专利名称：一种利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，涉及一种采用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，具体涉及一种利用加热诱导抗风湿性关节炎基因在病变的关节处局部表达的方法，及其在风湿性关节炎治疗中的应用。
背景技术：
风湿性关节炎是关节炎中最常见的形式，属于全身性或称系统性疾病，主要影响上、下肢大关节，严重者可影响全身的关节。其主要病理改变是关节滑膜发炎，导致关节红、肿、痛、热，甚至关节僵直等症状。发炎的关节滑膜和滑液可侵袭并损害关节面和软骨，炎性细胞释放的酶也可消化骨和软骨，最终导致受累关节疼痛、变形和运动障碍，甚至关节僵直等。
风湿性关节炎的具体病因目前仍不清楚，然而，现已公认风湿性关节炎属于自身免疫性疾病。患者体内天然的免疫系统不能正常工作，错误攻击关节组织，导致炎症和关节损害。
风湿性关节炎的患病率很高，占全世界总人口数的1％，属致残性疾病，严重影响患者的生活，并给患者和社会造成严重的经济负担，因此，迫切需要建立新的治疗方法。
目前治疗关节炎的药物分二类，第一类药物属于对症治疗药物，主要针对疾病的炎症症状，包括NSAIDs and aspirin、analgesics、和corticosteroids等。可帮助减轻关节红、肿、疼痛；第二类药物的功效在于修正疾病的生物学组成成分，这类药物又称为修正疾病的抗风湿药物(disease-modifyingantirheumatic drugs，DMARDs)，包括低剂量的methotrexate，leflunomide，D-Penicillamine，sulfasalazine，gold therapy，minocycline，azathioprine，hydroxychloroquine(and other antimalarials)，cyclosporine等。
新型DMARDs类药物主要针对与风湿性关节炎相关的炎性细胞因子(pro-inflammatory cytokines)，通常这类药物都是蛋白质类药物，采用现代生物学技术生产。其中某些药物是针对肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素1(IL-1)的，因为研究发现，患风湿性关节炎的患者血清中这二种细胞因子总是表达上调或增加。针对这些细胞因子的蛋白类药物通常是可溶性受体、抗体或其他的拮抗剂，可显著抑制炎性细胞因子的活性。
尽管上述蛋白类药物在治疗风湿性关节炎方面疗效确切，但却存在副作用。主要是因为这些细胞因子如TNF-α、IL-1也是调控机体防御机制、有效对抗细菌或病毒感染的细胞因子。长期用药可发生细菌或病毒感染等副作用。此外，这类药物要求每周多次静脉给药，因此，不仅昂贵也不方便，特别是在发展中国家，国民的经济状态很难承受这类治疗。
与上述蛋白类药物相比，基因治疗因其采用病毒或非病毒载体将编码治疗蛋白的基因输送到病变部位，由患者自身的细胞负责产生治疗蛋白，有更多的优点。基因治疗最大的优点是治疗基因可持续表达较长时间，不必频繁或重复给药。目前的生物学技术已经发展到单次应用或注射基因载体即可获得数周、数月甚至数年的治疗基因表达。所采用的载体包括慢病毒、腺相关病毒和裸DNA等。
基因治疗的另一个优点是，既使已将载体注射到体内后，仍可以根据病情启动或关闭治疗基因的表达。因此，在获得理想的治疗效果的同时，又避免了副作用的发生。
目前能够启动和关闭基因表达的最有效的“开关”是热休克蛋白基因的启动子，热休克蛋白基因是哺乳动物细胞内受调控最强的基因。热休克蛋白具有包括下述功能在内的多种功能。如热休克蛋白是护送新合成的蛋白质到达它们的亚细胞部位的护卫者；是一种应激反应蛋白，当细胞遇到热应激、化学应激、外源微生物感染等环境应激时便被激活表达。
热休克蛋白的最突出的特征是当温度超过正常生理温度5-6℃时其表达可上调数千倍，此时细胞中90％以上的蛋白合成器都转而产生热休克蛋白。现已十分明确，热休克蛋白的调控主要发生在转录水平，位于热休克蛋白基因5’端的启动子起着关键作用。热休克蛋白启动子是哺乳动物细胞中最强的启动子之一，为调控治疗基因表达提供了最佳的选择。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，具体涉及采用加热调控抗炎基因在病变的关节局部表达，减轻风湿性关节炎的症状，控制病变的进展。本发明方法可使抗炎基因的表达严格受到控制，在有效控制关节炎症状的同时也可避免因基因持续表达特别是全身表达可能带来的毒、副作用。
