPM2)，噬菌体M11(SEQ ID NO18；GenBank登录号AAC06250)，噬菌体MX1(SEQ ID NO19；GenBank登录号AAC14699)，噬菌体NL95(SEQ ID NO20；GenBank登录号AAC14704)，噬菌体f2(SEQ ID NO21；GenBank登录号P03611)，噬菌体PP7(SEQ ID NO22)。此外，噬菌体Qβ的A1蛋白或从其C端丢失多达100、150或180个氨基酸的C端截短形式可能参与Qβ外壳蛋白的衣壳装配。为了确保衣壳形成，通常限制衣壳装配中Qβ A1蛋白相对于Qβ CP的百分比。
也发现Qβ外壳蛋自在大肠杆菌中表达时自装配为衣壳(Kozlovska TM.等人，GENE 137133-137(1993))。所获得的衣壳或病毒样颗粒显示二十面体噬菌体样衣壳结构，直径25nm，T＝3半对称。噬菌体Qβ的晶体结构已经被解析。该衣壳含有180个外壳蛋白拷贝，它们通过二硫桥键连接成共价五聚体和六聚体(Golmohammadi R.等人，Structure 4543-5554(1996))，使Qβ外壳蛋白的衣壳具有显著的稳定性。然而，由重组Qβ外壳蛋白构成的衣壳或VLP可能含有并非通过二硫键与衣壳内的其它亚单位连接或不完全连接的亚单位。因此，在重组Qβ衣壳加样到非还原SDS-PAGE之后，可见对应于单体Qβ外壳蛋白的带以及对应于Qβ外壳蛋白五聚体或六聚体的带。不完全二硫键连接的亚单位在非还原SDS-PAGE中可以表现为二聚体、三聚体乃至四聚体的条带。Qβ衣壳蛋白对有机溶剂和变性剂也显示异常的抗性。我们惊奇地发现，高达30％的DMSO和乙腈浓度和高达1M的胍盐浓度不影响衣壳的稳定性。Qβ外壳蛋白的衣壳的高稳定性是一个有利的特征，特别是对于根据本发明免疫和接种哺乳动物和人的用途来说。
在大肠杆菌中表达后，Qβ外壳蛋白的N端蛋氨酸通常被除去，这可以通过如Stoll，E.等人，J.Biol.Chem.252990-993(1977)所述的N端Edman测序来观察。本发明的范围内也包括由N端蛋氨酸未去除的Qβ外壳蛋白组成的VLP，或者含有Qβ外壳蛋白混合物的VLP，其中N端蛋氨酸已被切除或仍然存在。
也已经证明，其它RNA噬菌体外壳蛋白在细菌宿主中表达后自装配(Kastelein，RA等人，Gene 23245-254(1983)，Kozlovskaya，TM.等人，Dokl.Akad.Nauk SSSR 287452-455(1986)，Adhin，MR.等人，Virology 170238-242(1989)，Ni，CZ.等人，Protein Sci.52485-2493(1996)，Priano，C.等人，J.Mol.Biol.249283-297(1995))。Qβ噬菌体衣壳除了外壳蛋白外还含有所谓的连读蛋白A1和成熟蛋白A2。A1通过在UGA终止密码子处抑制而产生，长度为329个氨基酸。本发明中使用的噬菌体Qβ重组外壳蛋白的衣壳缺乏A2裂解蛋白，而含有来自宿主的RNA。RNA噬菌体的外壳蛋白是一种RNA结合蛋白，与复制酶基因的核糖体结合位点的茎环相互作用，作为病毒生命周期中的一种翻译抑制物。这种相互作用的序列和结构元件已知(Witherell，GW.& Uhlenbeck，OC.Biochemistry 2871-76(1989)；Lim F.等人，J.Biol.Chem.27131839-31845(1996))。已知茎环和RNA通常参与病毒装配(Golmohammadi，R.等人，Structure4543-5554(1996))。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或由RNA噬菌体的突变外壳蛋白、优选地由上述RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，通过置换除去至少一个赖氨酸残基，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，来修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白；此外，也可以通过删除至少一个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基，来修饰RNA噬菌体的突变外壳蛋白。
在另一个优选实施方案中，病毒样颗粒包含或基本由或由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含或基本由或由下列成分组成具有SEQ ID NO10的氨基酸序列的外壳蛋白，或具有SEQ ID NO10和SEQ ID NO11的氨基酸序列的外壳蛋白的混合物，或SEQ ID NO11的突变体，其中N端蛋氨酸优选切除。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含或基本由或由突变Qβ外壳蛋白组成。在另一个优选实施方案中，通过置换去除至少一个赖氨酸残基，或者通过置换添加至少一个赖氨酸残基，来修饰这些突变外壳蛋白。或者，也可以通过删除至少一个赖氨酸残基，或通过插入添加至少一个赖氨酸残基，来修饰这些突变外壳蛋白。
有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的衣壳表面。本发明也可以使用以精氨酸替换暴露的赖氨酸残基的Qβ突变体。在本发明的实施中可以使用下列Qβ外壳蛋白突变体和突变Qβ VLP“Qβ-240”(Lys13-Arg；SEQ ID NO23)，“Qβ-243”(Asn 10-Lys；SEQ ID NO24)，“Qβ-250”(Lys 2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO25)，“Qβ-251”(SEQID NO26)和“Qβ-259”(Lys 2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO27)。因此，在本发明的进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由突变Qβ外壳蛋白的重组蛋白组成，其包含具有选自下组的氨基酸序列的蛋白质a)SEQ ID NO23的氨基酸序列；b)SEQ ID NO24的氨基酸序列；c)SEQ ID NO25的氨基酸序列；d)SEQ ID NO26的氨基酸序列；和e)SEQ ID NO27的氨基酸序列。上述Qβ外壳蛋白、突变Qβ外壳蛋白VLP和衣壳的构建、表达和纯化分别在本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902中公开。具体参照上述申请的实施例18。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、或基本由、或由Qβ的重组蛋白或其片段组成，其中该重组蛋白包含、基本由或由上述Qβ突变体之一和相应A1蛋白的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。
AP205基因组由成熟化蛋白、外壳蛋白、复制酶和相关噬菌体中不存在的两个开放阅读框组成一种裂解基因和一个在成熟化基因的翻译中起作用的开放阅读框(Klovins，J.等人，J.Gen.Virol.831523-33(2002))。AP205外壳蛋白可以由质粒pAP283-58(SEQ IDNO94)表达，该质粒是pQb10的衍生物(Kozlovska，T.M.等人，Gene137133-37(1993))，含有一个AP205核糖体结合位点。此外，AP205外壳蛋白也可以克隆到pQb185内，位于载体中的核糖体结合位点的下游。这两种方法都导致蛋白质的表达和衣壳的形成，如本申请人于2002年7月16日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请所述，在此全文引用作为参考。载体pQb10和pQb185都是由pGEM载体衍生的载体，这些载体中的克隆基因的表达受trp启动子控制(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-37(1993))。质粒pAP283-58(SEQ ID NO79)包含具有下列序列的推断的AP205核糖体结合位点，它位于AP205外壳蛋白的XbaI位点下游和ATG起始密码子直接上游TctagaATTTTCTGCGCACCCATCCCGGGTGGCGCCCAAAGTGAGGAAAATCACatg。载体pQb185在XbaI位点下游和起始密码子上游包含一个SD序列(tctagaTTAACCCAACGCGTAGGAGTCAGGCCatg，SD序列以下划线标出)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段组成。
本发明的这一优选实施方案包含形成衣壳的AP205外壳蛋白。这些蛋白质重组表达或从天然来源制备。电子显微镜检查(EM)和免疫扩散证实，在细菌中产生的AP205外壳蛋白自发形成衣壳。在EM中可见，AP205外壳蛋白(SEQ ID NO80)形成的衣壳与AP205 RNA噬菌体外壳蛋白形成的衣壳的结构特征几乎无法辨别。AP205 VLP具有高度免疫原性，能够与抗原和/或抗原决定簇连接，产生展示以重复方式定向的抗原和/或抗原决定簇的疫苗构建体。针对这样展示的抗原能够产生高滴度抗体，表明结合的抗原和/或抗原决定簇能够与抗体分子相互作用，并且具有免疫原性。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段组成。
AP205 VLP的可装配突变形式，包括氨基酸5处的脯氨酸被置换为苏氨酸的AP205外壳蛋白(SEQ ID NO81)，也可以在本发明的实施中使用，形成本发明的一个进一步优选的实施方案。这些VLP、天然来源的AP205 VLP或AP205病毒颗粒可以与抗原结合，产生根据本发明的有序、重复的抗原阵列。
AP205 P5-T突变外壳蛋白可以由质粒pAP281-32(SEQ ID NO82)表达，该质粒由pQb185直接衍生，含有突变AP205外壳蛋白基因而不是Qβ外壳蛋白基因。用表达AP205外壳蛋白的载体转染大肠杆菌，以表达AP205外壳蛋白。
分别用于表达外壳蛋白和突变外壳蛋白、导致自装配为VLP的方法，在本申请人于2002年7月16日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请中有描述，在此全文引用作为参考。合适的大肠杆菌株包括但不限于大肠杆菌K802、JM 109、RR1。合适的载体和菌株及其组合的鉴定方法是通过SDS-PAGE分别检测外壳蛋白和突变外壳蛋白的表达，如下鉴定衣壳的形成和装配任选地首先通过凝胶过滤纯化衣壳，随后用免疫扩散试验(Ouchterlony试验)或电子显微镜检查(Kozlovska，T.M.等人，Gene 137133-137(1993))检测。
由载体pAP283-58和pAP281-32表达的AP205外壳蛋白，由于在大肠杆菌细胞质中加工，可能缺乏初始的蛋氨酸。AP205 VLP的切割形式、未切割形式或其混合物是本发明的进一步优选的实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或其片段和RNA-噬菌体AP205的重组突变外壳蛋白或其片段的混合物组成。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，病毒样颗粒包含、基本由或由RNA-噬菌体AP205的重组外壳蛋白或重组突变外壳蛋白的片段组成。
在本发明的实施中也可以使用能够分别装配为VLP和衣壳的重组AP205外壳蛋白片段。这些片段可以通过分别在外壳蛋白和突变外壳蛋白的内部删除或末端删除产生。不妨碍装配为VLP的外壳蛋白和突变外壳蛋白序列中的插入，或抗原序列与外壳蛋白和突变外壳蛋白序列的融合，是本发明的更进一步的实施方案，分别产生嵌合AP205外壳蛋白和颗粒。插入、缺失以及与外壳蛋白序列融合的结果，以及是否不妨碍装配为VLP，能够通过电子显微镜检查确定。
由上述AP205外壳蛋白、外壳蛋白片段和嵌合外壳蛋白形成的颗粒能够以纯化形式分离，分离方法是联合使用利用沉淀的分级分离步骤和利用例如Sepharose CL-4B、Sepharose CL-2B、Sepharose CL-6B柱及其组合凝胶过滤的纯化步骤，如本申请人于2002年7月16日提交的标题为“分子抗原阵列”的共同未决的美国临时专利申请所述，在此全文引用作为参考。分离病毒样颗粒的其它方法为本领域公知，可以用来分离噬菌体AP205的病毒样颗粒(VLP)。例如，美国专利号4,918,166描述了利用超速离心分离酵母逆转录转座子Ty的VLP，在此全文引用作为参考。
几种RNA噬菌体的晶体结构已经测定(Golmohammadi，R.等人，Structure 4543-554(1996))。利用这些信息，能够鉴定表面暴露的残基，从而能够修饰RNA-噬菌体外壳蛋白，使得通过插入或置换能够插入一个或多个反应性氨基酸残基。因此，噬菌体外壳蛋白的这些修饰形式也可以用于本发明。因此，也可以用形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体(例如噬菌体Qβ、噬菌体R17、噬菌体fr、噬菌体GA、噬菌体SP和噬菌体MS2的外壳蛋白)制备本发明的组成物。
尽管上述变体蛋白质的序列不同于其野生型，但是这些变体蛋白质通常保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。因此，本发明还分别包括进一步包含形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质变体的组成物和疫苗组合物，以及分别制备这些组成物和疫苗组合物的方法，用来制备这些组成物的各种蛋白质亚单位，和编码这些蛋白质亚单位的核酸分子。因此，本发明的范围内包括野生型蛋白质的变体形式，它们可形成衣壳或衣壳样结构，保留连接并形成衣壳或衣壳样结构的能力。
因此，本发明进一步分别包括含有如下蛋白质的组成物和疫苗组合物，该蛋白质包含或基本由或由与野生型蛋白质至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成，它们分别可形成有序的阵列，具有固有的重复结构。
本发明的范围内还包括编码用来制备本发明组成物的蛋白质的核酸分子。
在其它实施方案中，本发明进一步包括含有如下蛋白质的组成物，该蛋白质包含或基本由或由与SEQ ID NO10-27所示任何一种氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
适用于本发明的蛋白质也包括形成衣壳或衣壳样结构或VLP的蛋白质的C端截短突变体。这类截短突变体的具体实例包括具有SEQ IDNO10-27中任何一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质也包括形成衣壳或衣壳样结构的蛋白质的N端截短突变体。这类截短突变体的具体实例包括具有SEQ IDNO10-27中任何一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
适用于本发明的其它蛋白质包括形成衣壳或衣壳样结构的N端和C端截短突变体。适宜的截短突变体包括具有SEQ ID NO10-27中任何一种所示氨基酸序列的蛋白质，其中已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸，从C端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸。这些N端和C端截短突变体一般保留形成衣壳或衣壳样结构的能力。
本发明还包括含有如下蛋白质的组成物，这些蛋白质包含或基本由或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
因此，本发明包括由形成衣壳或VLP的蛋白质制备的组成物和疫苗组合物，由各种蛋白质亚单位和VLP或衣壳制备这些组成物的方法，制备这些蛋白质亚单位的方法，编码这些亚单位的核酸分子，和利用本发明的这些组成物接种和/或在个体中引发免疫应答的方法。
如上所述，本发明包括病毒样颗粒或其重组形式。在一个进一步优选的实施方案中，本发明的组成物中使用的颗粒包含乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg片段。在另一个实施方案中，本发明的组成物中使用的颗粒包含这样的乙型肝炎核心蛋白(HBcAg)或HBcAg片段，它们经过修饰除去或减少了游离半胱氨酸残基的数量。Zhou等人(J.Virol.665393-5398(1992))证实，修饰后除去自然存在的半胱氨酸残基的HBcAg保留连接并形成衣壳的能力。因此，适于在本发明的组成物中使用的VLP包括那些包含修饰的HBcAg或其片段的VLP，其中一个或多个自然存在的半胱氨酸残基已经删除或被替换为另一种氨基酸残基(例如丝氨酸残基)。
HBcAg是通过加工乙型肝炎核心抗原前体蛋白产生的蛋白质。HBcAg的大量同种型已经鉴定，本领域技术人员能够容易地获得其氨基酸序列。在大多数情况下，本发明的组成物和疫苗组合物分别用HBcAg的加工形式制备(即已经除去乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列的HBcAg)。
另外，在不发生加工的条件下生产HBcAg时，HBcAg通常表达为“加工的”形式。例如，当利用将蛋白质表达定向于细胞质的大肠杆菌表达系统生产本发明的HBcAg时，这些蛋白质通常表达为不含乙型肝炎核心抗原前体蛋白的N端前导序列。
可以用于本发明的乙型肝炎病毒样颗粒的制备在下列专利中公开，例如WO 00/32227，具体见实施例17-19和21-24，以及WO01/85208，具体见实施例17-19、21-24、31和41，和本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902。最后一个申请具体参照实施例23、24、31和51。全部三篇文献均在此引用作为参考。
本发明还包括经修饰后删除或置换了一个或多个其它半胱氨酸残基的HBcAg变体。本领域众所周知，游离半胱氨酸残基能够参与大量化学副反应。这些副反应包括二硫键交换，与例如在与其它物质联合治疗中注射或形成的化学物质或代谢物反应，或暴露于紫外线后的直接氧化以及与核苷酸的反应。于是可能产生毒性加合物，特别是考虑到HBcAg具有结合核酸的强烈倾向。毒性加合物以多种种类分布，它们单个均以低浓度存在，但在同时存在时达到毒性水平。
鉴于上述，在疫苗组合物中使用经修饰除去天然存在的半胱氨酸残基的HBcAg的一个优点是，当抗原或抗原决定簇附着时，毒性物质所能够结合的位点在数量上减少或者完全消失。
适用于实施本发明的大量天然存在的HBcAg变体已经鉴定。例如，Yuan等人(J.Virol.7310122-10128(1999))描述了在对应于SEQ IDNO28的位点97处异亮氨酸残基被置换为亮氨酸残基或苯丙氨酸残基的变体。大量HBcAg变体以及几种乙型肝炎核心抗原前体变体的氨基酸序列公开于GenBank报告AAF121240(SEQ ID NO29)、AF121239(SEQ ID NO30)、X85297(SEQ ID NO31)、X02496(SEQ ID NO32)、X85305(SEQ ID NO33)、X85303(SEQ ID NO34)、AF151735(SEQ IDNO35)、X85259(SEQ ID NO36)、X85286(SEQ ID NO37)、X85260(SEQ ID NO38)、X85317(SEQ ID NO39)、X85298(SEQ ID NO40)、AF043593(SEQ ID NO41)、M20706(SEQ ID NO42)、X85295(SEQ IDNO43)、X80925(SEQ ID NO44)、X85284(SEQ ID NO45)、X85275(SEQ ID NO46)、X72702(SEQ ID NO47)、X85291(SEQ ID NO48)、X65258(SEQ ID NO49)、X85302(SEQ ID NO50)、M32138(SEQ IDNO51)、X85293(SEQ ID NO52)、X85315(SEQ ID NO53)、U95551(SEQ ID NO54)、X85256(SEQ ID NO55)、X85316(SEQ ID NO56)、X85296(SEQ ID NO57)、AB033559(SEQ ID NO58)、X59795(SEQ IDNO59)、X85299(SEQ ID NO60)、X85307(SEQ ID NO61)、X65257(SEQ ID NO62)、X85311(SEQ ID NO63)、X85301(SEQ ID NO64)、X85314(SEQ ID NO65)、X85287(SEQ ID NO66)、X85272(SEQ IDNO67)、X85319(SEQ ID NO68)、AB010289(SEQ ID NO69)、X85285(SEQ ID NO70)、AB010289(SEQ ID NO71)、AF121242(SEQ ID NO72)、M90520(SEQ ID NO73)、P03153(SEQ ID NO74)、AF110999(SEQ IDNO75)和M95589(SEQ ID NO76)，其公开内容均在此引用作为参考。这些HBcAg变体在氨基酸序列的多个位点处不同，包括对应于位于SEQ ID NO77中位点12、13、21、22、24、29、32、33、35、38、40、42、44、45、49、51、57、58、59、64、66、67、69、74、77、80、81、87、92、93、97、98、100、103、105、106、109、113、116、121、126、130、133、135、141、147、149、157、176、178、182和183处氨基酸残基的氨基酸残基。WO 00/198333、WO 00/177158和WO 00/214478描述了适于在本发明的组成物中使用、并可根据本申请书公开内容进一步修饰的其它HBcAg变体。
如上所述，在本发明的组成物和疫苗组合物中将分别使用一般加工的HBcAg(即缺乏前导序列的)。本发明包括使用上述变异HbcAg的疫苗组合物，以及应用这些组合物的方法。
一种多肽的氨基酸序列是否具有与上述野生型氨基酸序列之一或其亚部分至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列，可以利用公知的计算机程序如Bestfit程序常规确定。当利用Bestfit或其它任何序列比对程序确定一种具体序列与参照氨基酸序列是否例如95％相同时，设置参数，使得在参照氨基酸序列的全长上计算同一性百分数，并且同源性缺口可以为参照序列中氨基酸残基总数的5％。
具有SEQ ID NO29-72和73-77所示氨基酸序列的HBcAg变体和前体彼此相对相似。因此，HBcAg变体中位于对应于SEQ ID NO77中一个具体位点处的氨基酸残基，是指SEQ ID NO77所示氨基酸序列中该位点处的氨基酸残基。在感染哺乳动物的乙型肝炎病毒之间，这些HBcAg变体之间的同源性在很大程度上足够高，因此本领域技术人员不难查阅分别如SEQ ID NO77所示的氨基酸序列以及具体HBcAg变体的氨基酸序列，并鉴定“相应的”氨基酸残基。此外，SEQ ID NO73所示的HBcAg氨基酸序列，显示来源于感染土拨鼠的病毒的HBcAg的氨基酸序列，与含有SEQ ID NO77所示氨基酸序列的HBcAg有足够的同源性，显然在SEQ ID NO64中存在3个氨基酸残基的插入，位于SEQ ID NO77的氨基酸残基155与156之间。
本发明也包括包含感染鸟类的乙型肝炎病毒的HBcAg变体的疫苗组合物，以及包含这些HBcAg变体的片段的疫苗组合物。对于这些HBcAg变体，在包含于本发明的疫苗组合物中之前，这些多肽中自然存在的1、2、3个或更多的半胱氨酸残基可以被置换为另一种氨基酸残基或者删除。
如上所述，去除游离半胱氨酸残基减少了毒性成分能够与HBcAg结合的位点数，也除去了该HBcAg或相邻HBcAg分子的赖氨酸和半胱氨酸残基能够交联的位点。因此，在本发明的另一个实施方案中，乙型肝炎病毒衣壳蛋白的一个或多个半胱氨酸残基被删除或替换为另一种氨基酸残基。
在其它实施方案中，本发明的组成物和疫苗组合物分别含有已经除去C端区(例如SEQ ID NO77的氨基酸残基145-185或150-185)的HBcAg。适于在本发明的实施中使用的其它修饰HBcAg包括C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
适于在本发明的实施中使用的HBcAg也包括N端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸的修饰HBcAg。
适于在本发明的实施中使用的HBcAg还包括N端和C端截短突变体。合适的截短突变体包括已经从N端除去1、2、5、7、9、10、12、14、15或17个氨基酸并且从C端除去1、5、10、15、20、25、30、34、35个氨基酸的HBcAg。
本发明还包括分别包含具有以下特征的HBcAg多肽的组成物和疫苗组合物，该多肽包含或基本由或由与上述截短突变体至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列组成。
在本发明的某些实施方案中，向HBcAg多肽内引入一个赖氨酸残基，以介导IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与HBcAg的VLP的结合。在优选实施方案中，用一种具有以下特征的HBcAg制备本发明的组成物，该HBcAg包含或由SEQ ID NO77的氨基酸1-144或1-149、1-185组成，它经过修饰，使得对应于位点79和80的氨基酸被替换为氨基酸序列为Gly-Gly-Lys-Gly-Gly的肽(SEQ IDNO78)。在进一步优选的实施方案中，SEQ ID NO77位点48和107处的半胱氨酸残基突变为丝氨酸。本发明进一步包括含有具有以下特征的相应多肽的组成物，该多肽具有SEQ ID NO29-74中任何一种所示的氨基酸序列，也含有上述氨基酸改变。在本发明的范围内进一步包括能够连接形成衣壳或VLP并且含有上述氨基酸改变的其它HBcAg变体。因此，本发明进一步包括分别含有具有以下特征的HBcAg多肽的组成物和疫苗组合物，该多肽包含或由与任何一种野生型氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、97％或99％相同的氨基酸序列、以及必要时加工除去N端前导序列并通过上述改变修饰的这些蛋白质的形式组成。
本发明的组成物或疫苗组合物可包含不同HBcAg的混合物。因此，这些疫苗组合物可由氨基酸序列不同的HBcAg组成。例如，可以制备包含“野生型”HBcAg和一个或多个氨基酸残基已经改变(例如缺失、插入或置换)的修饰HBcAg的疫苗组合物。另外，本发明的优选疫苗组合物是表现为高度有序、重复的抗原阵列的组成物，其中抗原是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。在本发明的一个进一步优选的实施方案中，至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽通过至少一个共价键分别与所述核心颗粒和病毒样颗粒结合。优选地，至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽通过至少一个共价键分别与所述核心颗粒和病毒样颗粒结合，所述共价键是一种非肽键，分别产生核心颗粒-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的有序、重复阵列和IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽-VLP阵列或偶联物。这种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽-VLP阵列和偶联物一般且优选地分别具有重复、有序的结构，因为至少一个、通常一个以上的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽以定向方式与VLP结合。优选地，10、20、40、80、120个以上的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与VLP或VLP亚单位结合。如在下文中容易理解的，所述至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与VLP的定向、明确的结合和附着，分别确保了重复、有序的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽阵列和偶联物的形成。此外，VLP的典型、固有的高度重复、组织的结构有助于IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽以高度有序、重复的方式展示，分别产生高度组织、重复的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽阵列和偶联物。
因此，本发明优选的偶联物和阵列分别在高度组织化结构、大小和阵列表面上抗原的重复性等方面不同于现有的偶联物。而且，本发明优选的实施方案还允许颗粒和抗原在表达宿主中表达，保证抗原(即至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽)的正确折叠，和VLP的正确折叠和装配。
本发明公开了IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合的方法。如本发明的一个方面所表明的，一般且优选地使用异双功能交联剂，通过化学交联使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合。有几种异双功能交联剂在本领域公知。在优选实施方案中，异双功能交联剂含有一个能够与优选的第一附着位点(如与核心颗粒和VLP或至少一种VLP亚单位的赖氨酸残基的侧链氨基)反应的功能基团，并含有另一个能够与优选的第二附着位点(如在IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽上自然存在并通过还原可供反应的半胱氨酸残基，或构建的并也任选地通过还原可供反应的半胱氨酸残基)反应的功能基团。该方法的第一步，一般称为衍化，是核心颗粒或VLP与交联剂反应。反应产物是活化的核心颗粒或活化的VLP，也被称为活化的载体。第二步，用常用方法如凝胶过滤或透析除去未反应的交联剂。第三步，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与活化的载体反应，该步骤一般被称为偶联步骤。未反应的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽任选地可以在第四步例如通过透析除去。有几种异双功能交联剂在本领域公知。包括优选的例如可从Pierce ChemicalCompany(Rockford，IL，USA)获得的交联剂SMPH(Pierce)、Sulfo-MBS、Sulfo-EMCS、Sulfo-GMBS、Sulfo-SIAB、Sulfo-SMPB、Sulfo-SMCC、SVSB、SIA和其它交联剂，含有一个氨基反应性功能基团和一个半胱氨酸残基反应性功能基团。上述交联剂均能导致硫醚键的形成。适于在本发明实施中使用的另一类交联剂的特征在于偶联后在IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与核心颗粒或VLP之间引入一个二硫键。属于这一类的优选交联剂包括，例如SPDP和Sulfo-LC-SPDP(Pierce)。交联剂衍化核心颗粒和VLP的程度分别可以受不同实验条件影响，如每个反应物的浓度，一种试剂相对于另一种试剂的过量程度，pH，温度和离子强度。偶联程度，即每个核心颗粒和VLP亚单位上IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的数量，可通过改变上述实验条件调节，以满足疫苗的要求。IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的溶解度可能限制能够在每个亚单位上偶联的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的数量，当获得的疫苗不可溶时，减少每个亚单位上IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的数量是有利的。
IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合的一种特别有利的方法是核心颗粒和VLP表面上的赖氨酸残基分别与IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽上的半胱氨酸残基连接。因此，在本发明的一个优选实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。在某些实施方案中，为了分别与核心颗粒和VLP偶联，可能需要构建一个含有半胱氨酸残基的氨基酸接头，作为IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的第二附着位点或者作为第二附着位点的一部分。此外，也可通过插入或突变向IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽内引入半胱氨酸。此外，也可以通过化学偶联引入半胱氨酸残基或硫醇基。
氨基酸接头的选择分别取决于抗原和自身抗原的性质，即取决于IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的性质，其生化性质，如pI、电荷分布和糖基化。柔性的氨基酸接头通常是优选的。氨基酸接头的优选实施方案选自(a)CGG；(b)N-端γ-1接头；(c)N-端γ-3接头；(d)Ig铰链区；(e)N-端甘氨酸接头；(f)(G)kC(G)n，其中n＝0-12，k＝0-5；(g)N-端甘氨酸-丝氨酸接头；(h)(G)kC(G)m(S)l(GGGGS)n，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2；(i)GGC；(k)GGC-NH2；(l)C端γ-1接头；(m)C-端γ-3接头；(n)C-端甘氨酸接头；(o)(G)nC(G)k，其中n＝0-12，k＝0-5；(p)C-端甘氨酸-丝氨酸接头；(q)(G)m(S)l(GGGGS)n(G)oC(G)k，其中n＝0-3，k＝0-5，m＝0-10，l＝0-2，o＝0-8。
氨基酸接头的进一步优选的实例包括免疫球蛋白的铰链区、甘氨酸丝氨酸接头(GGGGS)n和甘氨酸接头(G)n，它们均进一步含有一个半胱氨酸残基作为第二附着位点，任选地还含有额外的甘氨酸残基。一般来说，所述氨基酸接头的优选实例是N-端γ1CGDKTHTSPP；C-端γ1DKTHTSPPCG；N-端γ3CGGPKPSTPPGSSGGAP；C-端γ3PKPSTPPGSSGGAPGGCG；N-端甘氨酸接头GCGGGG；C-端甘氨酸接头GGGGCG；C端甘氨酸-赖氨酸接头GGKKGC；N端甘氨酸-赖氨酸接头CGKKGG。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，特别是当抗原是IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽时，在肽的C端优选GGCG、GGC或GGC-NH2(“NH2”表示酰胺化)接头，在其N端优选CGG，作为氨基酸接头。甘氨酸残基通常插入大氨基酸与作为第二附着位点的半胱氨酸之间，以避免偶联反应中较大氨基酸的潜在空间位阻。
IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽上的半胱氨酸残基必须是还原状态，才能与活化的VLP上的异双功能交联剂反应，即必须有含有游离巯基的游离半胱氨酸或半胱氨酸残基。当作为结合位点的半胱氨酸残基是氧化形式时，例如，如果形成二硫桥键，则需要用例如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫桥键。
根据上述优选方法，利用异双功能交联剂使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合，可使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽以定向方式分别与核心颗粒和VLP偶联。IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合的其它方法包括使用碳二亚胺EDC和NHS分别交联IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与核心颗粒和VLP的方法。IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽也可以首先通过反应硫醇化，例如使用SATA、SATP或iminothiolane。必要时，在去保护之后，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽可以分别与核心颗粒和VLP偶联，如下所述。在分离过量的硫醇化试剂之后，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP反应，后者事先用含有半胱氨酸反应性基团的异双功能交联剂活化，因此展示至少一个或几个半胱氨酸残基反应性的功能基团，如上所述，硫醇化的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽能够与它反应。任选地，在反应混合物中含有少量的还原剂。另外一些方法使用同型双功能剂，如戊二醛、DSG、BM[PEO]4、BS3(PierceChemical Company，Rockford，IL，USA)，或含有分别对核心颗粒和VLP的胺基或羧基有反应性的功能基团的其它已知的同型双功能交联剂，使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别附着于核心颗粒和VLP。