为了达到上述目的，本发明利用热休克蛋白基因5’端调控顺序作为启动子，置于抗炎基因上游，构建人工基因，通过局部加热使热休克蛋白基因的启动子控制治疗基因表达。由于肌肉或关节的加热可通过非常简单的装置如热垫等实现。因此，治疗基因表达的调控十分容易达到。
首先构建人工基因。人工基因以热诱导表达基因如热休克蛋白基因的5’端调控顺序作为启动子，治疗基因为多种编码抗炎基因的cDNA，为保证在真核细胞中有效表达，还加入了多聚腺苷尾。这一结构又称表达盒。然后将表达盒插入到病毒或非病毒载体中，再将含有表达盒的载体直接注射到发炎的关节或其周围组织中。对关节及其周围组织进行加热，使关节及其周围组织温度升高3℃以上，激活热休克蛋白基因启动子，刺激抗炎基因表达。
本发明所使用的热休克蛋白基因启动子包括但不限于下述基因Hsp70、Hsp70B。
本发明所使用的抗炎基因包括但不限于下述基因IL-1拮抗基因、IL-1可溶性II型受体、TNF-α的抗体或可溶性受体(sTNFRI)、IL-4、IL-10、vIL-10、VEGF的可溶性受体如sFlk、Flt等。上述基因可单独使用或组合使用。
本发明所使用的加热方法可以是微波、射频、高强度超声、或简单的热垫、红外加热灯等。
本发明经动物实验证实，局部加热、加热诱导的热休克蛋白表达以及加热诱导的治疗基因表达的结合，对于减轻风湿性关节炎的症状和并发症效果明显。
本发明的技术方案通过下述方法和步骤施行，1.采用PCR或其他的方法分离并克隆人热休克蛋白基因的5’端调控顺序；2.克隆所选择的抗炎基因cDNA；3.将抗炎基因cDNA置于热休克蛋白基因启动子之下，构建人工基因；4.将带有polyA尾的人工基因插入到病毒或非病毒载体中，所述的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒或慢病毒，非病毒载体包括裸质粒DNA或脂质体-质粒DNA复合物等；5.将载体注入到关节内或关节周围的组织中，上述人工基因通过病毒或非病毒载体传输到风湿性关节炎病变关节局部；所述的基因传输方式，包括病毒与非病毒载体，病毒载体包括腺相关病毒、慢病毒，非病毒载体包括单独使用质粒DNA或称裸DNA，或采用质粒DNA与脂质体、多聚基质、金属颗粒及电穿孔技术结合使用。
6.对注射病毒的组织进行加热，加热方式可采用热垫、微波、射频或/和局部超声等方法。对于不同的病人应根据疾病的严重程度和健康状态决定加热的时间和次数。
图1是热诱导抗炎症基因表达概念图，图2为人体内热诱导抗炎症基因表达实施示意图。
图3为加热调控的phsp-sTNFRII-Fc表达载体构建示意图。
图4是经过sTNFRI-Fc或白介素10腺相关病毒感染后，加热前后小鼠静脉血中sTNFRI-Fc和白介素10浓度测定结果。
具体实施例方式
实施例1携带热调控的TNF-a可溶性受体II的腺相关病毒的制作方法及体内表达的诱导。
实施步骤1.PCR扩增hsp70B基因启动子以HEK-293细胞DNA作为模板，采用下述引物，PCR扩增hsp70B基因5’端调控顺序。PCR扩增条件为94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，25个周期。PCR产物长420bp，测序结果显示具有序列1的序列。
hsp70B上游引物5’-GGTCGAGGCGCGTCCTCAGAGCCA-3’hsp70B下游引物5’-AGGTCGACTAGAAGCTTCTTGTCG-3’2.加热调控的GFP表达载体的构建将PCR产物先插入TA cloning载体pCR-Blunt(Invitrogen公司)内，再经限制性内切酶EcoRI消化后，分离420bp的EcoRI片段，然后连接到载体pEGFP-1(Clontech，Palo Alto，CA)的多克隆位点的EcoRI位点，构建phsp-EGFP表达载体。
3.以PCR为基础的抗炎基因sTNFRII-Fc的分离克隆以人淋巴细胞的RNA作为模板，逆转录合成cDNA，再采用下述引物，PCR扩增编码人TNF-α受体II细胞外结构域的基因片段。PCR扩增条件为94℃ 1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，25个周期。PCR产物长768bp，测序结果显示具有序列2的序列。