在另一个实施方案中，通过修饰糖基化的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽上存在的碳水化合物部分、随后分别与核心颗粒和VLP反应，使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP结合。在一个实施方案中，糖基化的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与高碘酸钠在碳水化合物部分的温和氧化反应中反应，产生活化的含有一个或多个醛基功能基团的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。这样活化的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与过量的高碘酸钠分离，进一步分别与核心颗粒和VLP反应，其中核心颗粒和VLP或至少一种VLP亚单位的赖氨酸残基分别与IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽上之前已形成的醛基功能基团反应，如Hermanson，G.T.《生物偶联技术》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA所述。如上述公开文献所述，通过调节pH控制活化的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的自聚合。形成的希夫碱优选地用氰基硼氢化钠进一步还原，随后通过凝胶过滤或透析除去后者。此外，核心颗粒和VLP可以分别在核心颗粒和VLP或至少一种VLP亚单位的羧基处与EDC和二酰肼如脂肪酸二酰肼反应，产生可与活化的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽上存在的一个或多个醛基功能基团反应的酰肼部分。这样形成的腙可以用氰基硼氢化钠进一步还原。此外，活化的含有一个或多个醛基功能基团的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽也与半胱胺反应，以致在IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽中引入一个半胱氨酸基团。适于IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和VLP交联的其它交联方法和交联剂，以及进行交联反应和使用化学交联剂的指南和化学交联步骤，可参见Hermanson，G.T.《生物偶联技术》，Academic Press Inc.，San Diego，CA，USA。
VLP与IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的其它结合方法包括核心颗粒和VLP分别被生物素化，以及IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽表达为链霉亲和素融合蛋白的方法，或IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽和核心颗粒和VLP分别被生物素化的方法，如WO 00/23955所述。在这种情况下，通过调节IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与链霉亲和素的比例，首先使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与链霉亲和素或亲和素结合，使得仍有游离结合位点可以分别与下一步添加的核心颗粒和VLP结合。此外，也可以在“一锅”反应中混合所有成分。能够与核心颗粒和VLP或IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽交联的其它配体-受体对(其中受体和配体存在可溶形式可供利用)，也可以作为使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与核心颗粒或VLP结合的结合剂。此外，配体或受体也可以与IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽融合，从而介导与化学结合或融合有受体或配体的核心颗粒和VLP的结合。融合也可以通过插入或置换实现。
如前所述，在本发明的一个优选实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP，在一个更优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP。
一个或几个抗原分子，即IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，可以附着于RNA噬菌体外壳蛋白的衣壳或VLP的一个亚单位上，如果空间上允许，优选地通过RNA噬菌体VLP的暴露的赖氨酸残基附着。RNA噬菌体外壳蛋白的VLP，特别是Qβ外壳蛋白VLP的一个具体特征是每个亚单位偶联几个抗原的可能性。这能够产生密集的抗原阵列。
在本发明的一个优选实施方案中，所述至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽分别与核心颗粒和病毒样颗粒的结合和附着是通过病毒样颗粒的至少一个第一附着位点与抗原或抗原决定簇的至少一个第二附着位点之间的相互作用和连接而实现的。
Qβ外壳蛋白的VLP或衣壳在其表面展示数量确定的赖氨酸残基，具有确定的布局，有3个赖氨酸残基指向衣壳内部，并与RNA相互作用，另外4个赖氨酸残基暴露于衣壳外面。这些明确的特性有利于抗原附着于颗粒外部，而不是颗粒内部(其中赖氨酸残基与RNA相互作用)。其它RNA噬菌体外壳蛋白的VLP在其表面也有数量确定的赖氨酸残基，这些赖氨酸残基有确定的布局。
在本发明的进一步优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，并且/或者第二附着位点包含巯基或半胱氨酸残基。在本发明的一个非常优选的实施方案中，第一附着位点是赖氨酸残基，第二附着位点是半胱氨酸残基。
在本发明的一个非常优选的实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽通过其上自然存在的或构建的半胱氨酸残基与RNA噬菌体外壳蛋白的VLP、特别是Qβ外壳蛋白VLP上的赖氨酸残基结合。
来源于RNA噬菌体的VLP的另一个优点是它们在细菌中的高表达量，这允许以较低的成本生产大量的材料。
如上所述，本发明的偶联物和阵列分别在高度组织化结构、大小以及阵列表面抗原重复性等方面不同于现有的偶联物。而且，用VLP作为载体可以分别形成具有不同抗原密度的坚固的抗原阵列和偶联物。具体而言，使用RNA噬菌体的VLP，尤其是使用RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP，能够获得极高的表位密度。具有高表位密度的RNA噬菌体外壳蛋白VLP组成物的制备可以根据本申请所述实现。
如此处定义的第二附着位点可以是天然存在或非天然存在于抗原或抗原决定簇。如果抗原或抗原决定簇上没有合适的天然存在的第二附着位点，则必须为该抗原构建非天然的第二附着位点。
如上所述，有4个赖氨酸残基暴露于Qβ外壳蛋白的VLP表面。这些残基一般在与交联剂分子反应时被衍化。如果不是所有的暴露的赖氨酸残基都与抗原偶联，在衍化步骤后，与交联剂反应的赖氨酸残基中交联剂分子与ε-氨基附着。这使得一个或几个正电荷丢失，可能不利于VLP的可溶性和稳定性。如下文所述的公开的Qβ外壳蛋白突变体中，通过用精氨酸代替一些赖氨酸残基，我们防止了正电荷的过多丢失，因为精氨酸残基不与交联剂反应。而且，用精氨酸代替赖氨酸残基可产生更确定的抗原阵列，因为可以与抗原反应的位点变少了。
因此，在本申请公开的下列Qβ外壳蛋白突变体和突变QβVLP中，用精氨酸替换了暴露的赖氨酸残基Qβ-240(Lys13-Arg；SEQ IDNO23)、Qβ-250(Lys2-Arg，Lys13-Arg；SEQ ID NO25)和Qβ-259(Lys2-Arg，Lys16-Arg；SEQ ID NO27)。克隆构建体、表达蛋白质、纯化VLP，并与肽和蛋白质抗原偶联。也构建了Qβ-251(SEQ IDNO26)，在本申请中能够找到关于如何表达、纯化和偶联Qβ-251外壳蛋白VLP的指南。
在另一个实施方案中，我们公开了含有一个额外赖氨酸残基的Qβ突变外壳蛋白，它适用于获得更高密度的抗原阵列。克隆该突变Qβ外壳蛋白Qβ-243(Asn10-Lys；SEQ ID NO24)，表达该蛋白质，分离并纯化衣壳或VLP，表明额外赖氨酸残基的引入不妨碍亚单位自装配为衣壳或VLP。因此，可以用Qβ外壳蛋白突变体的VLP制备IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽和偶联物。抗原与VLP附着、特别是与RNA噬菌体外壳蛋白VLP附着的一种特别优选的方法是连接RNA噬菌体外壳蛋白VLP表面的赖氨酸残基与抗原(即IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽)上自然存在的或构建的半胱氨酸残基。为了使半胱氨酸残基能够有效地作为第二附着位点，必须有一个巯基能用来偶联。因此，半胱氨酸残基必须是还原状态，即，必须有游离半胱氨酸或含有游离巯基的半胱氨酸残基。如果作为第二附着位点的半胱氨酸残基是氧化形式，例如，如果它形成二硫桥键，则需要使用如DTT、TCEP或β-巯基乙醇还原该二硫键。对于每种抗原，必须调节还原剂的浓度和还原剂超过抗原的摩尔数。必要时需要检测滴定范围，从低至10μM或更低的浓度，到可达10-20mM或更高，并估计抗原与载体的偶联。尽管如本申请人于2002年1月18日提交的未决的美国申请号10/050,902所述，低浓度还原剂适于偶联反应，但是技术人员应当知道，较高的还原剂浓度抑制偶联反应，此时必须通过透析或凝胶过滤除去还原剂。透析或平衡缓冲液的pH通常低于7，优选地低于6。必须检测低pH缓冲液与抗原活性或稳定性的相容性。
通过选择交联剂和其它反应条件，能够调节RNA噬菌体外壳蛋白的VLP上的表位密度。例如，交联剂Sulfo-GMBS和SMPH一般能够获得高表位密度。高浓度反应物正向影响衍化，可以通过操作反应条件来控制与RNA噬菌体外壳蛋白VLP偶联、特别是与Qβ外壳蛋白VLP偶联的抗原数量。
在-设计非天然的第二附着位点之前，必须选择融合、插入或基因构建的位置。例如，第二附着位点位置的选择可基于抗原的晶体结构。抗原的这种晶体结构可以提供关于分子C端或N端的可用性(例如取决于溶剂可及性)或关于适于作为第二附着位点的残基(如半胱氨酸残基)暴露于溶剂的信息。与Fab片段一样，暴露的二硫桥键也可能是第二附着位点的来源，因为通过温和还原，它们通常能够转化为单个半胱氨酸残基。可以选择不影响IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的免疫原性的温和还原条件。如果自身抗原免疫旨在抑制自身抗原与其天然配体的相互作用，通常添加第二附着位点，使得能够产生针对与天然配体相互作用位点的抗体。于是选择第二附着位点的位置，以避免第二附着位点或含有它的任何氨基酸接头的空间位阻。在其它实施方案中，希望有针对不同于自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体应答。在这些实施方案中，可以这样选择第二附着位点，使得防止产生针对自身抗原与其天然配体的相互作用位点的抗体。
选择第二附着位点位置的其它标准包括抗原的寡聚状态、寡聚位点、辅因子的存在、以及是否存在揭示抗原结构和序列中位点的实验证据，其中抗原的修饰不妨碍自身抗原的功能，或者不妨碍产生可识别自身抗原的抗体。
在最优选的实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽包含单一的第二附着位点或单一的反应性附着位点，它们能够与分别位于核心颗粒、VLP或VLP亚单位上的第一附着位点连接。这确保了至少1个、一般1个以上、优选地超过10、20、40、80、120个抗原分别与核心颗粒和VLP明确、均匀地结合和连接。因此，抗原上含有单一第二附着位点或单一反应性附着位点确保了单一、均匀类型的结合和连接，产生高度有序、重复的阵列。例如，如果通过赖氨酸(作为第一附着位点)和半胱氨酸(作为第二附着位点)相互作用分别实现结合和连接，根据本发明该优选实施方案，确保每个抗原只有一个半胱氨酸残基能够分别与VLP和核心颗粒的第一附着位点结合和连接，而无论该半胱氨酸残基在抗原上是天然存在还是非天然存在。
在一些实施方案中，根据本发明的公开内容，在抗原上构建第二附着位点需要融合一个含有适于作为第二附着位点的氨基酸的氨基酸接头。因此，在本发明的一个优选实施方案中，氨基酸接头通过至少一个共价键与抗原或抗原决定簇结合。优选地，该氨基酸接头包含或由第二附着位点组成。在一个进一步优选的实施方案中，氨基酸接头包含一个巯基或半胱氨酸残基。在另一个优选实施方案中，该氨基酸接头是半胱氨酸。根据本发明，氨基酸接头的一些选择标准以及氨基酸接头的进一步优选实施方案在上文中已经提及。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，所述至少一个抗原或抗原决定簇，即IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，分别与核心颗粒和病毒样颗粒融合。如上所述，VLP一般由至少一种可装配为VLP的亚单位组成。因此，在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇，优选地所述至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，与病毒样颗粒的至少一个亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质融合，产生嵌合VLP-亚单位-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽融合蛋白。
IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的融合可以按如下实现插入VLP亚单位序列内，或与VLP亚单位或能够掺入VLP内的蛋白质的N端或C端融合。在下文中，当述及一种肽与VLP亚单位的融合蛋白时，包括该肽与亚单位序列任一端的融合或向亚单位序列内的内部插入。
也可以按如下实现融合向VLP亚单位变体内插入IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽序列，其中亚单位序列的一部分缺失，被称为截短突变体。截短突变体可能包括VLP亚单位序列的N端或C端部分缺失或内部部分缺失。例如，氨基酸残基79-81缺失的特定VLP HBcAg是含有内部缺失的截短突变体。IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与截短突变体VLP亚单位的N端或C端的融合也是本发明的实施方案。同样，也可以通过置换实现表位在VLP亚单位序列内的融合，例如对于特定VLP HBcAg，用一种外源表位代替氨基酸79-81。因此，如下文所述，实现融合的方法包括向VLP亚单位的序列中插入IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽序列，用IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽序列置换VLP亚单位序列的一部分，或者缺失、置换或插入的组合。
嵌合的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽亚单位通常能够自装配为VLP。展示与其亚单位融合的表位的VLP在此也被称为嵌合VLP。如上所述，病毒样颗粒包含或由至少一种VLP亚单位组成。在本发明的另一个实施方案中，病毒样颗粒包含或由嵌合VLP亚单位和非嵌合VLP亚单位(即不含融合抗原的VLP亚单位)的混合物组成，产生所谓的镶嵌颗粒。这可能有利于确保VLP的形成和装配。在这些实施方案中，嵌合VLP-亚单位的比例可以是1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、95％或更高。
可以向与VLP亚单位序列任一端融合或者VLP亚单位序列内部插入的肽或表位序列的任一端添加侧翼氨基酸残基。在待融合的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的侧翼序列中，甘氨酸和丝氨酸残基是特别优选的。甘氨酸残基提供额外的柔韧性，这可降低外源序列向VLP亚单位序列内融合时可能的去稳定作用。
在本发明的一个具体实施方案中，VLP是一种乙型肝炎核心抗原VLP。已经报道了与HBcAg N端的融合(Neyrinck，S.等人，Nature Med.51157-1163(1999))、或与所谓的主要免疫显性区(MIR)的插入融合(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，WO01/98333)，它们是本发明的优选实施方案。MIR中存在缺失的HBcAg的自然存在的变体也已经描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，在此全文引用作为参考)，与N端或C端的融合、以及与野生型HBcAg相比在对应于缺失位点的MIR位点处的插入融合，也是本发明的实施方案。与C端的融合也已经描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。本领域技术人员能够容易地找到如何利用经典分子生物学技术构建融合蛋白的指南(Sambrook，J.等人编著，《分子克隆实验室手册》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Habor，N.Y.(1989)；Ho等人，Gene 7751(1989))。编码HBcAg和HBcAg融合蛋白并且可用于表达HBcAg和HBcAg融合蛋白的载体和质粒已经描述(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)，Neyrinck，S.等人，Nature Med.51157-1163(1999))，可以在本发明的实施中使用。通过实施例(实施例6)，我们也描述了向HBcAg的MIR内插入一种表位，产生嵌合的自装配HBcAg。优化自装配效率和展示插入HBcAg MIR内的表位的一个重要因素是插入位点的选择，以及插入后从MIR内HBcAg序列上删除的氨基酸数量(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP 0 421 635；US6,231,864)，换句话说，HBcAg的哪些氨基酸将被置换为新的表位。例如，已经描述了用外源表位置换HBcAg氨基酸76-80、79-81、79-80、75-85或80-81(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001)；EP0421635；US 6,231,864)。HBcAg含有一个长精氨酸尾(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))，它不是衣壳装配所必需的，能够结合核酸(Pumpens，P.和Grens，E.，Intervirology 4498-114(2001))。包含或缺乏这一精氨酸尾的HBcAg是本发明的两个实施方案。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，VLP是RNA噬菌体的VLP。在细菌、特别是在大肠杆菌中表达后，RNA噬菌体的主要外壳蛋白自发装配为VLP。能够用来制备本发明的组成物的噬菌体外壳蛋白的具体实例包括RNA噬菌体如噬菌体Qβ(SEQ ID NO10；PIR数据库，登录号VCBPQβ指Qβ CP，和SEQ ID NO11；登录号AAA16663指Qβ A1蛋白)和噬菌体fr(SEQ ID NO4；PIR登录号VCBPFR)的外壳蛋白。
在一个更优选的实施方案中，所述至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与一种Qβ外壳蛋白融合。已经描述了融合蛋白构建体，其中表位与Qβ A1蛋白截短形式的C端融合，或插入A1蛋白内(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology，399-15(1996))。A1蛋白是通过UGA终止密码子的抑制产生的，长度为329个氨基酸，或者如果考虑N端蛋氨酸的切除，为328个氨基酸。丙氨酸(Qβ CP基因编码的第二个氨基酸)之前N端蛋氨酸的切除在大肠杆菌中常常发生，Qβ外壳蛋白CP的N端也是如此。位于UGA琥珀密码子3’的A1基因部分编码长度为195个氨基酸的CP延伸。在CP延伸的位点72与73之间插入所述至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，形成本发明另外的实施方案(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))。IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽在C端截短的Qβ A1蛋白C端的融合形成本发明的进一步优选的实施方案。例如，Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))描述了Qβ A1融合蛋白，其中表位在位点19处截短的Qβ CP延伸的C端融合。
如Kozlovska等人(Intervirology 399-15(1996))所述，展示融合表位的颗粒的装配一般需要同时存在A1蛋白-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽融合和野生型CP，才能形成镶嵌颗粒。然而，本发明的范围内也包括包含如下病毒样颗粒、特别是RNA噬菌体Qβ外壳蛋白的VLP的实施方案其仅仅由融合了至少一个IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的VLP亚单位组成。
镶嵌颗粒的产生可以用多种方法实现。Kozlovska等人，Intervirology 399-15(1996)描述了两种方法，它们均能在本发明的实施中使用。第一种方法，通过在CP与CP延伸之间含有一个UGA终止密码子的编码Qβ A1融合蛋白的质粒在具有下述特征的大肠杆菌株中表达，介导VLP上融合表位的有效展示，该大肠杆菌株携带编码克隆的UGA抑制性tRNA的质粒，使UGA密码子翻译为Trp(pISM3001质粒(Smiley B.K.等人，Gene 13433-40(1993)))。另一种方法，将CP基因终止密码子修饰为UAA，共转化表达A1蛋白-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽融合蛋白的第二种质粒。第二种质粒编码不同的抗生素抗性，其复制起点与第一种质粒相一致(Kozlovska，T.M.等人，Intervirology 399-15(1996))。第三种方法，CP和A1蛋白-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的融合蛋白以双顺反子的形式编码，与一种启动子如Trp启动子有效连接，如Kozlovska等人，Intervirology 399-15(1996)的图1所示。
在另外一个实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽插入fr CP的氨基酸2与3之间(切割的CP的编号，其中N端蛋氨酸已经切除)，从而产生IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽-fr CP融合蛋白。用于构建和表达可自装配为VLP的fr CP融合蛋白并且在本发明的实施中可以使用的载体和表达系统已有报道(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。在一个具体实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽序列插入fr CP缺失变体内氨基酸2之后，其中fr CP的残基3和4已经删除(Pushko P.等人，Prot.Eng.6883-891(1993))。
还报道了表位在RNA噬菌体MS-2外壳蛋白的N端突起β-发夹中的融合，以及随后融合表位在RNA噬菌体MS-2的自装配VLP上的呈递(WO 92/13081)，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽通过插入或置换融合到MS-2 RNA噬菌体的外壳蛋白内也属于本发明的范围。
在本发明的另一个实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与乳头瘤病毒的衣壳蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与1型牛乳头瘤病毒(BPV-1)的主要衣壳蛋白L1融合。已报道了用于构建及在杆状病毒/昆虫细胞系统中表达BPV-1融合蛋白的载体和表达系统(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。用一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽置换BLV-1 L1的氨基酸130-136，产生BPV-1 L1-IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽融合蛋白，这是本发明的一个优选实施方案。已报道了在杆状病毒载体中克隆以及在杆状病毒感染的Sf9细胞中的表达，这可以在本发明的实施中应用(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO00/23955)。展示融合的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的装配颗粒可以用多种方法纯化，如凝胶过滤或蔗糖梯度超速离心(Chackerian，B.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 962373-2378(1999)，WO 00/23955)。
在本发明的另一个实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与能够掺入Ty VLP内的Ty蛋白融合。在一个更具体的实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽与TYA基因编码的p1或衣壳蛋白融合(Roth，J.F.，Yeast 16785-795(2000))。酵母逆转录转座子Ty1、2、3、4已经从酿酒酵母中分离，而逆转录转座子Tf1已经从粟酒裂殖酵母中分离(Boeke，J.D.和Sandmeyer，S.B.，“酵母转座元件”，《酵母的分子和细胞生物学基因组动力学、蛋白质合成和能量学》，p.193，Cold Spring HarborLaboratory Press(1991))。逆转录转座子Ty1和2与植物和动物元件的copia类别有关，而Ty3属于逆转录转座子的gypsy家族，它与植物和动物逆转录病毒有关。在Ty1逆转录转座子中，p1蛋白，也被称为Gag或衣壳蛋白，长度为440个氨基酸。在VLP的成熟过程中p1在位点408处被切割，产生p2蛋白，后者是VLP的基本组分。
已报道了与p1的融合蛋白和在酵母中表达所述融合蛋白的载体(Adams，S.E.等人，Nature 32968-70(1987))。例如，通过向pMA 5620质粒的BamHI位点内插入编码IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的序列，该IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽可以与p1融合(Adams，S.E.等人，Nature 32968-70(1987))。编码外源表位的序列克隆到pMA5620载体内导致融合蛋白的表达，该融合蛋白包含Ty1-15的p1的氨基酸1-381，其C端与外源表位的N端融合。同样，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的N端融合，或向p1序列内的内部插入，或p1序列的部分置换，也属于本发明的范围。具体而言，在Ty序列内位于Ty蛋白p1的氨基酸30-31、67-68、113-114和132-133之间插入IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽(EP0677111)，形成本发明的优选实施方案。
适于IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽融合的其它VLP有，例如逆转录病毒样颗粒(WO9630523)、HIV2 Gag(Kang，Y.C.等人，Biol.Chem.380353-364(1999))、豇豆花叶病毒(Taylor，K.M.等人，Biol.Chem.380387-392(1999))、细小病毒VP2 VLP(Rueda，P.等人，Virology 26389-99(1999))、HbsAg(US 4,722,840，EP0020416B1)。
适于实施本发明的嵌合VLP的实例也包括Intervirology 391(1996)所述。预期可在本发明中使用的VLP的其它例子有HPV-1、HPV-6、HPV-11、HPV-16、HPV-18、HPV-33、HPV-45、CRPV、COPV、HIV GAG、烟草花叶病毒。也已经制备了SV40、多瘤病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、轮状病毒和诺瓦克病毒的病毒样颗粒，这些VLP的嵌合VLP也属于本发明的范围。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子变体的蛋白或肽，例如含有氨基酸置换或肽插入或多态性的变体。如前所述，包含IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子变体的蛋白或肽的组成物和疫苗组合物分别也属于本发明的范围。
IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽可以通过在原核或真核表达系统中表达IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子cDNA产生。许多实例已经在文献中描述，可能在修饰后，它们可以用来表达所需形式的任何IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。WO 900/65058以及其中提供的参考文献中也有如何生产IL-5蛋白或肽的公开内容。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽。这种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽或其片段可以用标准分子生物学技术生产，其中编码目的片段的核苷酸序列通过PCR扩增，并且克隆为与多肽尾(如GST尾、MBP尾、组氨酸尾、Flag尾、myc尾)或抗体恒定区(Fc区)融合的融合体。在IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子片段与尾之间引入一个蛋白酶切位点，纯化后用相应蛋白酶消化可以使IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽与该尾分离。另一种方法，可以用本领域技术人员周知的标准肽合成反应在体外合成IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。另一种方法，通过蛋白酶消化或化学切割全长IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白，可以生产IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽，这两种方法都是本领域技术人员周知的。
在本发明的另一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原簇还包含至少一个第二附着位点，该位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非自然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇自然存在的附着位点。本申请中给出了关于如何修饰用于结合病毒样颗粒的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的指南。优选的第二附着位点包含一个用于结合衍化VLP的半胱氨酸，以上描述和实施例12和13中给出了实例。
我们已经对IL-5的三维结构进行了模型分析，以确定允许与本发明VLP上第一附着位点偶联的所选第二附着位点(NH2端)的可接近性。优选在N端附着第二附着位点，其包含一个氨基酸接头，其中含有一个额外的半胱氨酸残基。然而，含有一个半胱氨酸作为第二附着、位点并且在IL-5构建体C端融合的氨基酸接头是本发明的进一步优选的实施方案。具有一个含半胱氨酸残基(与L融合)的N-端氨基酸接头的人IL-5构建体是本发明的极其优选的实施方案。
本领域技术人员可以应用类似的方法模拟IL-13和嗜酸细胞活化趋化因子上附着位点的可接近性，以优化与VLP上第一附着位点的偶联。
现公开了小鼠IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的构建体，也可以制备优选的人IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽片段构建体。进一步优选的构建体包含完整的人IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白，人IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽。使用优选含有与VLP结合的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的本发明组成物，针对IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽进行免疫，可以提供一种治疗或预防具有嗜酸细胞成分的变应性疾病的方法。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽包含IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白的至少一个抗原性位点。本领域技术人员知道如何分别鉴定相应的肽和氨基酸序列。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，包括不连续或连续的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽，如中和性单克隆抗体所确定的那些(Dickason，R.R.等人，J.Immunol.156(3)1030-7，1996)。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，包括据预测参与受体相互作用并对于与受体相互作用来说是关键的那些不连续或连续的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽，如来自IL-5的COO-端。
适用于本发明的其它IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽可以根据其诱发T细胞或抗体应答的固有特性经过实验确定。通常如下实现用选择的肽在适于免疫的制剂中分别免疫实验动物，用本领域技术人员周知的方法测定T细胞和B细胞，即抗体应答。如果抗原是蛋白质或肽，该区可能由连续氨基酸序列构成。或者，抗体表位也可以由不连续的氨基酸序列构成，其中在蛋白质、多肽或肽的三维折叠后，这些氨基酸以空间紧靠并形成表位的方式排列。如上所述，连续的目的肽片段可以通过免疫实验鉴定。
适用于本发明的进一步优选的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽可以用现有的或未来的单克隆或多克隆抗体鉴定，其方法是本领域技术人员周知的。
适用于本发明的其它IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子肽可以通过用IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽特异的抗体筛选噬菌体展示肽文库来鉴定，这是本领域技术人员周知的一种方法。
在本发明的一个进一步优选的实施方案中，抗原或抗原决定簇是分离的任何动物的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白，以及任何动物的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子的任何抗原性肽。本领域技术人员知道如何由这些分离的IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽制备相应的肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，抗原决定簇是白介素-13(IL-13)。IL-13是激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子，主要影响单核细胞、巨噬细胞和B细胞。人IL-13前体的氨基酸序列如SEQ IDNO230所示，加工的人IL-13的氨基酸序列如SEQ ID NO231所示。前体蛋白的前20个氨基酸对应于信号肽，在加工的蛋白质中不存在。小鼠序列也已有报道，加工的氨基酸序列如SEQ ID NO232所示(BrownK.D.等人，J.Immunol.142679-687(1989))。取决于表达宿主的不同，IL-13构建体将包含前体蛋白序列，例如在真核宿主中表达和分泌；或者由成熟蛋白组成，例如在大肠杆菌中细胞质表达。对于在大肠杆菌的周质中表达，将IL-13的信号肽替换为一种细菌信号肽。
IL-13是T辅助细胞2产生的一种细胞因子(类似于IL-4、IL-5)，最近认为它与变应性呼吸道反应(哮喘)有关。在许多肿瘤类型(例如何杰金氏淋巴瘤)中都发现有IL-13和IL-13受体的正向调节。白介素13由何杰金和里-施细胞分泌，并刺激其生长(Kapp U等人，J ExpMed.1891939-46(1999))。因此，针对IL-13的免疫提供了一种治疗上述疾病(如哮喘或何杰金氏淋巴瘤)的方法。
优选地，在本发明的组成物中，成熟IL-13序列的N端或C端融合一个含有游离半胱氨酸残基的氨基酸接头，以在该蛋白质内引入一个第二附着位点。由于根据IL-13的NMR结构IL-13成熟形式的N端易于接触，在进一步优选的实施方案中向该N端添加一个含有游离半胱氨酸的氨基酸接头(Eisenmesser，E.Z.等人，J.Mol.Biol.310231(2001))。在进一步优选的实施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工蛋白质序列的N端序列融合，或者插入该蛋白质成熟形式序列的N端，信号肽的C端。在进一步优选的实施方案中，向蛋白质C端添加一个含有游离半胱氨酸的氨基酸接头。
IL-13可以在大肠杆菌(Eisenmesser，E.Z.等人，Protein Expr.Purif.20186-95(2000))或NS-0细胞(真核细胞系)(Cannon-Carlson S.等人，Protein Expr.Purif.12239-48(1998))中表达。实施例8显示了与含有半胱氨酸残基的氨基酸接头融合的鼠IL-13构建体的克隆和在细菌中的表达及其纯化。也描述了嗜酸细胞活化趋化因子-VLP疫苗的生产和检测。人IL-13构建体可以按照实施例8所述生产，并且在融合蛋白表达且分别用因子Xa和肠激酶切割后产生人C-IL-13-F(SEQ ID NO330)和人C-IL-13-S(SEQ ID NO331)蛋白质。这样产生的蛋白质能够与VLP和菌毛偶联，形成本发明的优选实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，抗原决定簇是白介素-5(IL-5)。IL-5是对于嗜酸性粒细胞生成(eosinophilopoiesis)的谱系特异细胞因子，在与嗜酸性粒细胞数量增加相关的疾病(如哮喘)中起重要作用。人IL-5前体和加工的人IL-5的序列分别在SEQ ID NO233和SEQID NO234中列出，加工的小鼠氨基酸序列如SEQ ID NO235所示。
几项研究已经证明了IL-5的生物学功能(Coffman R.L.等人，Science 245308-10(1989)；Kopf等人，Immunity 415-24(1996))，指出了在嗜酸性粒细胞介导的疾病中抑制IL-5功能的有利作用。对IL-5作用的抑制提供了一种治疗哮喘和其它嗜酸性粒细胞相关疾病的方法。
IL-5通过二硫桥键共价连接形成二聚体。已经报道了单链(sc)构建体，其中两个IL-5单体通过一个肽接头连接。
在本发明的优选实施方案中，在IL-5加工形式的序列N端添加一个含有游离半胱氨酸的肽接头。优选地也设想在scIL-5加工形式序列的N端添加一个含有游离半胱氨酸的接头。在进一步优选的实施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工蛋白质序列的N端序列融合，或插入蛋白质成熟形式序列的N端，信号肽的C端。
在进一步优选的实施方案中，含有游离半胱氨酸的接头与IL-5序列的C端融合，或与scIL-5序列的C端融合。
已报道用于IL-5的多种表达系统，可以用于制备本发明的组成物。Proudfoot等人(Biochem J.270357-61(1990))描述了一种使用大肠杆菌的细菌表达系统。如果IL-5在大肠杆菌细胞质中表达，IL-5构建体不含信号肽。昆虫细胞也可以用来生产IL-5构建体，制备本发明的组成物(Pierrot C.等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.253756-60(1998))。同样，也能使用杆状病毒表达系统(sf9细胞；Ingley E.等人，Eur.J.Biochem.196623-9(1991)；Brown P.M.等人，Protein Expr.Purif.663-71(1995))。最后，也曾经报道了哺乳动物表达系统(CHO细胞)，它们可以用来制备本发明的这些组成物(Kodama S等人，J.Biochem.(Tokyo)110693-701(1991))。
还报道了用于小鼠IL-5的杆状病毒表达系统(Mitchell等人，Biochem.Soc.Trans.21332S(1993)；Kunimoto DY等人，Cytokine3224-30(1991))和使用CHO细胞的哺乳动物细胞表达系统(Kodama S等人，Glycobiology 2419-27(1992))。
实施例7和10描述了鼠IL-5构建体的表达、纯化、与VLP的偶联、在鼠实验哮喘模型中的免疫和检测，其中为了与VLP和菌毛偶联，IL-5序列在其N端与含有半胱氨酸残基的氨基酸接头融合。可以按照实施例7和10所述产生人构建体，产生适于偶联VLP和菌毛的人C-IL-5-E(SEQ ID NO335)、人C-IL-5-F(SEQ ID NO336)和人C-IL-5-S(SEQ ID NO337)蛋白质，形成本发明的优选实施方案。
在另一个具体实施方案中，抗原决定簇是嗜酸细胞活化趋化因子。嗜酸细胞活化趋化因子是一种趋化因子受体3特异的趋化因子，存在于嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和Th2细胞上。然而，嗜酸细胞活化趋化因子似乎具有高度的嗜酸性粒细胞特异性(Zimmerman等人，J.Immunol.1655839-46(2000))。在嗜酸细胞活化趋化因子-1敲除小鼠中，嗜酸性粒细胞迁移减少70％，但是仍能发展为嗜酸细胞增多症(Rotherberg等人，J.Exp.Med.185785-90(1997))。IL-5似乎负责嗜酸性粒细胞从骨髓向血液的迁移，而嗜酸细胞活化趋化因子负责组织中的局部迁移(Humbles等人，J.Exp.Med.186601-12(1997))。
因此，在一个优选实施方案中，本发明的组成物中，一种含有半胱氨酸作为第二附着位点的氨基酸接头优选地与嗜酸细胞活化趋化因子序列的C端融合。在其它优选实施方案中，含有游离半胱氨酸的氨基酸接头与对应于加工蛋白质序列的N端序列融合，或者插入该蛋白质成熟形式的序列的N端，信号肽的C端。将编码这些具体构建体的基因克隆到合适的表达载体中。
实施例9和11描述了鼠嗜酸细胞活化趋化因子构建体的克隆和表达，其中为了与VLP和菌毛偶联，嗜酸细胞活化趋化因子序列在其C端与含有半胱氨酸残基的氨基酸接头融合。人构建体可以根据实施例9所述产生，产生适于偶联VLP和菌毛的蛋白质，形成本发明的优选实施方案。嗜酸细胞活化趋化因子能够化学合成(Clark-Lewis等人，Biochemistry 303128-3135(1991))。也曾经报道了嗜酸细胞活化趋化因子-1在大肠杆菌细胞质中的表达(Crump等人，J.Biol.Chem.27322471-9(1998))。曾报道嗜酸细胞活化趋化因子-2在大肠杆菌中表达为包涵体，随后重折叠(Mayer等人，Biochemistry 398382-95(2000))，也报道了嗜酸细胞活化趋化因子-2在昆虫细胞中的表达(Forssmann等人，J.Exp.Med.1852171-6(1997))，这些可以用来形成本发明的具体实施方案。
相关领域技术人员应当理解，对此处所述的方法和应用进行其它适当的修饰和改变是显而易见的，可以在不背离本发明的范围或其任何实施方案的情况下进行这种修饰和改变。现在已经详细描述了本发明，通过下列实施例将能更清楚地理解本发明，这些实施例只是用于说明，而无意限制本发明。
实施例实施例1突变Qβ外壳蛋白的构建和表达，突变Qβ外壳蛋白VLP或衣壳的纯化质粒构建和突变外壳蛋白的克隆pQβ-240的构建质粒pQβ10(Kozlovska，TM等人，Gene 137133-137)作为构建pQβ-240的起始质粒。突变Lys13→Arg通过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向5′-GGTAACATCGGTCGAGATGGAAAACAAACTCTGGTCC-3′和5′-GGACCAGAGTTTGTTTTCCATCTCGACCGATGTTACC-3′。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-240的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO23)AKLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-243的构建质粒pQβ10作为构建pQβ-243的起始质粒。突变Asn10→Lys通过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向5′-GGCAAAATTAGAGACTGTTACTTTAGGTAAGATCGG-3′和5′-CCGATCTTACCTAAAGTAACAGTCTCTAATTTTGCC-3′。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-243的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO24)AKLETVTLGKIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-250的构建质粒pQβ-240作为构建pQβ-250的起始质粒。突变Lys2→Arg通过定点诱变产生。用上游引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′和下游引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′合成突变PCR片段，导入pQβ-185表达载体内单一的限制酶切位点NcoI和HindIII处。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-250的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO25)ARLETVTLGNIGRDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYpQβ-251的构建质粒pQβ10作为构建pQβ-251的起始质粒。突变Lys16→Arg通过反向PCR产生。反向引物设计为反向尾-尾方向5′-GATGGACGTCAAACTCTGGTCCTCAATCCGCGTGGGG-3′和5′-CCCCACGCGGATTGAGGACCAGAGTTTGACGTCCATC-3′。
第一次PCR的产物作为第二次PCR反应的模板，其中使用上游引物5′-AGCTCGCCCGGGGATCCTCTAG-3′和下游引物5′-CGATGCATTTCATCCTTAGTTATCAATACGCTGGGTTCAG-3′。第二次PCR的产物用XbaI和Mph1103I消化，克隆到用相同限制性内切酶酶切的pQβ10表达载体中。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-251的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。获得的由该构建体编码的氨基酸序列如SEQ.ID NO26所示。
pQβ-259的构建质粒pQβ-251作为构建pQβ-259的起始质粒。突变Lys2→Arg通过定点诱变产生。用上游引物5′-GGCCATGGCACGACTCGAGACTGTTACTTTAGG-3′和下游引物5′-GATTTAGGTGACACTATAG-3′合成突变PCR片段，导入pQβ-185表达载体中单一的限制酶切位点NcoI和HindIII处。PCR反应用PCR试剂盒试剂按照厂商方法进行(MBI Fermentas，Vilnius，Lithuania)。
使用直接标记掺入法进行测序证实了希望的突变。携带pQβ-259的大肠杆菌细胞支持14-kD蛋白质的有效合成，该蛋白质在SDS-PAGE上与从Qβ噬菌体颗粒分离的对照Qβ外壳蛋白共迁移。
获得的氨基酸序列(SEQ ID NO27)AKLETVTLGNIGKDGKQTLVLNPRGVNPTNGVASLSQAGAVPALEKRVTVSVSQPSRNRKNYKVQVKIQNPTACTANGSCDPSVTRQKYADVTFSFTQYSTDEERAFVRTELAALLASPLLIDAIDQLNPAYQβ和Qβ突变体的表达与纯化的一般方法表达用Qβ外壳蛋白表达质粒转化大肠杆菌JM109。含20μg/ml氨苄青霉素的5ml LB液体培养基中接种用Qβ外壳蛋白表达质粒转化的克隆。接种的培养物不加振摇在37℃下温育16-24小时。制备的接种物随后用含有20μg1ml氨苄青霉素的100-300ml新鲜LB培养基1∶100稀释，并且不加振摇在37℃下温育过夜。获得的二次接种物在摇瓶中用含有1％酪蛋白氨基酸和0.2％葡萄糖的M9培养基1∶50稀释，并在37℃下振摇温育过夜。
纯化纯化程序使用的溶液和缓冲液1.裂解缓冲液LB50mM Tris-HCl pH 8.0，含5mM EDTA，0.1％ tritonX100和新鲜制备的5微克/毫升的PMSF。不含溶菌酶和DNAse。
2.SAS饱和硫酸铵水溶液。
3.缓冲液NET
20mM Tris-HCl，pH 7.8，含5mM EDTA和150mM NaCl。
4.PEGNET中的40％(w/v)聚乙二醇6000破碎与裂解冷冻细胞以2ml/g细胞的浓度重悬浮于LB中。混合物以22kH超声处理5次各15秒，间隔1分钟，在冰上冷却溶液。然后用JaneckiK60转头以14000rpm离心裂解液1小时。除非另外说明，以下描述的离心步骤全都用同一转头进行。上清液贮存于4℃，而细胞碎片用LB洗涤2次。离心后合并裂解液上清液和洗涤级分。
分级分离在搅拌下，向上述合并的裂解液中逐滴加入饱和硫酸铵溶液。调节SAS的体积为总体积的1/5，获得20％的饱和度。将该溶液静置过夜，次日以14000rpm离心20分钟。沉淀用少量20％硫酸铵洗涤，再次离心。合并获得的上清液，逐滴加入SAS，获得40％的饱和度。将溶液静置过夜，次日以14000rpm离心20分钟。将获得的沉淀溶解于NET缓冲液中。
层析将溶解于NET缓冲液中的衣壳或VLP蛋白加样到SepharoseCL-4B柱上。在层析过程中洗脱出3个峰。第一个峰主要含有膜和膜片段，不予收集。衣壳含于第二个峰中，而第三个峰含有其它大肠杆菌蛋白质。
合并峰级分，将NaCl浓度调节至终浓度为0.65M。在搅拌下逐滴加入体积相当于合并峰级分一半的PEG溶液。将该溶液不加搅拌静置过夜。以14000rpm离心20分钟沉淀衣壳蛋白。然后溶解于最小体积的NET中，再次加样到Sepharose CL-4B柱上。合并峰级分，用60％饱和度(w/v)的硫酸铵沉淀。离心并溶解于NET缓冲液后，将衣壳蛋白加样到Sepharose CL-6B柱上进行层析。
透析和干燥合并以上获得的峰级分，用无菌水充分透析，冻干保存。
Qβ240的表达和纯化细胞(质粒QP-240转化的大肠杆菌JM 109)重悬浮于LB中，超声处理5次各15秒(水冰夹套)，13000rpm离心1小时。上清液贮存于4℃，直到进一步加工，而碎片用9ml LB洗涤2次，最后用9ml 0.7M尿素LB溶液洗涤。合并所有上清液，加样到Sepharose CL-4B柱上。用硫酸铵沉淀合并的峰级分并离心。重新溶解的蛋白质然后用Sepharose 2B柱、最后用Sepharose 6B柱进一步纯化。衣壳峰最后用水充分透析，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-243的表达和纯化将细胞(大肠杆菌RR1)重悬浮于LB中，如一般方法所述进行处理。用Sepharose CL-4B，最后用Sepharose CL-2B柱，通过连续两次凝胶过滤步骤纯化该蛋白质。合并峰级分，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-250的表达和纯化将细胞(pQβ-250转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中，如上所述进行处理。用Sepharose CL-4B，最后用Sepharose CL-2B柱，通过凝胶过滤纯化该蛋白质，如上所述冻干。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
Qβ-259的表达和纯化将细胞(pQβ-259转化的大肠杆菌JM109)重悬浮于LB中并超声处理。碎片用10ml LB洗涤1次，第二次用10ml 0.7M尿素LB溶液洗涤。该蛋白质用Sepharose CL-4B柱通过两次凝胶过滤层析步骤纯化。如上所述透析并冻干蛋白质。通过电子显微镜检查证实外壳蛋白装配为衣壳。
实施例2含有赖氨酸残基的肽向HBcAg(1-149)c/e1表位内的插入HBcAg的c/e1表位(残基72-88)位于乙型肝炎病毒衣壳(HBcAg)表面的尖端区中。通过基因工程方法用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly置换该区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)(HBcAg-Lys构建体)。引入的赖氨酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，能够用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。
含有SEQ ID NO78所示氨基酸序列的HBcAg-Lys DNA通过PCR产生分别PCR扩增编码HBcAg片段(氨基酸残基1-78和81-149)的两个片段。这些PCR使用的引物中也引入编码Gly-Gly-Lys-Gly-Gly肽的DNA序列。HBcAg(1-78)片段用引物EcoRIHBcAg(s)和Lys-HBcAg(as)从pEco63扩增。HBcAg(81-149)片段用引物Lys-HBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)从pEco63扩增。引物Lys-HBcAg(as)和Lys-HBcAg(s)在两种PCR产物的末端引入互补DNA序列，使得两种PCR产物在随后的装配PCR中融合。装配的片段用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)PCR扩增。
对于PCR，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mM dNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol每种oligo和50ng模板DNA。对于这两个反应，温度循环如下进行94℃ 2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)30个循环。
引物序列EcoRIHBcAg(s)(5’-CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG-3’)
Lys-HBcAg(as)(5’-CCTAGAGCCACCTTTGCCACCATCTTCTAAATTAGTACCCACCCAGGTAGC-3’)Lys-HBcAg(s)(5’-GAAGATGGTGGCAAAGGTGGCTCTAGGGACCTAGTAGTCAGTTATGTC-3’)HBcAg(1-149)Hind(as)(5’-CGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAG-3’)为了PCR融合这两个PCR片段，在含有2单位Pwo聚合酶、0.1mMdNTPs和2mM MgSO4的50ml反应混合物中使用100pmol引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg(1-149)Hind(as)，以及100ng两种纯化的PCR片段。PCR循环条件为94℃2分钟；94℃(1分钟)，50℃(1分钟)，72℃(2分钟)30个循环。装配的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳分析，纯化，在适当缓冲液中用限制性内切酶EcoRI和HindIII消化19小时。消化的DNA片段连接于EcoRI/HindIII-消化的pKK载体中，产生pKK-HBcAg-Lys表达载体。通过EcoRI/HindIII限制酶切分析和插入片段的DNA测序对PCR产物向载体内的插入进行分析。
实施例3HBcAg-Lys的表达与纯化用pKK-HBcAg-Lys转化大肠杆菌K802或JM109株。用1ml细菌过夜培养物接种100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基。培养液在37℃下培养4小时，直到600nm的OD值大约达到0.8。添加IPTG至终浓度为1mM诱导HBcAg-Lys的合成。诱导后，细菌在37℃下再振摇4小时。以5000×g离心15分钟收集细菌。将沉淀冻存于-80℃。融解沉淀，重悬浮于添加了200μg/ml溶菌酶和10μl Benzonase(Merck)的细菌裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，pH 7.0，30mM NaCl，0.25％Tween-20，10mM EDTA)中。细胞在室温下温育30分钟，通过超声处理破碎。在IPTG诱导HBcAg-Lys表达中使用携带pKK-HBcAg-Lys表达质粒或对照质粒的大肠杆菌细胞。在加入IPTG之前，从携带pKK-HBcAg-Lys质粒的细菌培养液和携带对照质粒的培养液中采集样品。加入IPTG4小时后，再次从含有pKK-HBcAg-Lys的培养液和对照培养液中采集样品。通过SDS-PAGE，随后考马斯蓝染色，监测蛋白质的表达。
然后以12,000×g离心裂解液30分钟，除去不可溶的细胞碎片使用抗HBcAg单克隆抗体(YVS1841，购自Accurate Chemical andScientific Corp.，Westbury，NY，USA)，通过Western blotting分析上清液和沉淀，表明大量HBcAg-Lys蛋白是可溶的。简而言之，以14,000×g离心来自表达HBcAg-Lys的大肠杆菌细胞和来自对照细胞的裂解液30分钟。分离上清液(＝可溶级分)和沉淀(＝不可溶级分)，用SDS样品缓冲液稀释至相同体积。通过SDS-PAGE，随后用抗-HBcAg单克隆抗体YVS 1841进行Western blotting分析样品。
对澄清的细胞裂解液进行分级梯度离心，其中使用的蔗糖分级梯度由4ml 65％蔗糖溶液、覆盖于其上的3ml 15％蔗糖溶液以及随后的4ml细菌裂解液组成。样品在4℃下以100,000×g离心3小时。离心后，从梯度顶部采集1ml级分，通过SDS-PAGE，随后通过考马斯蓝染色分析。HBcAg-Lys蛋白通过考马斯蓝染色检测。
HBcAg-Lys蛋白在15％与65％蔗糖之间的界面处富集，表明其已经形成衣壳颗粒。大多数细菌蛋白质仍存在于该梯度的不含蔗糖的上层中，因此HBcAg-Lys颗粒的分级梯度离心导致颗粒的富集和部分纯化。
HBcAg-Lys的大规模表达和纯化如下进行。制备过夜培养物，方法是将单菌落接种到100ml LB(含100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。次日用800ml LB氨苄青霉素培养基稀释25ml预培养液，培养物生长到光密度OD600为0.6-0.8。然后用1mM IPTG诱导培养物，再培养4小时。收集细胞，基本如上所述进行裂解。
然后纯化HBcAg-Lys，方法是首先用硫酸铵(30％饱和)从澄清的细胞裂解液中沉淀蛋白质，然后将重新溶解的沉淀加样到凝胶过滤柱(Sephacryl S-400，Pharmacia)上。合并的级分再次用硫酸铵沉淀，重新溶解沉淀，再次加样到同一凝胶过滤柱上。最后合并级分并浓缩，用Bradford试验(BioRad)测定其浓度。
实施例4不含游离半胱氨酸残基、含有插入的赖氨酸残基的HBcAg的构建用下列方法构建一种肝炎核心抗原(HBcAg)，在此称为HBcAg-lys-2cys-Mut，它在对应于SEQ ID NO77中48和107的位点处不含半胱氨酸残基，而含有一个插入的赖氨酸残基。
按如下引入所述两个突变，首先应用下列PCR引物组合分别扩增如实施例2所述制备的HBcAg-Lys基因的3个片段。用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAg-lys-2cys-Mut基因。
简而言之，用下列引物制备片段1引物1EcoRIHBcAg(s)CCGGAATTCATGGACATTGACCCTTATAAAG引物248asGTGCAGTATGGTGAGGTGAGGAATGCTCAGGAGACTC用下列引物制备片段2引物348sGSGTCTCCTGAGCATTCCTCACCTCACCATACTGCAC引物4107asCTTCCAAAAGTGAGGGAAGAAATGTGAAACCAC用下列引物制备片段3引物5HBcAg149hind-asCGCGTCCCAAGCTTCTAAACAACAGTAGTCTCCGGAAGCGTTGATAG引物6107sGTGGTTTCACATTTCTTCCCTCACTTTTGGAAG然后用PCR引物EcoRIHBcAg(s)和107as组合片段1和2，产生片段4。然后用引物EcoRIHBcAg(s)和HBcAg149hind-as组合片段4和片段3，产生全长基因。全长基因用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆到在相同限制酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。HBcAg-lys-2cys-Mut的表达和纯化如实施例3所述进行。
实施例5HBcAg1-185-Lys的构建肝炎核心抗原(HBcAg)1-185如实施例2所述修饰。通过基因工程方法用肽Gly-Gly-Lys-Gly-Gly取代c/el表位(残基72-88)区的一部分(脯氨酸79和丙氨酸80)(HBcAg1-185-Lys构建体)。引入的赖氨酸残基在其侧链上含有一个反应性氨基，可以用于HBcAg颗粒与含有游离半胱氨酸基团的任何抗原的分子间化学交联。用PCR方法和常规克隆技术制备HBcAg1-185-Lys基因。
按如下插入Gly-Gly-Lys-Gly-Gly序列如以上实施例2所述，从pEco63扩增HBcAg基因的两个不同片段，随后通过PCR融合这两个片段，装配为全长基因。使用下列PCR引物组合片段1引物1EcoRIHBcAg(s)(见实施例2)引物2Lys-HBcAg(as)(见实施例2)片段2引物3Lys-HBcAg(s)(见实施例2)引物4HBcAgwtHindIIIICGCGTCCCAAGCTTCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG装配引物1EcoRIHBcAg(s)(见实施例2)引物2HBcAgwtHindIIII装配的全长基因然后用EcoRI(GAATTC)和HindIII(AAGCTT)酶消化，克隆到在相同限制酶切位点酶切的pKK载体(Pharmacia)中。
实施例6肽表位在HBcAg MIR区中的融合将HBcAg1-185的残基79和80置换为具有序列VNLTWSRASG的表位CεH3。CεH3序列来源于人IgE重链第三恒定区的序列。用装配PCR法将该表位插入HBcAg1-185序列中。第一个PCR步骤中，用来源于ATCC克隆pEco63并用引物HBcAg-wt EcoRI fwd和HBcAg-wt HindIIIrev扩增的HBcAg1-185基因作为两个不同反应中的模板，扩增含有编码CεH3序列的序列元件的两个片段。然后在装配PCR反应中的第二个PCR步骤，这两个片段装配在一起。
第一个PCR步骤的引物组合CεH3fwd与HBcAg-wt Hind III rev，和HBcAg-wt EcoRI fwd与CεH3rev。在装配PCR反应中，第一个PCR步骤中分离的两个片段首先通过3个PCR循环装配，这不需要外部引物，之后添加到反应混合物中进行下25个循环。外部引物HBcAg-wtEcoRI fwd和HBcAg-wt Hind III rev。
为了在大肠杆菌中表达，利用EcoRI和HindIII位点将PCR产物克隆到pKK223.3中(见实施例2)。嵌合VLP在大肠杆菌中表达，如实施例2所述纯化。从凝胶过滤中洗脱HBcAg1-185-CεH3的洗脱体积显示融合蛋白已装配为嵌合VLP。
引物序列CεH3fwd5′GTT AAC TTG ACC TGG TCT CGT GCT TCT GGT GCA TCC AGG GAT CTA GTA GTC3′V N L T W S R A S G A80 S R D L V V86CεH3rev5′ACC AGA AGC ACG AGA CCA GGT CAA GTT AAC ATC TTC CAA ATT ATT ACC CAC 3′D78 E L N N G V72HBcAg-wt EcoRI fwd5’CCGgaattcATGGACATTGACCCTTATAAAGHBcAg-wt Hind III rev5’CGCGTCCCaagcttCTAACATTGAGATTCCCGAGATTG
实施例7含有一个含半胱氨酸残基的N端氨基酸接头的IL-5的克隆、表达和纯化。与VLP的偶联、在具有嗜酸细胞成分的变应性哮喘实验模型中的免疫和效能的证实A.小鼠His-C-IL-5的克隆和在大肠杆菌中作为包涵体的表达使用下列两条引物Spelinker3-F1(SEQ ID NO340)和I15StopXho-R(SEQ ID NO342)，从ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC号37562)中PCR扩增IL-5。该PCR的产物作为第二次PCR的模板，后者使用引物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO341)和I15StopXho-R。插入片段用SpeI和NotI消化。将该插入片段连接到预先用NheI和NotI消化的pET载体衍生物(pMODEC3-8载体)中，转化大肠杆菌TG1细胞。IL5克隆到pMODEC3-8内产生的构建体从其N端起包含一个六组氨酸尾(便于纯化)、一个肠激酶切割位点、一个含有半胱氨酸残基的γ3衍生的氨基酸接头(其N端侧翼为氨基酸ALV，C端为AS)，和编码IL-5蛋白成熟形式的DNA。此克隆步骤的保真度通过DNA测序证实。
上述含有IL-5的构建体被称为pMODC6-IL5.2(也被称为pMODC6-IL5)，并用来转化大肠杆菌BL21-DE3株。在大肠杆菌中表达的重组蛋白被称为His-C-IL5。
携带pMODC6-IL5的克隆BL21-DE3细胞在含有1mg/L氨苄青霉素的5ml LB中培养过夜。用含有1mg/L氨苄青霉素的100ml terrific培养液(TB)稀释2.0ml等份该培养物。培养物生长到光密度OD600nm＝0.7-1.0，添加0.1ml 1.0M异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)贮存液诱导表达4小时。重组His-C-IL5以不可溶形式表达，位于诱导细胞的包涵体级分中。His-C-IL5的表达用下列方法证实。在诱导4小时后采集10ml培养液样品，以4000×g离心10分钟。将沉淀悬浮于由50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％ triton X-100(pH8.0)组成的0.5ml裂解缓冲液中。向悬液中添加20μl溶菌酶(40mg/ml)，4℃ 30分钟后超声处理2分钟。添加1.0ml等份benzonase和100μl等份50mM MgCl2，在室温下温育30分钟。以13000×g离心15分钟后弃去上清液，沉淀在100μl SDS加样缓冲液中98℃加热5分钟。然后在还原条件下通过SDS-PAGE分析10μl等份(图17A)。SDS-PAGE分析证实有一条17kDa的蛋白带，对应于IL-5的分子量。作为对照，在不含IPTG的条件下培养含有pMODC6-IL5的BL21-DE2细胞，如上所述由不可溶的细胞级分制备提取物。
B.小鼠His-C-IL5的纯化和重折叠为了获得足量的纯IL-5以用于疫苗生产，由克隆pMODC6-IL5在BL21-DE3细胞中进行IL-5的较大规模表达。培养物过夜生长，稀释到含1.0mg/L氨苄青霉素的100ml或1L体积的TB培养基中。这样制备总共3升培养物，37℃培养直到OD600nm达到0.7，此时添加IPTG至终浓度为1.0mM。温育4小时后以10000×g离心30分钟收集细胞。收集后，将沉淀重悬浮于PBS中(5.0ml/g湿重)，以10000×g离心15分钟。洗涤的沉淀贮存于-20℃，直到进一步使用。
用Dounce匀浆器将细菌沉淀悬浮于PBS中(2.0ml/g细胞湿重)。向悬液中添加溶菌酶(0.8mg/ml)，在室温下温育30分钟。悬液在冰上超声处理1分钟，3次，然后添加benzonase和MgCl2(10mM终浓度)，在室温下温育30分钟。添加Triton X-100至终浓度为1％(w/v)，在室温下轻轻搅拌混合液30分钟。溶液以20000×g离心20分钟(SS34离心管)，弃去上清液。用Dounce匀浆器将含有包涵体的沉淀悬浮于(5.0ml/g湿重)洗涤缓冲液(PBS，含有2M尿素和1％(w/v)Triton X-100)中，搅拌5分钟。溶液以20000×g离心20分钟，弃去上清液。洗涤沉淀，再如上所述离心2次。用不含Triton X-100的洗涤缓冲液进行包涵体的最后一次洗涤。
将沉淀包涵体中存在的His-C-IL-5溶解于(5.0ml/g细胞湿重)变性缓冲液(100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl，6.0M盐酸胍，pH 8.0)中，在25℃下轻轻搅拌1小时。悬液以20000×g离心20分钟，上清液与Ni-NTA树脂(QIAgen，用溶解缓冲液平衡)混合。在4℃下轻轻搅拌3小时后，将浆液注入玻璃柱(C10/10)，用100ml 100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M盐酸胍(pH 6.3)洗涤树脂。用15ml 100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M盐酸胍(pH 5.9)再洗涤一次。用20ml 100mM NaH2PO4，10mM Tris，6.0M盐酸胍(pH 4.5)，从树脂上洗脱下小鼠His-C-IL5。通过SDS-PAGE分析纯度。
合并洗脱步骤得到的含有His-C-IL-5的级分，使用10kDa截止值的膜，在4℃下用含有8.0M尿素，100mM NaH2PO4，10mM Tris-HCl(pH 8.0)的缓冲液透析。透析后，用分光光度法以下列公式测定蛋白质浓度蛋白质(mg/ml)＝(1.55×A280nm)-(0.76×A260nm)。蛋白质浓度用透析缓冲液稀释为0.2mg/ml。该溶液然后用3.5kDa膜在4℃下用含2.0M尿素、50mM NaH2PO4、5mM还原谷胱甘肽、0.5mM氧化谷胱甘肽、0.5M精氨酸、10％(v/v)甘油(pH 8.5)的重折叠缓冲液1透析24小时，并用另外一种重折叠缓冲液2再透析24小时，该缓冲液含50mM NaH2PO4，5mM还原谷胱甘肽，0.5mM氧化谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％(v/v)甘油(pH 8.5)。最后，蛋白质在4℃下用PBS pH8.0透析24小时，然后以10000×g离心30分钟。上清液中的蛋白质含量通过Bradford试验测定。
为了进一步纯化His-C-IL5，用Hitrap Q树脂(AmershamPharmacia，Uppsala Sweeden)进行阴离子交换。用CentrifugalFilters(Ultrafree-15 Millipore，10kDa截止值)将His-C-IL5浓缩为1mg/ml，用50mM磷酸缓冲液pH 8.4透析14小时。将该溶液加样到Hitrap Q柱上，用50mM磷酸缓冲液pH 8.4洗涤。用0-1M的NaCl梯度从柱上洗脱His-C-IL-5。用100mM NaCl从柱上洗脱下His-C-IL5。纯度的分析用SDS-PAGE进行，浓度用Bradford试验测定。在非还原条件下进行SDS-PAGE测定蛋白质的四级结构。
C.疫苗的生产His-C-IL5与Qβ偶联研究了多种条件来优化偶联反应的效率。包括向His-C-IL5中添加还原剂(TCEP)，改变偶联反应中Qβ单体与His-C-IL5的摩尔比，结果总结于表1中。进行效能研究的疫苗用下列方法生产。纯化的His-C-IL-5(40μM)用溶于PBS pH 8.0的等摩尔量的TCEP还原1小时。还原的IL-5(80μm)与40μM SMPH衍化的Qβ在700μl总体积中22℃温育4小时。反应液用300kDa截止值的透析膜、PBS pH 8.0透析12小时。用SDS-PAGE和使用抗-His和抗-Qβ抗体的Western-Blot分析偶联反应。蛋白质浓度用Bradford测定。偶联效率[即mol Qβ-IL5/mol Qβ单体(总数)]通过对考马斯蓝染色的SDS-PAGE进行密度分析来判断。
表1.用来优化His-C-IL5与Qβ化学交联的不同偶联条件
D.评价疫苗的ELISA小鼠His-C-IL5与Qβ的偶联用“四重”ELISA分析，在图4中显示。96孔ELISA板每孔用100μl 1mg/L山羊抗兔IgG包被过夜。用PBS-Tween 0.1％(v/v)(PBST)洗板4次，然后在37℃下用溶于PBST的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封闭2小时。PBST洗涤后，加入来自兔的多克隆抗-Qβ血清(1∶5000稀释)，温育1小时。用PBST洗板两次，加入不同量的Qβ-His-C-IL5或对照(图5)，25℃温育1小时。该试验中使用两种不同的第三抗体大鼠抗小鼠IL5(TRFK4)或大鼠抗小鼠IL5(TRFK5)，它们都是中和性单克隆抗体，均以1μg/ml的浓度使用。检测性抗体与辣根过氧化物酶(HRP)偶联，并且对于第三抗体的特定Fc-片段是特异的。夹心试验中的结合在450nm处根据化学发光(ECL)测定。
F.IL-5活性的测定利用B细胞淋巴瘤BCL1系响应鼠IL-5而增殖的能力检测重折叠的重组His-C-IL-5的生物活性(Harriman G.R.(1991)CurrentProtocols in Immunology 6.5.1-6.5.5 John Wiley and Sons Inc)。也测定了与Qβ共价偶联的His-C-IL5的增殖活性。重组鼠IL-5(R&Dsystems，Minneapolis USA)作为对照。重组IL-5的不同形式在平底96孔板中与每孔2×104BCL1细胞温育，在37℃、5％CO2下温育24小时。向每孔中加入1μCi3H-胸苷(Hartmann Analytic，Switzerland)，平板在37℃、5％CO2下再温育6小时。收集细胞，洗涤，用液闪计数仪计数β-发射来测定胸苷的掺入。
G.免疫方案为了产生抗小鼠IL-5的自体反应性抗体，4只BalbC小鼠在第0天和第14天皮下注射在200μl PBS中的25μg Qβ-His-C-IL5疫苗。5只小鼠在第0天和第14天用6.4μg Qβ和16μg IL5(即非共价偶联的(Qβ+His-C-IL-5))在PBS中的简单混合物免疫，作为阴性对照。对小鼠在免疫前和免疫方案的第21天采血。血清用ELISA分析。
H.血清分析ELISA.Maxisorp ELISA板(Nunc)用50μl纯化的His-C-IL-5(3μg/ml)在4℃下包被14小时。用PBS洗板3次，以2％ BSA的PBS溶液37℃封闭2小时，然后用PBS洗涤两次。在2％ BSA、0.1％FCS的PBS溶液中添加5倍稀释的血清，在室温下温育1小时。随后用PBS洗板3次，在室温下与HRP偶联的抗小鼠IgG(1∶1000稀释)温育1小时。再用PBS洗板3次，加入100μl/孔显色溶液(0.066M Na2HPO4，0.035M柠檬酸，0.032％ H2O2，0.4％1，2-苯二胺二盐酸盐)。在室温下反应2分钟后，以每孔50μl 5％ H2SO4终止ELISA。450nm处的吸光度用Spectramax分光光度计(Molecular Devices)测定。
Qβ-IL5免疫的小鼠血清的Western blot染色。His-C-IL5、Qβ和对照通过SDS-PAGE分离，并且电印迹到硝酸纤维素膜上。该膜用溶于PBS的5％(w/v)奶粉封闭1小时，然后与来自接种小鼠的20μl第21天血清在10ml 1％(w/v)奶粉PBS溶液中温育。用PBS洗膜15分钟，然后与含有与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的抗小鼠IgG抗体(稀释度为1∶1000)的10ml 1％(w/v)奶粉PBS溶液温育1小时。用PBS洗膜15分钟，以ECL(Amersham Pharmacia，Sweden)显色，并暴光于摄影胶片。
I.嗜酸细胞增多症模型用一种变应性呼吸道炎症的实验哮喘模型评价接种对嗜酸细胞增多症的影响。Balb/c小鼠(每组4只)如上所述用Qβ-His-C-IL-5免疫。在接种计划的第23天，对小鼠腹膜内注射Alumn(Alu-Gel-S)中的50μg卵白蛋白(OVA)。不接受免疫的第三组4只小鼠也进行注射。10天后(即第33天)，小鼠接受溶于PBS的100μg OVA，每天鼻内施用，共4天。最后一次攻击24小时后，处死小鼠，用PBS洗肺。支气管-肺泡灌洗液(BAL)中所含的细胞用Maigrunwald-姬姆萨染色并计数(Trifilieff A等人，Clin Exp Allergy.2001 Jun；31(6)934-42)。
结果与讨论表达。构建体pMODC6-IL5在BL21-DE2细胞中的表达用SDS-PAGE分析(图1)。考马斯蓝染色的凝胶证实了IPTG诱导的对应于IL-5分子量的17kDa蛋白质的表达。作为对照，含有pMODC6-IL5的BL21-DE2细胞在无IPTG的条件下生长，如上所述由不可溶的细胞级分制备提取物。如预期的，在这些条件下不发生17kDa的诱导。His-C-IL5位于不可溶的包涵体级分中。
提取、纯化和重折叠。用6M盐酸胍从去污剂洗涤过的包涵体中提取不可溶的His-C-IL5。溶解的蛋白质通过金属螯合亲和层析纯化，用SDS-PAGE分析(图2)。发现用该方法能够高度富集重组His-C-IL5。变性蛋白质如上所述在尿素中进行重折叠，通过阴离子交换层析进一步纯化。经过SDS-PAGE判断，这些步骤产生可溶的、高纯度的His-C-IL5(图5，1道)，其回收率为23％，产量为6.9mg。
由于具有生物活性的天然IL-5是二硫键连接的同型二聚体，在非还原条件下进行SDS-PAGE评价纯化的重组His-C-IL5形成二聚体的能力(图3)。根据37kDa的分子量判断，证实His-C-IL5实际上是二聚体，表明了原始四级结构的保守性。
通过测定重组His-C-IL5刺激鼠B细胞系增殖的能力，评价其生物活性(图4)。与单独的培养基或其它蛋白质相比，在His-C-IL5存在下培养的BCL1细胞显示增殖率提高。而且，提高的增殖类似于购得的鼠IL-5所产生的功效。His-C-IL5刺激B细胞增殖的能力(可能通过与其同源受体相互作用获得)，和采用二聚体结构的能力，都表明重组蛋白采用了原始构象。
疫苗生产和分析。His-C-IL5与病毒样颗粒Qβ的共价化学偶联通过SDS-PAGE和Western blot分析评价。考马斯蓝染色的偶联反应凝胶证实出现分子量对应于与Qβ共价连接的His-C-IL5的预测分子的明显条带(图5)。而且，Western分析显示，用抗-His或抗-Qβ抗体染色时，这些条带共定位(图6)。通过对考马斯蓝染色的SDS-PAGE进行光密度分析，估计偶联效率[即mol Qβ-IL5/mol Qβ单体(总数)]为40.6％。
如上所述分析与Qβ共价交联的His-C-IL-5刺激B细胞增殖的能力。图5显示，和与无关细胞因子偶联的Qβ相比，Qβ-His-C-IL5能够引起更强的增殖。
与Qβ偶联的His-C-IL5的构象用四重ELISA进一步分析(图7a)。图7b证实，His-C-IL5可被IL-5中和性单克隆抗体TRFK 4和TRFK 5识别。与Qβ而不是Qβ-His-C-IL-5进行反应时未检测到信号。单克隆抗体TRFK 4识别IL-5内的一个中和性表位。IL-5特异的单克隆抗体识别共价连接的His-C-IL-5的能力表明，在疫苗制品内中和性表位是保守的。
血清的分析。收集接种Qβ-His-C-IL5的小鼠的免疫前血清和第21天的血清，通过ELISA分析(图8)。结果显示，在4/4接种的小鼠中，在不使用佐剂时克服了对自身抗原IL-5的免疫耐受。计算半数最大滴度为1∶2000-1∶6000。在接受与His-C-IL5混合的Qβ的对照组中，未检测到显著的抗-IL-5滴度。然而，5只小鼠中的3只产生＜1∶50的低抗体滴度。来自接种Qβ-His-C-IL5的小鼠的免疫血清通过Western blot分析进一步检测。在所有情况下，免疫血清均特异识别鼠IL-5。
疫苗在实验哮喘动物模型上的效能。接种Qβ-His-C-IL-5对嗜酸细胞增多症的效果用鼠变应性呼吸道炎症模型评价，该模型模拟哮喘的主要病理学表征。该实验检测接种Qβ-His-C-IL-5产生的抗-IL5抗体负调节内源性IL-5体内作用的能力。在对照实验中，小鼠在OVA致敏和攻击前接种PBS。在此情况下，在BAL中计数到大量的嗜酸性粒细胞。每200个细胞中嗜酸性粒细胞的平均计数为96±14 S.D.。与之相比，接种Qβ-His-C-IL-5的4只小鼠的BAL嗜酸性粒细胞的平均值是每200个细胞27.5±11 S.D.，减少了71.4％。这表明，在实验哮喘模型中，用表现为高度有序免疫阵列的His-C-IL-5免疫产生的自身抗体可识别内源性靶分子，从而负调节嗜酸性粒细胞增多症。
实施例8含有一个含半胱氨酸残基的C端氨基酸接头的小鼠mIL-13的分子克隆、表达、重折叠和纯化，用于与VLP
和菌毛偶联。小鼠白介素13与VLP和菌毛的偶联。
A.为了原核表达克隆IL-13用于克隆IL-13的DNA通过RT-PCT从体外激活的脾细胞中分离，该DNA按如下获得从小鼠脾细胞中分离CD4+T细胞，在预先用抗-CD3和抗-CD28抗体包被的6孔板中，在IMDM(+5％ FCS+10ng/mlIL4)中温育3天。用来自这些细胞的RNA通过一步RT-PCR(Qiagen一步PCR试剂盒)扩增编码IL-13的cDNA。引物XhoIL13-R用于RNA的逆转录，引物NheIL13-F(SEQ ID NO338)和XhoIL13-R(SEQ IDNO339)用于IL13 cDNA的PCR扩增。利用NheI/XhoI限制酶切位点，将扩增的IL13 cDNA连接到pMOD载体中(产生载体pMODB1-IL13)。获得的cDNA序列的身份通过核苷酸测序确定。
使用相同的引物，NheIL13-F(SEQ ID NO338)和XhoIL13-R(SEQID NO339)，由pModB1-IL13质粒扩增IL-13 cDNA，并连接到pMODGST-EK-C1载体内，产生质粒pModGST-EK-IL13-C1。该质粒的cDNA序列通过核苷酸测序确定。用质粒pModGST-EK-IL13-C1作为模板，使用引物GST-BamHI ss和C1-BsmBI/XhoI，PCR扩增一种cDNA，其包含与肠激酶切割位点融合的谷胱甘肽S转移酶的编码序列，随后是含有C端接头1的IL-13序列。该cDNA用限制性内切酶BamHI和BsmBI消化，利用BamHI/XhoI限制酶切位点连接到pModB-N1载体内。获得的质粒pMod-GST-EK-IL13-C1-His编码一种融合蛋白，该融合蛋白包含谷胱甘肽S转移酶、肠激酶切割位点、IL-13、含半胱氨酸的接头和聚组氨酸尾(GST-EK-IL13-C1-His)。编码该融合蛋白的cDNA的身份通过核苷酸测序证实。
寡核苷酸序列GST-BamHI ss5′-CGCCGGATCCTATACTAGGTTATTGG-3′C1-BsmBI/XhoI as5-GGGCGCGTCTCCTCGAGACCGCAACCACCACCA-3′
B.IL-13在大肠杆菌中的表达。
用质粒pMod-GST-EK-IL13-C1-His转化细菌宿主BL 21株(DE3)。在含2％葡萄糖的LB培养基中恢复90分钟后(预培养)，用250μl预培养物接种含有0.2％葡萄糖和100μg/l氨苄青霉素的250ml MOPS-缓冲的SB培养基，在37℃摇床上温育过夜。次日清晨，用预温的含有100μg/l氨苄青霉素的750ml MOPS-缓冲SB培养基稀释种子培养液，在37℃、125rpm摇床上再温育90分钟，直到OD600达到4.5。1000ml培养物用含有100μg/l氨苄青霉素的500ml MOPS-缓冲的SB培养基稀释，转移到24℃培养箱中，摇床温育30分钟，直到OD600达到3.75。加入0.75mM IPTG诱导GST-EK-IL13-C1-His融合蛋白的表达。4小时后离心收集细菌，超声破碎。
C.在变性条件下从包涵体中纯化IL-13裂解后通过低速离心(10000g，60min，4℃)沉淀包涵体。收集上清液，在相同条件下再次离心。沉淀作为粗包涵体级分保存。包涵体用下列洗涤缓冲液洗涤4次50mM Tris HCl，pH 7.6，250mM NaCl，5mM MgCl2，2M尿素，2％ Triton X-100和10 U Benzonase/ml。离心收集包涵体，重悬浮于含有100mM NaH2PO4，10mMTrisHCl和6M盐酸胍的pH 8.0变性缓冲液中。在10U Benzonase/ml存在下超声处理包涵体，在室温下在转盘上温育2小时。离心后保留上清液，沉淀再次重悬浮于变性缓冲液中，如上所述处理。合并上清液，加样到用变性缓冲液平衡的Ni2+-琼脂糖柱上。结合的蛋白质用变性缓冲液pH 6.3和pH 4.5分两步洗脱。通过Amidoblack染色，在TCA沉淀后通过SDS-PAGE，分析各级分(图10)。
D.重折叠GST-EK-IL13-C1-His。
向洗脱的蛋白质中加入β-巯基乙醇至终浓度为10mM，使用10kDa截止值的膜，在4℃下用2升含有8.0M尿素、100mM NaH2PO4、10mMTrisHCl，10mM β-巯基乙醇的缓冲液(pH 8.0)透析过夜。透析后测定蛋白质浓度，用透析缓冲液将蛋白质浓度稀释为0.2mg/ml。溶液在4℃下用重折叠缓冲液1透析24小时，该缓冲液包含2.0M尿素，50mM NaH2PO4，5mM还原谷胱甘肽，0.5mM氧化谷胱甘肽，0.5M精氨酸，10％(v/v)甘油(pH 8.5)。次日，将重折叠缓冲液1更换为重折叠缓冲液2，后者含有50mM NaH2PO4，2.5mM还原谷胱甘肽，0.25mM氧化谷胱甘肽，0.25M精氨酸，10％(v/v)甘油(pH 8.5)，在4℃下再透析24小时。最后，溶液在4℃下用重折叠缓冲液3透析，该缓冲液包含20mM乙醇胺，150mM NaCl和10％(v/v)甘油(pH 9.0)。2小时后更换一次重折叠缓冲液3，继续透析14小时。在4℃以20000g离心透析液15分钟。保留上清液，用5kDa分子量截止值的“biomax离心过滤装置”(Millipore)离心浓缩蛋白质，至蛋白质终浓度为2mg/ml。通过SDS-PAGE和分别使用抗GST、抗小鼠IL-13和抗His尾的单特异性抗体的Western blot分析蛋白质。
E.肠激酶对GST-EK-IL13-C1-His融合蛋白的切割将GST-EK-IL13-C1-His融合蛋白与1×肠激酶缓冲液(50mMTrisHCl pH 8.0，10mM CaCl2和1％ Tween-20)和肠激酶(Invitrogene，每12.5μg融合蛋白1U)在4℃下温育24小时。
F.IL13-C1-His的纯化肠激酶处理后，通过联合使用离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析分离切下的GST。将IL-13-C1-His蛋白浓缩为2mg/ml的终蛋白质浓度。
G.为偶联反应制备IL-13-C1-His蛋白为了确定最佳偶联条件，在温和还原条件下用不同浓度(0μM-500μM)的还原剂(DTT或TCEP)处理IL-13-C1-His蛋白。检测还原的IL-13C1-His蛋白与衍化的VLP和菌毛的有效偶联。
H.IL-13-C1-His与Qβ衣壳的偶联120μM Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的异双功能交联剂如SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析、衍化的Qβ反应混合物然后与制备的IL-13-C1-His蛋白混合。在偶联反应中，IL-13-C1-His蛋白两倍摩尔过量于衍化的Qβ衣壳。偶联反应在25℃摇床上进行4小时。偶联产物通过SDS-PAGE以及Westernblot分析。
IL-13-C1-His与fr衣壳蛋白的偶联120μM fr衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pieree)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的fr衣壳蛋白反应混合物然后与制备的IL-13-C1-His蛋白混合。在偶联反应中，IL-13-C1-His蛋白两倍摩尔过量于衍化的fr衣壳。偶联反应在25℃摇床上进行4小时。偶联产物通过SDS-PAGE以及Westernblot分析。
IL-13-C1-His与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合物然后与制备的IL-13-C1-His蛋白混合。在偶联反应中，IL-13-C1-His蛋白两倍摩尔过量于衍化的HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳。偶联反应在25℃摇床上进行4小时。偶联产物通过SDS-PAGE以及Westernblot分析。
IL-13-C1-His蛋白与菌毛的偶联125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes，pH 7.4中的溶液与50倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH在摇床上室温反应60分钟。反应混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，脱盐、衍化的菌毛蛋白与制备的IL-13-C1-His蛋白反应。在偶联反应中，IL-13-C1-His蛋白两倍摩尔过量于衍化的大肠杆菌1型菌毛。偶联反应在25℃摇床上进行4小时。偶联产物通过SDS-PAGE以及Westernblot分析。
与Qβ衣壳蛋白偶联的IL-13-C1-His对小鼠的免疫对雌性Balb/c小鼠接种与VLP偶联的IL-13-C1-His，其中不加佐剂。每种样品的25μg总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0天和第14天皮下注射(腹部两侧各100μl)。对小鼠在第31天眼眶后放血，用IL-13-特异的ELISA分析其血清。
实施例9具有含半光氨酸的接头序列的嗜酸细胞活化趋化因子的克隆、表达、纯化和偶联重组表达在C端融合了一个氨基酸接头C1的小鼠嗜酸细胞活化趋化因子。为了与VLP偶联，该接头含有一个半胱氨酸。
pmEo-C1和pmHisEo-C1的构建用退火的寡核苷酸引物MCS-IF和引物MCS-1R(在15mM Tris HClpH 8缓冲液中退火)替换从NdeI位点到XhoI位点的原始序列，使pET22b(+)(Novagen，Inc.)的MCS改变为GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGATCCGGCTAGCGCTCGAGGGTTTAAACGGCGGCCGCATGCACC。获得的质粒被称为pMod00，它在其MCS中含有NdeI、BamHI、NheI、XhoI、PmeI和NotI限制酶切位点。退火的寡核苷酸Bamhis6-EK-Nhe-F和Bamhis6-EKNhe-R对和退火的寡核苷酸1F-C-甘氨酸-接头和寡核苷酸1R-C-甘氨酸-接头对一起被连接到BamHI-NotI消化的pMod00质粒中，产生pModEC1，它含有一个N端六组氨酸尾、一个肠激酶切割位点和含有一个半胱氨酸残基的C端氨基酸甘氨酸接头。小鼠嗜酸细胞活化趋化因子从ATCC克隆(ATCC号3148394)PCR扩增，其中使用下列引物mEotaxin-F、Nhe-mEotaxin-F和mEotaxin-Xho-R。mEotaxin-F含有一个内部NdeI位点，Nhe-mEotaxin-F含有一个内部NheI位点，mEotaxin-Xho-R含有一个内部XhoI位点。引物对mEotaxin-F和mEotaxin-Xho-R的PCR产物用NdeI和XhoI消化，连接到用相同酶消化的pModEC1中。获得的质粒被命名为pmEo-C1，它编码一种融合蛋白，该融合蛋白由嗜酸细胞活化趋化因子和位于其C端的含半胱氨酸的接头组成。引物对Nhe-mEotaxin-F和mEotaxin-Xho-R的PCR产物用NheI和XhoI消化，连接到用相同酶消化的pModEC1中。获得的质粒被命名为pHismEo-C1，它编码一种融合蛋白，该融合蛋白由N端His尾、随后的肠激酶切割位点、嗜酸细胞活化趋化因子和半胱氨酸接头组成。
对于PCR反应，在50μl反应混合物(2单位PFX聚合酶，0.3mMdNTPs和2mM MgSO4)中使用15pmol每种寡核苷酸和1ng模板DNA。温度循环如下94℃2分钟，随后94℃(30秒)，60℃(30秒)，68℃(30秒)30个循环，随后68℃2分钟。其它所有步骤均按标准分子生物学方法进行。
寡核苷酸序列mEotaxin-F5′GGAATTCCATATGCACCCAGGCTCCATCCCAAC 3′Nhe-mEotaxin-F5′CCTAGCTAGCGCACCCAGGCTCCATCCCAAC 3′mEotaxin-Xho-R5′CCCGCTCGAGTGGTTTTGGAGTTTGGAGTT3′pmEo-C1的表达用质粒pmEo-C1转化感受态大肠杆菌BL21(DE3)细胞。来自含氨苄青霉素(Amp)琼脂平板的单菌落在液体培养基(SB，含150mM MOPS，pH 7.0，100μg/ml Amp，0.5％葡萄糖)中扩增，在30℃、220rpm振摇下温育过夜。然后用过夜培养物以1∶50v/v接种于1L SB(150mMMOPS，pH 7.0，100μg/ml Amp)，在30℃、150rpm振摇下生长至OD600＝1.7。用1mM IPTG诱导表达。诱导9小时后以6000rpm离心5分钟收集细胞。细胞沉淀悬浮于含0.8mg/ml溶菌酶的裂解缓冲液(10mM Na2HPO4，30mM NaCl，10mM EDTA和0.25％ Tween-20)中，超声处理，并用benzonase处理。以48000 RCF离心20分钟后，上清液在16％ PAGE凝胶上分析，小鼠嗜酸细胞活化趋化因子的表达通过Western blot用抗小鼠嗜酸细胞活化趋化因子抗体(R&D system)证实(图12)。这清楚地证实了嗜酸细胞活化趋化因子-C1的表达，它电泳中显示8.8KD的预期分子量。
小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1和小鼠His-嗜酸细胞活化趋化因子-C1的蛋白质序列由cDNA序列翻译而来。
小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1MHPGSIPTSCCFIMTSKKIPNTLLKSYKRITNNRCTLKAIVFKTRLGKEICADPKKKWVQDATKHLDQKLQTPKPLRGGGGGCG小鼠His-嗜酸细胞活化趋化因子-C1MDPHHHHHHGSGDDDDKALAHPGSIPTSCCFIMTSKKIPNTLLKSYKRITNNRCTLKAIVFKTRLGKEICADPKKKWVQDATKHLDQKLQTPKPLRGGGGGCG小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1与Qβ衣壳蛋白的偶联将1.48ml 6mg/ml Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与14.8μl SMPH(Pierce)(来自溶于DMSO的100mM贮存液)在25℃下反应60分钟。反应溶液随后在4℃下用2L 20mMHepes，150mM NaCl，pH 7.0透析两次各3小时。1.3ml 3.6mg/ml小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH7.2中的溶液与9.6μl TCEP(Pierce)(来自36mM贮存水溶液)在25℃下反应1小时。130μl衍化并透析的Qβ然后与129μl还原的嗜酸细胞活化趋化因子-C1溶液在241μl 20mM Hepes，150mM NaCl，pH7.0中25℃反应过夜。使用抗-Qβ和抗嗜酸细胞活化趋化因子抗体的Western blot分析证实了嗜酸细胞活化趋化因子与Qβ的共价偶联。
B.与Qβ衣壳蛋白偶联的小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1对小鼠的免疫对雌性Balb/c小鼠接种与Qβ衣壳蛋白偶联的小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1，其中不加佐剂。每种样品的25μg总蛋白用PBS稀释为200μl，在第0天和第14天皮下注射(腹部两侧各100μl)。对小鼠在第31天眼眶后放血，用嗜酸细胞活化趋化因子特异的ELISA分析其血清。
C.ELISAELISA板用浓度为5μg/ml的小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-C1包被。封闭平板，然后与连续稀释的小鼠血清一起温育。用酶标抗小鼠IgG抗体检测结合的抗体。也检测来自同一小鼠的免疫前血清作为对照。
实施例10含有一个含半胱氨酸残基的N端氨基酸接头的白介素5(IL-5)的克隆和表达，用于与VLP和菌毛偶联A.克隆IL-5用于在大肠杆菌中以包涵体表达用下列两条引物由ATCC克隆(pmIL5-4G；ATCC号37562)PCR扩增IL-5Spelinker3-F1(SEQ ID NO340)和IL5StopXho-R(SEQ IDNO342)。该PCR的产物作为第二次PCR的模板，第二次PCR使用引物SpeNlinker3-F2(SEQ ID NO341)和IL5StopXho-R。插入片段用SpeI和NotI消化。将该插入片段连接到预先用Nhe1和NotI消化(未磷酸化)的pET载体衍生物(pMODEC3-8载体)中，转化大肠杆菌TG1细胞。通过向pMODEC3-8载体中克隆而产生的IL5构建体，在N端含有一个六组氨酸尾，随后是一个肠激酶位点、一个含有半胱氨酸残基的N端γ3氨基酸接头(其C端一侧为序列AS，N端一侧为序列ALV)，以及IL5基因的成熟形式。肠激酶切割释放的蛋白质被称为“小鼠C-IL-5-E”(SEQ ID NO332)。用获得的克隆pMODC6-IL5.2(也被称为pMODC6-IL5)的质粒DNA转化大肠杆菌BL21株，其序列通过DNA测序证实。
克隆pMODC6-IL5/BL21在含有1mg/L氨苄青霉素的5ml LB中生长过夜。2ml该培养物用100ml含1mg/L氨苄青霉素的terrific培养液(TB)稀释。当培养物的光密度达到OD600＝0.7时，加入0.1ml1M异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)溶液诱导培养物。每2小时采集10ml样品。样品以4000×g离心10分钟。将沉淀重悬浮于0.5ml含有50mM Tris-HCl，2mM EDTA，0.1％ triton X-100的裂解缓冲液(pH8)中。加入20μl溶菌酶(40mg/ml)并在4℃下温育试管30分钟后，超声处理细胞2分钟。加入100μl 50mM MgCl2溶液和1mlbenzonase。将细胞在室温下温育30分钟，以13000×g离心15分钟。
弃去上清液，将沉淀在100μl SDS加样缓冲液中98℃煮沸5分钟。加样缓冲液中的10μl样品通过还原条件下的SDS-PAGE分析(图17A)。图17A的凝胶清楚地证实了IL-5构建体的表达。加样到图17A的凝胶上的样品如下M道分子量标志(NEB，预染色的宽范围标记)。1道诱导前1ml培养物的细胞提取物。2道诱导4小时后1ml培养物的细胞提取物。
B.克隆IL-5用于在哺乳动物细胞(HEK-293T)中表达a)在N端与含有半胱氨酸残基的氨基酸接头融合、在C端与Fc片段融合的IL-5下列构建体的克隆使用(A)所述的模板(ATCC克隆37562)。质粒pMODB1-IL5(一种pET衍生物)用BamHI/XhoI消化，产生一个小片段，其编码与含半胱氨酸的N端氨基酸接头融合的IL5。将该片段连接到预先已用BamHI和XhoI消化的载体pCEP-SP-XA-Fc*(ΔXho)中。将连接产物电穿孔到大肠杆菌TG1株中，用获得的克隆pCEP-SP-IL5-Fc.2的质粒DNA转染HEK-293T细胞，其序列通过DNA测序证实。该质粒编码的IL-5构建体在IL-5成熟序列的N端融合有氨基酸序列ADPGCGGGGGLA。该序列包含氨基酸接头序列GCGGGGG，其中含有一个半胱氨酸，侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。因子-Xa切割融合蛋白释放的IL-5蛋白在下文中被命名为“小鼠C-IL-5-F”(SEQ IDNO333)。
转染并在嘌呤霉素上筛选后，使用与辣根过氧化物酶偶联的抗-His(小鼠)和抗小鼠IgG抗体，通过Western-Blot分析培养上清液(图17B)。与辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG抗体也被用来检测Fc-融合蛋白。蛋白质的纯化用蛋白A树脂亲和层析进行。图17B的结果清楚地证实了IL-5构建体的表达。
加样到图17B的Western-Blot上的样品如下1道表达IL5-Fc的HEK培养物的上清液(20μl)。SDS-PAGE在还原条件下进行。2道表达IL13-Fc的HEK培养物的上清液(20μl)。SDS-PAGE在非还原条件下进行。3道表达IL5-Fc的HEK培养物的上清液(20μl)。SDS-PAGE在非还原条件下进行。
B.与GST(谷胱甘肽-S-转移酶)克隆并且在其N端融合有一个含半胱氨酸残基的氨基酸接头的IL-5IL-5(ATCC 37562)用引物Nhe-link1-IL13-F和IL5StopXho-R扩增。用NheI和XhoI消化后，将插入片段连接到预先已用NheI和XhoI消化的pCEP-SP-GST-EK中。对获得的质粒pCEP-SP-GST-IL5进行测序，用来转染HEK-293T细胞。该质粒编码的IL-5构建体在IL-5成熟序列的N端融合有氨基酸序列LACGGGGG。该序列包含氨基酸接头序列ACGGGGG，其含有一个半胱氨酸残基，侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。肠激酶切割释放的蛋白质在下文中被命名为“小鼠C-IL-5-S”(SEQ ID NO334)。获得的蛋白质的纯化通过谷胱甘肽亲和树脂上的亲和层析进行。
C.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S与Qβ衣壳蛋白的偶联将120μM Qβ衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的Qβ反应混合液然后与小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度60μM Qβ衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
D.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S与fr衣壳蛋白的偶联将120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的fr反应混合液然后与小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度60μM fr衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
E.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联将120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液然后与小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
F.小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液与菌毛的偶联将125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes，pH 7.4中的溶液与50倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在室温下摇床上反应60分钟。反应混合物用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，脱盐、衍化的菌毛蛋白与小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S溶液(终浓度60μM菌毛，60μM小鼠C-IL-5-F或小鼠C-IL-5-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
实施例11与VLP和菌毛偶联的IL-13的克隆、表达和纯化A.含有一个含半胱氨酸残基的N端氨基酸接头的白介素13(IL-13)的克隆和表达，用于与VLP和菌毛偶联a)为了在哺乳动物细胞中以Fc融合蛋白表达，克隆小鼠IL-13(HEK-293T)用于克隆IL-13的DNA通过RT-PCT从体外激活的脾细胞中分离，该DNA如下获得从小鼠脾细胞中分离CD4+T细胞，在预先用抗-CD3和抗-CD28抗体包被的6孔板中，在IMDM(+5％ FCS+10ng/ml IL4)中温育3天。用来自这些细胞的RNA通过一步RT-PCR(Qiagen一步PCR试剂盒)扩增IL-13。RNA的逆转录使用引物XhoIL13-R，IL13cDNA的PCR扩增使用引物NheIL13-F(SEQ ID NO338)和XhoIL13-R(SEQID NO339)。利用NheI/XhoI限制酶切位点将扩增的IL13 cDNA连接到pMOD载体中(产生载体pMODB1-IL13)。pMODB1-IL13用BamHI/XhoI消化，含有IL13的片段被连接到预先已用BamHI/XhoI消化的pCEP-SP-XA-Fc*(Δxho)载体中，该载体是pCEP-SP-XA-Fc*的类似物，其中位于Fc序列末端的XhoI位点已经去除。对该连接产生的质粒(pCEP-SP-IL13-Fc)进行测序，用来转染HEK-293T细胞。该质粒编码的IL13构建体在IL-13成熟序列的N端融合有氨基酸序列ADPGCGGGGGLA。该序列包含氨基酸接头序列GCGGGGG，其侧翼为克隆过程中引入的其它氨基酸。IL13-Fc能够用蛋白A树脂从pCEP-SP-IL13-Fc转染细胞的上清液中纯化。表达结果显示于图17B(样品描述见实施例10)。用因子Xa切割融合蛋白后释放其N端与上述氨基酸序列融合的成熟IL-13，产生在下文中被称为“小鼠C-IL-13-F”的蛋白质，它含有SEQ ID NO328的序列。图17B的结果清楚地证实了IL-13构建体的表达。
b)为了在哺乳动物细胞中表达，克隆N端与GST(谷胱甘肽-S-转移酶)融合的小鼠IL-13(HEK-293T)用于克隆N端带有GST的IL-13的cDNA来源于TH2激活的T细胞的cDNA，如以上(a)所述。使用引物Nhelink1IL13-F和IL13StopXhoNot-R由该cDNA扩增IL-13。PCR产物用NheI和XhoI消化，并被连接到预先用NheI/XhoI消化的pCEP-SP-GST-EK载体中。可从该连接中分离的质粒(pCEP-SP-GST-IL13)被用来转染HEK-293T细胞。该质粒编码的IL13构建体在IL-13成熟序列的N端融合有氨基酸序列LACGGGGG。该序列包含氨基酸接头序列ACGGGGG，其侧翼为克隆过程中引入的一个额外氨基酸。pCEP-SP-GST-IL13转染细胞的培养上清液中含有融合蛋白GST-IL13，该蛋白可以按照标准方法通过谷胱甘肽亲和层析纯化。肠激酶切割融合蛋白后释放出N端与上述氨基酸序列融合的成熟IL-13，产生在下文中被称为“小鼠C-IL-13-S”的蛋白质，其含有SEQ ID NO329的序列。
B.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S与Qβ衣壳蛋白的偶联将120μM Qβ衣壳在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mMNaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的Qβ反应混合液然后与小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度60μM Qβ衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
C.小鼠C-IL-13-F、小鼠C-IL-13-S与fr衣壳蛋白的偶联将120μM fr衣壳蛋白在20mM Hepes，150mM NaCl pH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的fr反应混合液然后与小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度60μM fr衣壳蛋白，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
D.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液与HBcAg-Lys-2cys-Mut的偶联将120μM HBcAg-Lys-2cys-Mut衣壳在20mM Hepes，150mM NaClpH 7.2中的溶液与25倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的SMPH(Pierce)在25℃摇床上反应30分钟。反应溶液随后在4℃下用1L 20mM Hepes，150mM NaCl，pH 7.2透析两次各2小时。透析的HBcAg-Lys-2cys-Mut反应混合液然后与小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度60μM HBcAg-Lys-2cys-Mut，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
E.小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液与菌毛的偶联将125μM大肠杆菌1型菌毛在20mM Hepes，pH 7.4中的溶液与50倍摩尔过量的由DMSO贮存液稀释的交联剂SMPH(Pierce)在室温下摇床上反应60分钟。反应混合液用PD-10柱(Amersham-Pharmacia Biotech)脱盐。合并从柱上洗脱下来的含蛋白质级分，脱盐的衍生菌毛蛋白与小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S溶液(终浓度60μM菌毛，60μM小鼠C-IL-13-F或小鼠C-IL-13-S)在25℃摇床上反应4小时。偶联产物通过SDS-PAGE分析。
为了便于明确理解，现在已经通过举例说明和实施例全面详细地描述了本发明，本领域技术人员应当理解，在不影响本发明或其任何具体实施方案的范围的情况下，能够在较广或相当范围的条件、制剂和其它参数范围内修饰或改变本发明，这些修饰或改变包括在所附权利要求书的范围之内。
本说明书中提到的所有公开文件、专利和专利申请表明了本发明所属领域中技术人员的水平，均在此引用作为参考，如同具体、单独地引用每个公开文件、专利和专利申请作为参考。
序列表<110>赛托斯生物技术公司<120>用于治疗变应性嗜酸细胞性疾病的抗原阵列<130>C38913PC<140>PCT/EP02/12455<141>2002-11-07<150>US 60/396,636<151>2002-07-19<150>PCT/IB02/00166<151>2002-01-21<150>US 10/050,902<151>2002-01-18<150>US 60/331,045<151>2001-11-07<160>342<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>212<212>PRT<213>流感嗜血杆菌<400>1Met Lys Lys Thr Leu Leu Gly Ser Leu Ile Leu Leu Ala Phe Ala Gly1 5 10 15Asn Val Gln Ala Ala Ala Asn Ala Asp Thr Ser Gly Thr Val Thr Phe20 25 30Phe Gly Lys Val Val Glu Asn Thr Cys Gln Val Asn Gln Asp Ser Glu35 40 45Tyr Glu Cys Asn Leu Asn Asp Val Gly Lys Asn His Leu Ser Gln Gln50 55 60Gly Tyr Thr Ala Met Gln Thr Pro Phe Thr Ile Thr Leu Glu Asn Cys65 70 75 80Asn Val Thr Thr Thr Asn Asn Lys Pro Lys Ala Thr Lys Val Gly Val85 90 95Tyr Phe Tyr Ser Trp Glu Ile Ala Asp Lys Asp Asn Lys Tyr Thr Leu100 105 110Lys Asn Ile Lys Glu Asn Thr Gly Thr Asn Asp Ser Ala Asn Lys Val115 120 125Asn Ile Gln Leu Leu Glu Asp Asn Gly Thr Ala Glu Ile Lys Val Val130 135 140Gly Lys Thr Thr Thr Asp Phe Thr Ser Glu Asn His Asn Gly Ala Gly145 150 155 160Ala Asp Pro Val Ala Thr Asn Lys His Ile Ser Ser Leu Thr Pro Leu
165 170 175Asn Asn Gln Asn Ser Ile Asn Leu His Tyr Ile Ala Gln Tyr Tyr Ala180 185 190Thr Gly Val Ala Glu Ala Gly Lys Val Pro Ser Ser Val Asn Ser Gln195 200 205Ile Ala Tyr Glu210<210>2<211>139<212>PRT<213>假单胞菌<400>2Met Lys Ala Gln Met Gln Lys Gly Phe Thr Leu Ile Glu Leu Met Ile1 5 10 15Val Val Ala Ale Ile Gly Ile Leu Ala Ala Ile Ala Leu Pro Ala Tyr20 25 30Gln Asp Tyr Thr Val Arg Ser Asn Ala Ala Ala Ala Leu Ala Glu Ile35 40 45Thr Pro Gly Lys Ile Gly Phe Glu Gln Ala Ile Asn Glu Gly Lys Thr50 55 60Pro Ser Leu Thr Ser Thr Asp Glu Gly Tyr Ile Gly Ile Thr Asp Ser65 70 75 80Thr Ser Tyr Cys Asp Val Asp Leu Asp Thr Ala Ala Asp Gly His Ile85 90 95Glu Cys Thr Ala Lys Gly Gly Asn Ala Gly Lys Phe Asp Gly Lys Thr100 105 110Ile Thr Leu Asn Arg Thr Ala Asp Gly Glu Trp Ser Cys Ala Ser Thr115 120 125Leu Asp Ala Lys Tyr Lys Pro Gly Lys Cys Ser130 135<210>3<211>59<212>PRT<213>新月柄杆菌<400>3Met Thr Lys Phe Val Thr Arg Phe Leu Lys Asp Glu Ser Gly Ala Thr1 5 10 15Ala Ile Glu Tyr Gly Leu Ile Val Ala Leu Ile Ala Val Val Ile Val20 25 30Thr Ala Val Thr Thr Leu Gly Thr Asn Leu Arg Thr Ala Phe Thr Lys35 40 45
Ala Gly Ala Ala Val Ser Thr Ala Ala Gly Thr50 55<210>4<211>173<212>PRT<213>大肠杆菌<400>4Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Ile Pro Gln1 5 10 15Gly Gln Gly Lys Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys20 25 30Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu35 40 45Ser Lys Ser Phe Leu Glu Ala Gly Gly Val Ser Lys Pro Met Asp Leu50 55 60Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Gly Gly Asn65 70 75 80Gly Ala Gln Lys Gly Thr Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Ile Val85 90 95Asn Gly His Ser Asp Glu Leu Asp Thr Asn Gly Gly Thr Gly Thr Ala100 105 110Ile Val Val Gln Gly Ala Gly Lys Asn Val Val Phe Asp Gly Ser Glu115 120 125Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Asp Gly Glu Asn Val Leu His Tyr Thr130 135 140Ala Val Val Lys Lys Ser Ser Ala Val Gly Ala Ala Val Thr Glu Gly145 150 155 160Ala Phe Ser Ala Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Tyr Gln165 170<210>5<211>173<212>PRT<213>大肠杆菌<400>5Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Ile Pro Gln1 5 10 15Gly Gln Gly Lys Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys20 25 30Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu35 40 45Ser Lys Ser Phe Leu Glu Ala Gly Gly Val Ser Lys Pro Met Asp Leu
50 55 60Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Gly Gly Asn65 70 75 80Gly Ala Gln Lys Gly Thr Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Ile Val85 90 95Asn Gly His Ser Asp Glu Leu Asp Thr Asn Gly Gly Thr Gly Thr Ala100 105 110Ile Val Val Gln Gly Ala Gly Lys Asn Val Val Phe Asp Gly Ser Glu115 120 125Gly Asp Ala Asn Thr Leu Lys Asp Gly Glu Asn Val Leu His Tyr Thr130 135 140Ala Val Val Lys Lys Ser Ser Ala Val Gly Ala Ala Val Thr Glu Gly145 150 155 160Ala Phe Ser Ala Val Ala Asn Phe Asn Leu Thr Tyr Gln165 170<210>6<211>181<212>PRT<213>大肠杆菌<400>6Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Ala Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr20 25 30Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala35 40 45Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser50 55 60Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln65 70 75 80Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe85 90 95Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln100 105 110Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp115 120 125Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu130 135 140Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr145 150 155 160
Phe Ala Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr Phe165 170 175Lys Val Gln Tyr Gln180<210>7<211>172<212>PRT<213>大肠杆菌<400>7Met Ala Val Val Ser Phe Gly Val Asn Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gln1 5 10 15Gly Gln Gly Arg Val Thr Phe Asn Gly Thr Val Val Asp Ala Pro Cys20 25 30Ser Ile Ser Gln Lys Ser Ala Asp Gln Ser Ile Asp Phe Gly Gln Leu35 40 45Ser Lys Ser Phe Leu Ala Asn Asp Gly Gln Ser Lys Pro Met Asn Leu50 55 60Asp Ile Glu Leu Val Asn Cys Asp Ile Thr Ala Phe Lys Asn Gly Asn65 70 75 80Ala Lys Thr Gly Ser Val Lys Leu Ala Phe Thr Gly Pro Thr Val Ser85 90 95Gly His Pro Ser Glu Leu Ala Thr Asn Gly Gly Pro Gly Thr Ala Ile100 105 110Met Ile Gln Ala Ala Gly Lys Asn Val Pro Phe Asp Gly Thr Glu Gly115 120 125Asp Pro Asn Leu Leu Lys Asp Gly Asp Asn Val Leu His Tyr Thr Thr130 135 140Val Gly Lys Lys Ser Ser Asp Gly Asn Ala Gln Ile Thr Glu Gly Ala145 150 155 160Phe Ser Gly Val Ala Thr Phe Asn Leu Ser Tyr Gln165 170<210>8<211>182<212>PRT<213>大肠杆菌<400>8Met Lys Ile Lys Thr Leu Ala Ile Val Val Leu Ser Ala Leu Ser Leu1 5 10 15Ser Ser Thr Thr Ala Leu Ala Ala Ala Thr Thr Val Asn Gly Gly Thr20 25 30
Val His Phe Lys Gly Glu Val Val Asn Ala Ala Cys Ala Val Asp Ala35 40 45Gly Ser Val Asp Gln Thr Val Gln Leu Gly Gln Val Arg Thr Ala Ser50 55 60Leu Ala Gln Glu Gly Ala Thr Ser Ser Ala Val Gly Phe Asn Ile Gln65 70 75 80Leu Asn Asp Cys Asp Thr Asn Val Ala Ser Lys Ala Ala Val Ala Phe85 90 95Leu Gly Thr Ala Ile Asp Ala Gly His Thr Asn Val Leu Ala Leu Gln100 105 110Ser Ser Ala Ala Gly Ser Ala Thr Asn Val Gly Val Gln Ile Leu Asp115 120 125Arg Thr Gly Ala Ala Leu Thr Leu Asp Gly Ala Thr Phe Ser Ser Glu130 135 140Thr Thr Leu Asn Asn Gly Thr Asn Thr Ile Pro Phe Gln Ala Arg Tyr145 150 155 160Phe Ala Thr Gly Ala Ala Thr Pro Gly Ala Ala Asn Ala Asp Ala Thr165 170 175Phe Lys Val Gln Tyr Gln180<210>9<211>853<212>DNA<213>大肠杆菌<400>9acgtttctgt ggctcgacgc atcttcctca ttcttctctc caaaaaccac ctcatgcaat60ataaacatct ataaataaag ataacaaata gaatattaag ccaacaaata aactgaaaaa120gtttgtccgc gatgctttac ctctatgagt caaaatggcc ccaatgtttc atcttttggg180ggaaactgtg cagtgttggc agtcaaactc gttgacaaac aaagtgtaca gaacgactgc240ccatgtcgat ttagaaatag ttttttgaaa ggaaagcagc atgaaaatta aaactctggc300aatcgttgtt ctgtcggctc tgtccctcag ttctacgacg gctctggccg ctgccacgac360ggttaatggt gggaccgttc actttaaagg ggaagttgtt aacgccgctt gcgcagttga420tgcaggctct gttgatcaaa ccgttcagtt aggacaggtt cgtaccgcat cgctggcaca480ggaaggagca accagttctg ctgtcggttt taacattcag ctgaatgatt gcgataccaa540tgttgcatct aaagccgctg ttgccttttt aggtacggcg attgatgcgg gtcataccaa600cgttctggct ctgcagagtt cagctgcggg tagcgcaaca aacgttggtg tgcagatcct660ggacagaacg ggtgctgcgc tgacgctgga tggtgcgaca tttagttcag aaacaaccct720gaataacgga accaatacca ttccgttcca ggcgcgttat tttgcaaccg gggccgcaac780cccgggtgct gctaatgcgg atgcgacctt caaggttcag tatcaataac ctacctaggt840tcagggacgt tca 853
<210>10<211>132<212>PRT<213>噬菌体Q-beta<400>10Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>11<211>329<212>PRT<213>噬菌体Q-beta CP<400>11Met Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly1 5 10 15Lys Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95
Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr Trp Thr Leu Leu Ile Ala Gly Gly Gly Ser Gly130 135 140Ser Lys Pro Asp Pro Val Ile Pro Asp Pro Pro Ile Asp Pro Pro Pro145 150 155 160Gly Thr Gly Lys Tyr Thr Cys Pro Phe Ala Ile Trp Ser Leu Glu Glu165 170 175Val Tyr Glu Pro Pro Thr Lys Asn Arg Pro Trp Pro Ile Tyr Asn Ala180 185 190Val Glu Leu Gln Pro Arg Glu Phe Asp Val Ala Leu Lys Asp Leu Leu195 200 205Gly Asn Thr Lys Trp Arg Asp Trp Asp Ser Arg Leu Ser Tyr Thr Thr210 215 220Phe Arg Gly Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp Ala Thr Tyr225 230 235 240Leu Ala Thr Asp Gln Ala Met Arg Asp Gln Lys Tyr Asp Ile Arg Glu245 250 255Gly Lys Lys Pro Gly Ala Phe Gly Asn Ile Glu Arg Phe Ile Tyr Leu260 265 270Lys Ser Ile Asn Ala Tyr Cys Ser Leu Ser Asp Ile Ala Ala Tyr His275 280 285Ala Asp Gly Val Ile Val Gly Phe Trp Arg Asp Pro Ser Ser Gly Gly290 295 300Ala Ile Pro Phe Asp Phe Thr Lys Phe Asp Lys Thr Lys Cys Pro Ile305 310 315 320Gln Ala Val Ile Val Val Pro Arg Ala325<210>12<211>129<212>PRT<213>噬菌体R17<400>12Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>13<211>130<212>PRT<213>噬菌体fr<400>13Met Ala Ser Asn Phe Glu Glu Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Lys Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Asn Asn Arg Lys Tyr Thr Val Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Val Gln Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Met Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Val Phe85 90 95Ala Thr Asn Asp Asp Cys Ala Leu Ile Val Lys Ala Leu Gln Gly Thr100 105 110Phe Lys Thr Gly Asn Pro Ile Ala Thr Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>14<211>130<212>PRT<213>噬菌体GA
<400>14Met Ala Thr Leu Arg Ser Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Val Pro Val Ser Asn Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Leu Ser Asn Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Arg Val Thr Ala Ser Tyr35 40 45Arg Ala Ser Gly Ala Asp Lys Arg Lys Tyr Ala Ile Lys Leu Glu Val50 55 60Pro Lys Ile Val Thr Gln Val Val Asn Gly Val Glu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Ala Trp Lys Ala Tyr Ala Ser Ile Asp Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Ala Thr Asp Asp Val Thr Val Ile Ser Lys Ser Leu Ala Gly Leu Phe100 105 110Lys Val Gly Asn Pro Ile Ala Glu Ala Ile Ser Ser Gln Ser Gly Phe115 120 125Tyr Ala130<210>15<211>132<212>PRT<213>噬菌体SP<400>15Met Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125
Asn Pro Ala Tyr130<210>16<211>329<212>PRT<213>噬菌体SP CP<400>16Ala Lys Leu Asn Gln Val Thr Leu Ser Lys Ile Gly Lys Asn Gly Asp1 5 10 15Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Phe Lys Val50 55 60Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Arg Asp Ala Cys Asp65 70 75 80Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Phe Ala Asp Val Thr Leu Ser Phe Thr85 90 95Ser Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu Ala100 105 110Ala Leu Leu Ala Asp Pro Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu Asn115 120 125Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Val Ala Ser Ser Gly Gly Gly Asp130 135 140Asn Pro Ser Asp Pro Asp Val Pro Val Val Pro Asp Val Lys Pro Pro145 150 155 160Asp Gly Thr Gly Arg Tyr Lys Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Leu Gly165 170 175Ser Ile Tyr Glu Val Gly Lys Glu Gly Ser Pro Asp Ile Tyr Glu Arg180 185 190Gly Asp Glu Val Ser Val Thr Phe Asp Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Thr Asn Trp Arg Asn Trp Asp Gln Arg Leu Ser Asp Tyr Asp210 215 220Ile Ala Asn Arg Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Ile Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Thr Ala Met Gln Ser Asp Asp Phe Val Leu Ser Gly Arg Tyr Gly245 250 255
Val Arg Lys Val Lys Phe Pro Gly Ala Phe Gly Ser Ile Lys Tyr Leu260 265 270Leu Asn Ile Gln Gly Asp Ala Trp Leu Asp Leu Ser Glu Val Thr Ala275 280 285Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Gln Phe Asn Ser Ala Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Ile Ile Pro Ser325<210>17<211>130<212>PRT<213>噬菌体MS2<400>17Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr1 5 10 15Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu20 25 30Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser35 40 45Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu50 55 60Val Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val65 70 75 80Ala Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe85 90 95Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu100 105 110Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly115 120 125Ile Tyr130<210>18<211>133<212>PRT<213>噬菌体M11<400>18Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Lys Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asp Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly
20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ser Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Val Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Gln Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Val Asn Ala Ile Asp Asn115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>19<211>133<212>PRT<213>噬菌体MX1<400>19Met Ala Lys Leu Gln Ala Ile Thr Leu Ser Gly Ile Gly Lys Asn Gly1 5 10 15Asp Val Thr Leu Asn Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ala Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Ile Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ser Cys Thr Ala Ser Gly Thr65 70 75 80Cys Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Ala Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser85 90 95Phe Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Leu Val Arg Thr Glu100 105 110Leu Lys Ala Leu Leu Ala Asp Pro Met Leu Ile Asp Ala Ile Asp Asn115 120 125Leu Asn Pro Ala Tyr130<210>20<211>330
<212>PRT<213>噬菌体NL95<400>20Met Ala Lys Leu Asn Lys Val Thr Leu Thr Gly Ile Gly Lys Ala Gly1 5 10 15Asn Gln Thr Leu Thr Leu Thr Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly20 25 30Val Ala Ser Leu Ser Glu Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg35 40 45Val Thr Val Ser Val Ala Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys50 55 60Val Gln Ile Lys Leu Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Lys Asp Ala Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Ser Gly Ser Arg Asp Val Thr Leu Ser Phe85 90 95Thr Ser Tyr Ser Thr Glu Arg Glu Arg Ala Leu Ile Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Lys Asp Asp Leu Ile Val Asp Ala Ile Asp Asn Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr Trp Ala Ala Leu Leu Ala Ala Ser Pro Gly Gly Gly130 135 140Asn Asn Pro Tyr Pro Gly Val Pro Asp Ser Pro Asn Val Lys Pro Pro145 150 155 160Gly Gly Thr Gly Thr Tyr Arg Cys Pro Phe Ala Cys Tyr Arg Arg Gly165 170 175Glu Leu Ile Thr Glu Ala Lys Asp Gly Ala Cys Ala Leu Tyr Ala Cys180 185 190Gly Ser Glu Ala Leu Val Glu Phe Glu Tyr Ala Leu Glu Asp Phe Leu195 200 205Gly Asn Glu Phe Trp Arg Asn Trp Asp Gly Arg Leu Ser Lys Tyr Asp210 215 220Ile Glu Thr His Arg Arg Cys Arg Gly Asn Gly Tyr Val Asp Leu Asp225 230 235 240Ala Ser Val Met Gln Ser Asp Glu Tyr Val Leu Ser Gly Ala Tyr Asp245 250 255Val Val Lys Met Gln Pro Pro Gly Thr Phe Asp Ser Pro Arg Tyr Tyr260 265 270Leu His Leu Met Asp Gly Ile Tyr Val Asp Leu Ala Glu Val Thr Ala275 280 285
Tyr Arg Ser Tyr Gly Met Val Ile Gly Phe Trp Thr Asp Ser Lys Ser290 295 300Pro Gln Leu Pro Thr Asp Phe Thr Arg Phe Asn Arg His Asn Cys Pro305 310 315 320Val Gln Thr Val Ile Val Ile Pro Ser Leu325 330<210>21<211>129<212>PRT<213>噬菌体f2<400>21Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asn Asp Gly Gly Thr Gly1 5 10 15Asn Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Val Ala Glu Trp20 25 30Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val35 40 45Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val50 55 60Pro Lys Val Ala Thr Gln Thr Val Gly Gly Val Glu Leu Pro Val Ala65 70 75 80Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Leu Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala85 90 95Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu100 105 110Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile115 120 125Tyr<210>22<211>128<212>PRT<213>噬菌体PP7<400>22Met Ser Lys Thr Ile Val Leu Ser Val Gly Glu Ala Thr Arg Thr Leu1 5 10 15Thr Glu Ile Gln Ser Thr Ala Asp Arg Gln Ile Phe Glu Glu Lys Val20 25 30Gly Pro Leu Val Gly Arg Leu Arg Leu Thr Ala Ser Leu Arg Gln Asn35 40 45
Gly Ala Lys Thr Ala Tyr Arg Val Asn Leu Lys Leu Asp Gln Ala Asp50 55 60Val Val Asp Cys Ser Thr Ser Val Cys Gly Glu Leu Pro Lys Val Arg65 70 75 80Tyr Thr Gln Val Trp Ser His Asp Val Thr Ile Val Ala Asn Ser Thr85 90 95Glu Ala Ser Arg Lys Ser Leu Tyr Asp Leu Thr Lys Ser Leu Val Ala100 105 110Thr Ser Gln Val Glu Asp Leu Val Val Asn Leu Val Pro Leu Gly Arg115 120 125<210>23<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta-240突变体<400>23Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lysl 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>24<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta-243突变体<400>24
Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Lys Ile Gly Lys Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>25<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta-250突变体<400>25Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Arg Asp Gly Lys1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu
115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>26<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta-251突变体<400>26Ala Lys Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>27<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>噬菌体Q-beta-259突变体<400>27Ala Arg Leu Glu Thr Val Thr Leu Gly Asn Ile Gly Lys Asp Gly Arg1 5 10 15Gln Thr Leu Val Leu Asn Pro Arg Gly Val Asn Pro Thr Asn Gly Val20 25 30Ala Ser Leu Ser Gln Ala Gly Ala Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Val35 40 45Thr Val Ser Val Ser Gln Pro Ser Arg Asn Arg Lys Asn Tyr Lys Val
50 55 60Gln Val Lys Ile Gln Asn Pro Thr Ala Cys Thr Ala Asn Gly Ser Cys65 70 75 80Asp Pro Ser Val Thr Arg Gln Lys Tyr Ala Asp Val Thr Phe Ser Phe85 90 95Thr Gln Tyr Ser Thr Asp Glu Glu Arg Ala Phe Val Arg Thr Glu Leu100 105 110Ala Ala Leu Leu Ala Ser Pro Leu Leu Ile Asp Ala Ile Asp Gln Leu115 120 125Asn Pro Ala Tyr130<210>28<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>28Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys
180 185<210>29<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>29Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys180<210>30<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>30Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Thr Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Ile Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys180<210>31<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>31Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>32<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>32Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro
180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>33<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>33Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Thr Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>34<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>34Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>35<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>35Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60
Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Ash Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>36<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>36Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro Gln65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>37<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>37Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Lys Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Gly Ser Gln Cys210<210>38<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>38Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Asp Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Ser Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>39<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>39
Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>40<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>40Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg His Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Arg Thr
85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>41<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>41Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Phe Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Gln Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Cys165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>42<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>42Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180
<210>43<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>43Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Ser85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>44<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>44Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp
20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>45<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>45Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg
100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>46<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>46Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Ala Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Thr Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180
<210>47<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>47Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>48<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>48Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15
Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>49<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>49Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Thr Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His
65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ala Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>50<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>50Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Phe Glu Cys Ser Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125
Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>51<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<220>
<221>MISC_FEATURE<222>(28)..(28)<223>Xaa可以代表任何氨基酸<400>51Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Xaa Asp Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Ile Thr85 90 95Leu Ser Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Thr Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>52<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>52Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Asn Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>53<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>53Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Cys Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>54<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒
<400>54Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Pro Gln Cys210<210>55<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>55Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45
Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Ser Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>56<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>56Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95
Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Leu Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>57<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>57Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Lys Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala
145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>58<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>58Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ala50 55 60Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205
Glu Ser Gln Cys210<210>59<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>59Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Ser Met Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Tyr Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Thr Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Gln Asp Pro Thr65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Val Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Val Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Gln Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>60<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>60Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30
Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg His Val Phe Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Thr65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>61<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>61Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Thr Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln
115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>62<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>62Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Ile Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175
Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>63<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>63Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Val65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Ala Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>64<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>64
Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Asn85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Val Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Gly Tyr Val Asn Thr Thr Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>65<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>65Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp
50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Thr Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>66<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>66Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Ala Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Ile Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140
Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>67<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>67Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Thr Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190
Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>68<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>68Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Arg Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Thr Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>69<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒
<400>69Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Val Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ala50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Ile Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>70<211>212<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>70Met Gln Leu Phe His Leu Cys Leu Ile Ile Ser Cys Ser Cys Pro Thr1 5 10 15Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Gly Met Asp Ile20 25 30Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu Ser Phe Leu35 40 45
Pro Ser Ala Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp Thr Ala Ser50 55 60Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys Ser Pro His65 70 75 80His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp Leu Met Thr85 90 95Leu Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp100 105 110Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys Phe Arg Gln115 120 125Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg Glu Thr Val130 135 140Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Pro Ala145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu Thr Thr165 170 175Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro180 185 190Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Arg195 200 205Glu Ser Gln Cys210<210>71<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>71Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95
Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180<210>72<211>183<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>72Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Gly Asn Leu Glu Asp Pro Ile65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Ile Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Cys Val Val Arg Arg Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg Arg Thr145 150 155 160Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser165 170 175
Gln Ser Arg Gly Ser Gln Cys180<210>73<211>188<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>73Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu1 5 10 15Asn Phe Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp20 25 30Thr Ala Thr Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Asp Glu50 55 60Leu Thr Lys Leu Ile Ala Trp Met Ser Ser Asn Ile Thr Ser Glu Gln65 70 75 80Val Arg Thr Ile Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys85 90 95Val Arg Gln Ser Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln100 105 110His Thr Val Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Ala Pro Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu His Thr Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ala Arg Ala Ser Arg Ser145 150 155 160Pro Arg Arg Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro165 170 175Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Ser Thr Asn Cys180 185<210>74<211>217<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>74Met Tyr Leu Phe His Leu Cys Leu Val Phe Ala Cys Val Pro Cys Pro1 5 10 15Thr Val Gln Ala Ser Lys Leu Cys Leu Gly Trp Leu Trp Asp Met Asp20 25 30Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ser Ser Tyr Gln Leu Leu Asn Phe
35 40 45Leu Pro Leu Asp Phe Phe Pro Asp Leu Asn Ala Leu Val Asp Thr Ala50 55 60Ala Ala Leu Tyr Glu Glu Glu Leu Thr Gly Arg Glu His Cys Ser Pro65 70 75 80His His Thr Ala Ile Arg Gln Ala Leu Val Cys Trp Glu Glu Leu Thr85 90 95Arg Leu Ile Thr Trp Met Ser Glu Asn Thr Thr Glu Glu Val Arg Arg100 105 110Ile Ile Val Asp His Val Asn Asn Thr Trp Gly Leu Lys Val Arg Gln115 120 125Thr Leu Trp Phe His Leu Ser Cys Leu Thr Phe Gly Gln His Thr Val130 135 140Gln Glu Phe Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr Pro Ala Pro145 150 155 160Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro Glu His Thr165 170 175Val Ile Arg Arg Arg Gly Gly Ser Arg Ala Ala Arg Ser Pro Arg Arg180 185 190Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg195 200 205Arg Ser Gln Ser Pro Ala Ser Asn Cys210 215<210>75<211>262<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>75Met Asp Val Asn Ala Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro1 5 10 15Asp Asp Phe Phe Pro Lys Ile Glu Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp20 25 30Ala Leu Glu Pro Tyr Trp Lys Ser Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu35 40 45Ile Ala Thr His Phe Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr50 55 60Gln Gly Met His Glu Ile Ala Glu Ala Ile Arg Ala Val Ile Pro Pro65 70 75 80Thr Thr Ala Pro Val Pro Ser Gly Tyr Leu Ile Gln His Asp Glu Ala85 90 95
Glu Glu Ile Pro Leu Gly Asp Leu Phe Lys Glu Gln Glu Glu Arg Ile100 105 110Val Ser Phe Gln Pro Asp Tyr Pro Ile Thr Ala Arg Ile His Ala His115 120 125Leu Lys Ala Tyr Ala Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg130 135 140Arg Leu Leu Trp Trp His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Ala Thr145 150 155 160Val Thr Asn Tyr Ile Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu165 170 175Lys Tyr Arg Gly Arg Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro180 185 190Ile Gln Val Ala Gln Gly Gly Arg Lys Thr Ser Thr Ala Thr Arg Lys195 200 205Pro Arg Gly Leu Glu Pro Arg Arg Arg Lys Val Lys Thr Thr Val Val210 215 220Tyr Gly Arg Arg Arg Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Ser Ser Pro225 230 235 240Gln Arg Ala Gly Ser Pro Leu Pro Arg Ser Ser Ser Ser His His Arg245 250 255Ser Pro Ser Pro Arg Lys260<210>76<211>305<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>76Met Trp Asp Leu Arg Leu His Pro Ser Pro Phe Gly Ala Ala Cys Gln1 5 10 15Gly Ile Phe Thr Ser Ser Leu Leu Leu Phe Leu Val Thr Val Pro Leu20 25 30Val Cys Thr Ile Val Tyr Asp Ser Cys Leu Cys Met Asp Ile Asn Ala35 40 45Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro50 55 60Lys Ile Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr65 70 75 80Trp Arg Asn Asp Ser Ile Lys Lys His Val Leu Ile Ala Thr His Phe85 90 95
Val Asp Leu Ile Glu Asp Phe Trp Gln Thr Thr Gln Gly Met His Glu100 105 110Ile Ala Glu Ala Leu Arg Ala Ile Ile Pro Ala Thr Thr Ala Pro Val115 120 125Pro Gln Gly Phe Leu Val Gln His Glu Glu Ala Glu Glu Ile Pro Leu130 135 140Gly Glu Leu Phe Arg Tyr Gln Glu Glu Arg Leu Thr Asn Phe Gln Pro145 150 155 160Asp Tyr Pro Val Thr Ala Arg Ile His Ala His Leu Lys Ala Tyr Ala165 170 175Lys Ile Asn Glu Glu Ser Leu Asp Arg Ala Arg Arg Leu Leu Trp Trp180 185 190His Tyr Asn Cys Leu Leu Trp Gly Glu Pro Asn Val Thr Asn Tyr Ile195 200 205Ser Arg Leu Arg Thr Trp Leu Ser Thr Pro Glu Lys Tyr Arg Gly Lys210 215 220Asp Ala Pro Thr Ile Glu Ala Ile Thr Arg Pro Ile Gln Val Ala Gln225 230 235 240Gly Gly Arg Asn Lys Thr Gln Gly Val Arg Lys Ser Arg Gly Leu Glu245 250 255Pro Arg Arg Arg Arg Val Lys Thr Thr Ile Val Tyr Gly Arg Arg Arg260 265 270Ser Lys Ser Arg Glu Arg Arg Ala Pro Thr Pro Gln Arg Ala Gly Ser275 280 285Pro Leu Pro Arg Thr Ser Arg Asp His His Arg Ser Pro Ser Pro Arg290 295 300Glu305<210>77<211>185<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>77Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ser Ala Leu Tyr Arg Glu Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45
Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Glu50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Asn Asn Leu Glu Asp Pro Ala65 70 75 80Ser Arg Asp Leu Val Val Asn Tyr Val Asn Thr Asn Met Gly Leu Lys85 90 95Ile Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr Phe Gly Arg100 105 110Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp Ile Arg Thr115 120 125Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser Thr Leu Pro130 135 140Glu Thr Thr Val Val Arg Arg Arg Asp Arg Gly Arg Ser Pro Arg Arg145 150 155 160Arg Thr Pro Ser Pro Arg Arg Arg Arg Ser Gln Ser Pro Arg Arg Arg165 170 175Arg Ser Gln Ser Arg Glu Ser Gln Cys180 185<210>78<211>152<212>PRT<213>乙型肝炎病毒<400>78Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu1 5 10 15Ser Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val Arg Asp Leu Leu Asp20 25 30Thr Ala Ala Ala Leu Tyr Arg Asp Ala Leu Glu Ser Pro Glu His Cys35 40 45Ser Pro His His Thr Ala Leu Arg Gln Ala Ile Leu Cys Trp Gly Asp50 55 60Leu Met Thr Leu Ala Thr Trp Val Gly Thr Asn Leu Glu Asp Gly Gly65 70 75 80Lys Gly Gly Ser Arg Asp Leu Val Val Ser Tyr Val Asn Thr Asn Val85 90 95Gly Leu Lys Phe Arg Gln Leu Leu Trp Phe His Ile Ser Cys Leu Thr100 105 110Phe Gly Arg Glu Thr Val Leu Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp115 120 125Ile Arg Thr Pro Pro Ala Tyr Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu Ser
130 135 140Thr Leu Pro Glu Thr Thr Val Val145 150<210>79<211>3635<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒pAP283-58<400>79cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga60gctcgcccgg ggatcctcta gaattttctg cgcacccatc ccgggtggcg cccaaagtga120ggaaaatcac atggcaaata agccaatgca accgatcaca tctacagcaa ataaaattgt180gtggtcggat ccaactcgtt tatcaactac attttcagca agtctgttac gccaacgtgt240taaagttggt atagccgaac tgaataatgt ttcaggtcaa tatgtatctg tttataagcg300tcctgcacct aaaccggaag gttgtgcaga tgcctgtgtc attatgccga atgaaaacca360atccattcgc acagtgattt cagggtcagc cgaaaacttg gctaccttaa aagcagaatg420ggaaactcac aaacgtaacg ttgacacact cttcgcgagc ggcaacgccg gtttgggttt480ccttgaccct actgcggcta tcgtatcgtc tgatactact gcttaagctt gtattctata540gtgtcaccta aatcgtatgt gtatgataca taaggttatg tattaattgt agccgcgttc600taacgacaat atgtacaagc ctaattgtgt agcatctggc ttactgaagc agaccctatc660atctctctcg taaactgccg tcagagtcgg tttggttgga cgaaccttct gagtttctgg720taacgccgtt ccgcaccccg gaaatggtca ccgaaccaat cagcagggtc atcgctagcc780agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg gcatcaccgg cgccacaggt gcggttgctg840gcgcctatat cgccgacatc accgatgggg aagatcgggc tcgccacttc gggctcatga900gcgcttgttt cggcgtgggt atggtggcag gccccgtggc cgggggactg ttgggcgcca960tctccttgca tgcaccattc cttgcggcgg cggtgctcaa cggcctcaac ctactactgg1020gctgcttcct aatgcaggag tcgcataagg gagagcgtcg atatggtgca ctctcagtac1080aatctgctct gatgccgcat agttaagcca actccgctat cgctacgtga ctgggtcatg1140gctgcgcccc gacacccgcc aacacccgct gacgcgccct gacgggcttg tctgctcccg1200gcatccgctt acagacaagc tgtgaccgtc tccgggagct gcatgtgtca gaggttttca1260ccgtcatcac cgaaacgcgc gaggcagctt gaagacgaaa gggcctcgtg atacgcctat1320ttttataggt taatgtcatg ataataatgg tttcttagac gtcaggtggc acttttcggg1380gaaatgtgcg cggaacccct atttgtttat ttttctaaat acattcaaat atgtatccgc1440tcatgagaca ataaccctga taaatgcttc aataatattg aaaaaggaag agtatgagta1500ttcaacattt ccgtgtcgcc cttattccct tttttgcggc attttgcctt cctgtttttg1560ctcacccaga aacgctggtg aaagtaaaag atgctgaaga tcagttgggt gcacgagtgg1620gttacatcga actggatctc aacagcggta agatccttga gagttttcgc cccgaagaac1680gttttccaat gatgagcact tttaaagttc tgctatgtgg cgcggtatta tcccgtattg1740acgccgggca agagcaactc ggtcgccgca tacactattc tcagaatgac ttggttgagt1800
actcaccagt cacagaaaag catcttacgg atggcatgac agtaagagaa ttatgcagtg1860ctgccataac catgagtgat aacactgcgg ccaacttact tctgacaacg atcggaggac1920cgaaggagct aaccgctttt ttgcacaaca tgggggatca tgtaactcgc cttgatcgtt1980gggaaccgga gctgaatgaa gccataccaa acgacgagcg tgacaccacg atgcctgtag2040caatggcaac aacgttgcgc aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc2100aacaattaat agactggatg gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc2160ttccggctgg ctggtttatt gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta2220tcattgcagc actggggcca gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg2280ggagtcaggc aactatggat gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga2340ttaagcattg gtaactgtca gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac2400ttcattttta atttaaaagg atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa2460tcccttaacg tgagttttcg ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat2520cttcttgaga tccttttttt ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc2580taccagcggt ggtttgtttg ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg2640gcttcagcag agcgcagata ccaaatactg tccttctagt gtagccgtag ttaggccacc2700acttcaagaa ctctgtagca ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg2760ctgctgccag tggcgataag tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg2820ataaggcgca gcggtcgggc tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa2880cgacctacac cgaactgaga tacctacagc gcgagcattg agaaagcgcc acgcttcccg2940aagggagaaa ggcggacagg tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga3000gggagcttcc agggggaaac gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct3060gacttgagcg tcgatttttg tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca3120gcaacgcggc ctttttacgg ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc3180ctgcgttatc ccctgattct gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg3240ctcgccgcag ccgaacgacc gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc3300caatacgcaa accgcctctc cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tgtggtgtca3360tggtcggtga tcgccagggt gccgacgcgc atctcgactg catggtgcac caatgcttct3420ggcgtcaggc agccatcgga agctgtggta tggccgtgca ggtcgtaaat cactgcataa3480ttcgtgtcgc tcaaggcgca ctcccgttct ggataatgtt ttttgcgccg acatcataac3540ggttctggca aatattctga aatgagctgt tgacaattaa tcatcgaact agttaactag3600tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgcg gaatt 3635<210>80<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>Ap205外壳蛋白<400>80Met Ala Asn Lys Pro Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15
Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125Thr Thr Ala130<210>81<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>AP205外壳蛋白<400>81Met Ala Asn Lys Thr Met Gln Pro Ile Thr Ser Thr Ala Asn Lys Ile1 5 10 15Val Trp Ser Asp Pro Thr Arg Leu Ser Thr Thr Phe Ser Ala Ser Leu20 25 30Leu Arg Gln Arg Val Lys Val Gly Ile Ala Glu Leu Asn Asn Val Ser35 40 45Gly Gln Tyr Val Ser Val Tyr Lys Arg Pro Ala Pro Lys Pro Glu Gly50 55 60Cys Ala Asp Ala Cys Val Ile Met Pro Asn Glu Asn Gln Ser Ile Arg65 70 75 80Thr Val Ile Ser Gly Ser Ala Glu Asn Leu Ala Thr Leu Lys Ala Glu85 90 95Trp Glu Thr His Lys Arg Asn Val Asp Thr Leu Phe Ala Ser Gly Asn100 105 110Ala Gly Leu Gly Phe Leu Asp Pro Thr Ala Ala Ile Val Ser Ser Asp115 120 125
Thr Thr Ala130<210>82<211>3613<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>质粒pAP281-32<400>82cgagctcgcc cctggcttat cgaaattaat acgactcact atagggagac cggaattcga60gctcgcccgg ggatcctcta gattaaccca acgcgtagga gtcaggccat ggcaaataag120acaatgcaac cgatcacatc tacagcaaat aaaattgtgt ggtcggatcc aactcgttta180tcaactacat tttcagcaag tctgttacgc caacgtgtta aagttggtat agccgaactg240aataatgttt caggtcaata tgtatctgtt tataagcgtc ctgcacctaa accggaaggt300tgtgcagatg cctgtgtcat tatgccgaat gaaaaccaat ccattcgcac agtgatttca360gggtcagccg aaaacttggc taccttaaaa gcagaatggg aaactcacaa acgtaacgtt420gacacactct tcgcgagcgg caacgccggt ttgggtttcc ttgaccctac tgcggctatc480gtatcgtctg atactactgc ttaagcttgt attctatagt gtcacctaaa tcgtatgtgt540atgatacata aggttatgta ttaattgtag ccgcgttcta acgacaatat gtacaagcct600aattgtgtag catctggctt actgaagcag accctatcat ctctctcgta aactgccgtc660agagtcggtt tggttggacg aaccttctga gtttctggta acgccgttcc gcaccccgga720aatggtcacc gaaccaatca gcagggtcat cgctagccag atcctctacg ccggacgcat780cgtggccggc atcaccggcg ccacaggtgc ggttgctggc gcctatatcg ccgacatcac840cgatggggaa gatcgggctc gccacttcgg gctcatgagc gcttgtttcg gcgtgggtat900ggtggcaggc cccgtggccg ggggactgtt gggcgccatc tccttgcatg caccattcct960tgcggcggcg gtgctcaacg gcctcaacct actactgggc tgcttcctaa tgcaggagtc1020gcataaggga gagcgtcgat atggtgcact ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag1080ttaagccaac tccgctatcg ctacgtgact gggtcatggc tgcgccccga cacccgccaa1140cacccgctga cgcgccctga cgggcttgtc tgctcccggc atccgcttac agacaagctg1200tgaccgtctc cgggagctgc atgtgtcaga ggttttcacc gtcatcaccg aaacgcgcga1260ggcagcttga agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta atgtcatgat1320aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat1380ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata1440aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct1500tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa1560agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa1620cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt1680taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg1740tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca1800tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa1860cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt1920
gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc1980cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa2040actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga2100ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc2160tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga2220tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga2280acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga2340ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat2400ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt2460ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct2520gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc2580ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc2640aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc2700gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc2760gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg2820aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata2880cctacagcgc gagcattgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta2940tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc3000ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg3060atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt3120cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt3180ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga3240gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc3300cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg tggtgtcatg gtcggtgatc gccagggtgc3360cgacgcgcat ctcgactgca tggtgcacca atgcttctgg cgtcaggcag ccatcggaag3420ctgtggtatg gccgtgcagg tcgtaaatca ctgcataatt cgtgtcgctc aaggcgcact3480cccgttctgg ataatgtttt ttgcgccgac atcataacgg ttctggcaaa tattctgaaa3540tgagctgttg acaattaatc atcgaactag ttaactagta cgcaagttca cgtaaaaagg3600gtatcgcgga att 3613<210>83<400>83000 3<210>84<400>84000 3<210>85
<400>85000 3<210>86<400>86000 3<210>87<400>87000 3<210>88<400>88000 3<210>89<400>89000 3<210>90<400>90000 3<210>91<400>91000 3<210>92<400>92000 3<210>93<400>93000 3<210>94<400>94000 3<210>95<400>95000 3
<210>96<400>96000 3<210>97<400>97000 3<210>98<400>98000 3<210>99<400>99000 3<210>100<400>100000 3<210>101<400>101000 3<210>102<400>102000 3<210>103<400>103000 3<210>104<400>104000 3<210>105<400>105000 3<210>106<400>106000 3
<210>107<400>107000 3<210>108<400>108000 3<210>109<400>109000 3<210>110<400>110000 3<210>111<400>111000 3<210>112<400>112000 3<210>113<400>113000 3<210>114<400>114000 3<210>115<400>115000 3<210>116<400>116000 3<210>117<400>117
000 3<210>118<400>118000 3<210>119<400>119000 3<210>120<400>120000 3<210>121<400>121000 3<210>122<400>122000 3<210>123<400>123000 3<210>124<400>124000 3<210>125<400>125000 3<210>126<400>126000 3<210>127<400>127000 3<210>128
<400>128000 3<210>129<400>129000 3<210>130<400>130000 3<210>131<400>131000 3<210>132<400>132000 3<210>133<400>133000 3<210>134<400>134000 3<210>135<400>135000 3<210>136<400>136000 3<210>137<400>137000 3<210>138<400>138000 3<210>139
<400>139000 3<210>140<400>140000 3<210>141<400>141000 3<210>142<400>142000 3<210>143<400>143000 3<210>144<400>144000 3<210>145<400>145000 3<210>146<400>146000 3<210>147<400>147000 3<210>148<400>148000 3<210>149<400>149000 3
<210>150<400>150000 3<210>151<400>151000 3<210>152<400>152000 3<210>153<400>153000 3<210>154<400>154000 3<210>155<400>155000 3<210>156<400>156000 3<210>157<400>157000 3<210>158<400>158000 3<210>159<400>159000 3<210>160<400>160000 3
<210>161<400>161000 3<210>162<400>162000 3<210>163<400>163000 3<210>164<400>164000 3<210>165<400>165000 3<210>166<400>166000 3<210>167<400>167000 3<210>168<400>168000 3<210>169<400>169000 3<210>170<400>170000 3<210>171<400>171000 3
<210>172<400>172000 3<210>173<400>173000 3<210>174<400>174000 3<210>175<400>175000 3<210>176<400>176000 3<210>177<400>177000 3<210>178<400>178000 3<210>179<400>179000 3<210>180<400>180000 3<210>181<400>181000 3<210>182<400>182
000 3<210>183<400>183000 3<210>184<400>184000 3<210>185<400>185000 3<210>186<400>186000 3<210>187<400>187000 3<210>188<400>188000 3<210>189<400>189000 3<210>190<400>190000 3<210>191<400>191000 3<210>192<400>192000 3<210>193
<400>193000 3<210>194<400>194000 3<210>195<400>195000 3<210>196<400>196000 3<210>197<400>197000 3<210>198<400>198000 3<210>199<400>199000 3<210>200<400>200000 3<210>201<400>201000 3<210>202<400>202000 3<210>203<400>203000 3<210>204
<400>204000 3<210>205<400>205000 3<210>206<400>206000 3<210>207<400>207000 3<210>208<400>208000 3<210>209<400>209000 3<210>210<400>210000 3<210>211<400>211000 3<210>212<400>212000 3<210>213<400>213000 3<210>214<400>214000 3<210>215
<400>215000 3<210>216<400>216000 3<210>217<400>217000 3<210>218<400>218000 3<210>219<400>219000 3<210>220<400>220000 3<210>221<400>221000 3<210>222<400>222000 3<210>223<400>223000 3<210>224<400>224000 3<210>225<400>225000 3
<210>226<400>226000 3<210>227<400>227000 3<210>228<400>228000 3<210>229<400>229000 3<210>230<211>132<212>PRT<213>智人<220>
<223>人IL-13前体<400>230Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly1 5 10 15Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu20 25 30Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys35 40 45Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys50 55 60Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu65 70 75 80Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala85 90 95Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala100 105 110Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu115 120 125Gly Arg Phe Asn130<210>231<211>112
<212>PRT<213>智人<220>
<223>加工的人IL-13<400>231Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu1 5 10 15Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met20 25 30Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu35 40 45Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg50 55 60Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser65 70 75 80Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys85 90 95Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn100 105 110<210>232<211>111<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>加工的小鼠IL-13<400>232Gly Pro Val Pro Arg Ser Val Ser Leu Pro Leu Thr Leu Lys Glu Leu1 5 10 15Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr Gln Asp Gln Thr Pro Leu Cys Asn20 25 30Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Gly Phe Cys Val35 40 45Ala Leu Asp Ser Leu Thr Asn Ile Ser Asn Cys Asn Ala Ile Tyr Arg50 55 60Thr Gln Arg Ile Leu His Gly Leu Cys Asn Arg Lys Ala Pro Thr Thr65 70 75 80Val Ser Ser Leu Pro Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala His Phe Ile Thr85 90 95Lys Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Gln Leu Phe Arg His Gly Pro Phe100 105 110<210>233
<211>134<212>PRT<213>智人<220>
<223>人IL-5前体<400>233Met Arg Met Leu Leu His Leu Ser Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Tyr1 5 10 15Val Tyr Ala Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu20 25 30Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu35 40 45Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr50 55 60Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln65 70 75 80Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys85 90 95Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val100 105 110Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr115 120 125Glu Trp Ile Ile Glu Ser130<210>234<211>115<212>PRT<213>智人<220>
<223>加工的人IL-5<400>234Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala1 5 10 15Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg20 25 30Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile35 40 45Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr50 55 60Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp65 70 75 80Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe
85 90 95Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile100 105 110Ile Glu Ser115<210>235<211>113<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>加工的小鼠IL-5<400>235Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu1 5 10 15Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro20 25 30Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln35 40 45Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu50 55 60Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln65 70 75 80Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp85 90 95Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu100 105 110Gly<210>236<400>236000 3<210>237<400>237000 3<210>238<400>238000 3<210>239
<400>239000 3<210>240<400>240000 3<210>241<400>241000 3<210>242<211>97<212>PRT<213>智人<220>
<223>人嗜酸细胞活化趋化因子-1<400>242Met Lys Val Ser Ala Ala Leu Leu Trp Leu Leu Leu Ile Ala Ala Ala1 5 10 15Phe Ser Pro Gln Gly Leu Ala Gly Pro Ala Ser Val Pro Thr Thr Cys20 25 30Cys Phe Asn Leu Ala Asn Arg Lys Ile Pro Leu Gln Arg Leu Glu Ser35 40 45Tyr Arg Arg Ile Thr Ser Gly Lys Cys Pro Gln Lys Ala Val Ile Phe50 55 60Lys Thr Lys Leu Ala Lys Asp Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp65 70 75 80Val Gln Asp Ser Met Lys Tyr Leu Asp Gln Lys Ser Pro Thr Pro Lys85 90 95Pro<210>243<211>119<212>PRT<213>智人<220>
<223>人嗜酸细胞活化趋化因子-2<400>243Met Ala Gly Leu Met Thr Ile Val Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gly Val1 5 10 15Cys Ala His His Ile Ile Pro Thr Gly Ser Val Val Ile Pro Ser Pro20 25 30
Cys Cys Met Phe Phe Val Ser Lys Arg Ile Pro Glu Asn Arg Val Val35 40 45Ser Tyr Gln Leu Ser Ser Arg Ser Thr Cys Leu Lys Ala Gly Val Ile50 55 60Phe Thr Thr Lys Lys Gly Gln Gln Phe Cys Gly Asp Pro Lys Gln Glu65 70 75 80Trp Val Gln Arg Tyr Met Lys Asn Leu Asp Ala Lys Gln Lys Lys Ala85 90 95Ser Pro Arg Ala Arg Ala Val Ala Val Lys Gly Pro Val Gln Arg Tyr100 105 110Pro Gly Asn Gln Thr Thr Cys115<210>244<211>94<212>PRT<213>智人<220>
<223>人嗜酸细胞活化趋化因子-3<400>244Met Met Gly Leu Ser Leu Ala Ser Ala Val Leu Leu Ala Ser Leu Leu1 5 10 15Ser Leu His Leu Gly Thr Ala Thr Arg Gly Ser Asp Ile Ser Lys Thr20 25 30Cys Cys Phe Gln Tyr Ser His Lys Pro Leu Pro Trp Thr Trp Val Arg35 40 45Ser Tyr Glu Phe Thr Ser Asn Ser Cys Ser Gln Arg Ala Val Ile Phe50 55 60Thr Thr Lys Arg Gly Lys Lys Val Cys Thr His Pro Arg Lys Lys Trp65 70 75 80Val Gln Lys Tyr Ile Ser Leu Leu Lys Thr Pro Lys Gln Leu85 90<210>245<211>97<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-1<400>245Met Gln Ser Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Leu Thr Val Thr Ser1 5 10 15Phe Thr Ser Gln Val Leu Ala His Pro Gly Ser Ile Pro Thr Ser Cys20 25 30
Cys Phe Ile Met Thr Ser Lys Lys Ile Pro Asn Thr Leu Leu Lys Ser35 40 45Tyr Lys Arg Ile Thr Asn Asn Arg Cys Thr Leu Lys Ala Ile Val Phe50 55 60Lys Thr Arg Leu Gly Lys Glu Ile Cys Ala Asp Pro Lys Lys Lys Trp65 70 75 80Val Gln Asp Ala Thr Lys His Leu Asp Gln Lys Leu Gln Thr Pro Lys85 90 95Pro<210>246<211>119<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠嗜酸细胞活化趋化因子-2<400>246Met Ala Gly Ser Ala Thr Ile Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Val Ala1 5 10 15Cys Ala Cys Cys Ile Phe Pro Ile Asp Ser Val Thr Ile Pro Ser Ser20 25 30Cys Cys Thr Ser Phe Ile Ser Lys Lys Ile Pro Glu Asn Arg Val Val35 40 45Ser Tyr Gln Leu Ala Asn Gly Ser Ile Cys Pro Lys Ala Gly Val Ile50 55 60Phe Ile Thr Lys Lys Gly His Lys Ile Cys Thr Asp Pro Lys Leu Leu65 70 75 80Trp Val Gln Arg His Ile Gln Lys Leu Asp Ala Lys Lys Asn Gln Pro85 90 95Ser Lys Gly Ala Lys Ala Val Arg Thr Lys Phe Ala Val Gln Arg Arg100 105 110Arg Gly Asn Ser Thr Glu Val115<210>247<400>247000 3<210>248<400>248000 3
<210>249<400>249000 3<210>250<400>250000 3<210>251<400>251000 3<210>252<400>252000 3<210>253<400>253000 3<210>254<400>254000 3<210>255<400>255000 3<210>256<400>256000 3<210>257<400>257000 3<210>258<400>258000 3<210>259<400>259
000 3<210>260<400>260000 3<210>261<400>261000 3<210>262<400>262000 3<210>263<400>263000 3<210>264<400>264000 3<210>265<400>265000 3<210>266<400>266000 3<210>267<400>267000 3<210>268<400>268000 3<210>269<400>269000 3<210>270
<400>270000 3<210>271<400>271000 3<210>272<400>272000 3<210>273<400>273000 3<210>274<400>274000 3<210>275<400>275000 3<210>276<400>276000 3<210>277<400>277000 3<210>278<400>278000 3<210>279<400>279000 3<210>280<400>280000 3<210>281
<400>281000 3<210>282<400>282000 3<210>283<400>283000 3<210>284<400>284000 3<210>285<400>285000 3<210>286<400>286000 3<210>287<400>287000 3<210>288<400>288000 3<210>289<400>289000 3<210>290<400>290000 3<210>291<400>291000 3<210>292
<400>292000 3<210>293<400>293000 3<210>294<400>294000 3<210>295<400>295000 3<210>296<400>296000 3<210>297<400>297000 3<210>298<400>298000 3<210>299<400>299000 3<210>300<400>300000 3<210>301<400>301000 3<210>302<400>302000 3
<210>303<400>303000 3<210>304<400>304000 3<210>305<400>305000 3<210>306<400>306000 3<210>307<400>307000 3<210>308<400>308000 3<210>309<400>309000 3<210>310<400>310000 3<210>311<400>311000 3<210>312<400>312000 3<210>313<400>313000 3
<210>314<400>314000 3<210>315<400>315000 3<210>316<400>316000 3<210>317<400>317000 3<210>318<400>318000 3<210>319<400>319000 3<210>320<400>320000 3<210>321<400>321000 3<210>322<400>322000 3<210>323<400>323000 3<210>324<400>324000 3
<210>325<400>325000 3<210>326<400>326000 3<210>327<400>327000 3<210>328<211>132<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠C-IL-13-F<400>328Ala Asp Pro Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Gly Pro Val Pro1 5 10 15Arg Ser Val Ser Leu Pro Leu Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu20 25 30Ser Asn Ile Thr Gln Asp Gln Thr Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val35 40 45Trp Ser Val Asp Leu Ala Ala Gly Gly Phe Cys Val Ala Leu Asp Ser50 55 60Leu Thr Asn Ile Ser Asn Cys Asn Ala Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Ile65 70 75 80Leu His Gly Leu Cys Asn Arg Lys Ala Pro Thr Thr Val Ser Ser Leu85 90 95Pro Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala His Phe Ile Thr Lys Leu Leu Ser100 105 110Tyr Thr Lys Gln Leu Phe Arg His Gly Pro Phe Leu Glu Val Leu Ala115 120 125Ile Glu Gly Arg130<210>329<211>119<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠C-IL-13-S<400>329Leu Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Val Pro Arg Ser Val Ser1 5 10 15Leu Pro Leu Thr Leu Lys Glu Leu Ile Glu Glu Leu Ser Asn Ile Thr20 25 30Gln Asp Gln Thr Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Val Asp35 40 45Leu Ala Ala Gly Gly Phe Cys Val Ala Leu Asp Ser Leu Thr Asn Ile50 55 60Ser Asn Cys Asn Ala Ile Tyr Arg Thr Gln Arg Ile Leu His Gly Leu65 70 75 80Cys Asn Arg Lys Ala Pro Thr Thr Val Ser Ser Leu Pro Asp Thr Lys85 90 95Ile Glu Val Ala His Phe Ile Thr Lys Leu Leu Ser Tyr Thr Lys Gln100 105 110Leu Phe Arg His Gly Pro Phe115<210>330<211>133<212>PRT<213>智人<220>
<223>人C-IL-13-F<400>330Ala Asp Pro Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Gly Pro Val Pro1 5 10 15Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr20 25 30Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile35 40 45Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn50 55 60Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly65 70 75 80Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val85 90 95Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu100 105 110His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn Leu Glu Val Leu
115 120 125Ala Ile Glu Gly Arg130<210>331<211>120<212>PRT<213>智人<220>
<223>人C-IL-13-S<400>331Leu Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala1 5 10 15Leu Arg Glu Leu Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys20 25 30Ala Pro Leu Cys Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala35 40 45Gly Met Tyr Cys Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys50 55 60Ser Ala Ile Glu Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His65 70 75 80Lys Val Ser Ala Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys85 90 95Ile Glu Val Ala Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys100 105 110Leu Phe Arg Glu Gly Arg Phe Asn115 120<210>332<211>136<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠C-IL-5-E<400>332Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Gly Gly Ala Pro Ala Ser Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val Val20 25 30Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr Ser35 40 45Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro Val Pro Thr His Lys Asn His Gln Leu50 55 60Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln Thr
65 70 75 80Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu Ile85 90 95Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg100 105 110Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val Met115 120 125Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly130 135<210>333<211>134<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠C-IL-5-F<400>333Ala Asp Pro Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Met Glu Ile Pro1 5 10 15Met Ser Thr Val Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu Ser Ala His Arg20 25 30Ala Leu Leu Thr Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro Val Pro Thr His35 40 45Lys Asn His Gln Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile50 55 60Leu Lys Asn Gln Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gln65 70 75 80Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys85 90 95Gly Glu Glu Arg Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu100 105 110Phe Leu Gly Val Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly Leu Glu Val115 120 125Leu Ala Ile Glu Gly Arg130<210>334<211>121<212>PRT<213>小鼠<220>
<223>小鼠C-IL-5-S<400>334
Leu Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Met Glu Ile Pro Met Ser Thr Val1 5 10 15Val Lys Glu Thr Leu Thr Gln Leu Ser Ala His Arg Ala Leu Leu Thr20 25 30Ser Asn Glu Thr Met Arg Leu Pro Val Pro Thr His Lys Asn His Gln35 40 45Leu Cys Ile Gly Glu Ile Phe Gln Gly Leu Asp Ile Leu Lys Asn Gln50 55 60Thr Val Arg Gly Gly Thr Val Glu Met Leu Phe Gln Asn Leu Ser Leu65 70 75 80Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Arg Gln Lys Glu Lys Cys Gly Glu Glu Arg85 90 95Arg Arg Thr Arg Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly Val100 105 110Met Ser Thr Glu Trp Ala Met Glu Gly115 120<210>335<211>138<212>PRT<213>智人<220>
<223>人C-IL-5-E<400>335Ala Leu Val Gly Cys Gly Gly Pro Lys Pro Ser Thr Pro Pro Gly Ser1 5 10 15Ser Gly Gly Ala Pro Ala Ser Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser Ala20 25 30Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu Leu35 40 45Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn His50 55 60Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu Ser65 70 75 80Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu Ser85 90 95Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu Glu100 105 110Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu Gly115 120 125Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser130 135
<210>336<211>136<212>PRT<213>智人<220>
<223>人C-IL-5-F<400>336Ala Asp Pro Gly Cys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Ala Ile Pro Thr Glu1 5 10 15Ile Pro Thr Ser Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr20 25 30His Arg Thr Leu Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro35 40 45Val His Lys Asn His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile50 55 60Gly Thr Leu Glu Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu65 70 75 80Phe Lys Asn Leu Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys85 90 95Lys Cys Gly Glu Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu100 105 110Gln Glu Phe Leu Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser Leu115 120 125Glu Val Leu Ala Ile Glu Gly Arg130 135<210>337<211>123<212>PRT<213>智人<220>
<223>人C-IL-5-S<400>337Leu Ala Cys Gly Gly Gly Gly Gly Ile Pro Thr Glu Ile Pro Thr Ser1 5 10 15Ala Leu Val Lys Glu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Thr His Arg Thr Leu20 25 30Leu Ile Ala Asn Glu Thr Leu Arg Ile Pro Val Pro Val His Lys Asn35 40 45His Gln Leu Cys Thr Glu Glu Ile Phe Gln Gly Ile Gly Thr Leu Glu50 55 60Ser Gln Thr Val Gln Gly Gly Thr Val Glu Arg Leu Phe Lys Asn Leu
65 70 75 80Ser Leu Ile Lys Lys Tyr Ile Asp Gly Gln Lys Lys Lys Cys Gly Glu85 90 95Glu Arg Arg Arg Val Asn Gln Phe Leu Asp Tyr Leu Gln Glu Phe Leu100 105 110Gly Val Met Asn Thr Glu Trp Ile Ile Glu Ser115 120<210>338<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物NheIL13-F<400>338ctagctagcc gggccggtgc caagatc27<210>339<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物NheIL13-R<400>339tttctcgagg aaggggccgt ggcgaa 26<210>340<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物Spelinker3-F1<400>340ccccgccggg ttcttctggc ggtgctccgg ctagcatgga gattcccatg agcac 55<210>341<211>52<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物SpeNlinker3-F2<400>341ttttactagt tggttgcggc ggcccgaaac cgagcacccc gccgggttct tc52<210>342<211>49<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物IL5StopXho-R<400>342ttttgcggcc gcgtttaaac tcgagttatt agccttccat tgcccactc49
权利要求
1.一种组成物，其包含(a)一种病毒样颗粒；和(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其中所述抗原或所述抗原决定簇是一种IL-5、IL-13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇与所述病毒样颗粒结合。
2.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒(a)是一种重组病毒样颗粒。
3.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含选自下组的重组蛋白或其片段(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；(b)重组麻疹病毒蛋白；(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；(d)重组轮状病毒蛋白；(e)重组口蹄疫病毒蛋白；(f)重组逆转录病毒蛋白；(g)重组诺瓦克病毒蛋白；(h)重组甲病毒蛋白；(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；(j)重组多瘤病毒蛋白；(k)重组噬菌体蛋白；(l)重组RNA噬菌体蛋白；(m)重组Ty蛋白；(n)重组Qβ-噬菌体蛋白；(o)重组GA-噬菌体蛋白；(p)重组fr-噬菌体蛋白；和(q)(a)-(p)的任何一种重组蛋白的片段。
4.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。
5.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA-噬菌体的重组蛋白或其片段。
6.权利要求5的组成物，其中所述RNA-噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(j)噬菌体f2；(k)噬菌体PP7；和(l)噬菌体AP205。
7.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段。
8.权利要求1的组成物，其中所述病毒样颗粒包含RNA噬菌体fr或RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段。
9.权利要求1的组成物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与所述病毒样颗粒结合。
10.权利要求1的组成物，其中所述至少一个抗原或抗原决定簇通过至少一个共价键与所述病毒样颗粒结合，其中所述共价键是一种非肽键。
全文摘要
本发明涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明提供一种组成物，其包含有序重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是包含IL－5、IL－13或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽的阵列。更具体而言，本发明提供一种组成物，其包含一种病毒样颗粒和至少一个与之结合的IL－5、IL－13和/或嗜酸细胞活化趋化因子蛋白或肽。本发明还提供一种分别生产所述偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明的组成物可用于生产治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病的疫苗，以及预防或治疗具有嗜酸细胞成分的变应性疾病并有效诱导免疫应答、特别是抗体应答的药物疫苗。此外，本发明的组成物尤其可用于在上述疾病的情形中有效诱导自身特异性免疫应答。
文档编号A61K38/19GK101049502SQ200710105518
公开日2007年10月10日 申请日期2002年11月7日 优先权日2001年11月7日
发明者马丁·巴赫曼, 加里·詹宁斯, 伊沃·松德雷格 申请人:赛托斯生物技术公司