TNF-α受体II上游引物5’-atggcgcccgtcgccgtctg-3’TNF-α受体II下游引物5’-gccagtgctcccttcagctg-3’
以人淋巴细胞的RNA作为模板，逆转录合成cDNA，采用下述引物，PCR扩增编码人免疫球蛋白IgGl Fc段基因片段。其中IgGl Fc段上游引物包含TNF-α受体II下游引物的部分顺序，即二者间有20个碱基相互重叠。PCR扩增条件为94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，25个周期。PCR产物长704bp，测序结果显示具有序列3的序列。
IgG Fc段上游引物5’-cagctgaagggagcactggcgggcatgtgtgagttttgtc-3’IgG Fc段下游引物5’-tcatttacccggagacaggg-3’将人TNF-α受体II细胞外结构域的PCR产物与人免疫球蛋白IgGl Fc段PCR产物混合，作重叠PCR反应(overlaping PCR)，获得sTNFRII-Fc融合基因，长度为1452bp，测序结果显示具有序列4的序列。
本发明所述的PCR反应采用高保真DNA聚合酶pfu。
4.加热调控的sTNFRII-Fc融合基因表达载体的构建用限制性内切酶Sal I和Not I消化phsp-EGFP表达载体，用pfu作PCR反应使酶切位置处补齐后，琼脂糖凝胶电泳，去除EGFP基因片段，分离获得载体DNA。将载体DNA与sTNFRII-Fc融合基因片段连接，构建phsp-sTNFRII-Fc表达载体。限制性内切酶消化鉴定插入方向，筛选正向插入克隆。其中sTNFRII-Fc取代了phsp-EGFP表达载体的EGFP编码基因。phsp-sTNFRII-Fc结构示意图见附图3、4、5。
5.构建sTNFRII-Fc腺相关病毒穿梭质粒用限制性内切酶Xho I和Afl II消化phsp-sTNFRII-Fc表达载体，用pfu作PCR反应使酶切位置处补齐，腺相关病毒穿梭质粒pAAV-MCS用NotI处消化，pfu补齐，将含有HSP启动子、抗炎基因sTNFRII-Fc及SV40 polyA尾的人工基因与腺相关病毒穿梭质粒pAAV相连，构建腺相关病毒穿梭质粒pAAV-hspsTNFRIIFc。
6.腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc的包装在脂质体的介导下，将腺相关病毒穿梭质粒pAAV-hspsTNFRIIFc与辅助质粒pHelper和pAAV-RC(均从Stratagene公司购入)共同转染HEK293细胞。其中辅助质粒pAAV-RC包含编码腺相关病毒的外壳(cap)及复制(rep)蛋白的编码基因，而pHelper包含腺病毒帮助腺相关病毒复制的基因。
7.腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc的扩增与纯化腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc的扩增在HEK293细胞内完成后。其纯化采用Stratagene公司手册所建议的方法。
8.腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc滴度的检测腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc的滴度用病毒颗粒数表示，方法采用实时定量PCR。
9.腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc在小鼠体内受加热调控表达将腺相关病毒AAV-hspsTNFRIIFc颗粒注射到Balb/C小鼠右后腿膝关节附近的肌肉组织内，注射七天后将右后腿浸入42℃水浴中，加热30min。左后腿膝关节附近不注射只加热或同样注射但不加热作为对照。加热后不同时间点采用ELISA方法(利用从美国R&D公司购来的试剂盒)检测小鼠血清及组织中TNFRIIFc的含量。
10.热诱导肿瘤坏死因子(TNF-α)可溶性受体和白介素10在小鼠体内表达采用遗传工程的方法，将人类肿瘤坏死因子(TNF-α)二型的可溶性受体编码基因(sTNFRII)与人类免疫球蛋白IgG的固定区融合起来，组成融合基因(sTNFR-Fc)，以提高sTNFRII在体内的逗留时间。在融合基因的上游加入hsp70基因5’端调控顺序，构建人工基因表达盒。在此基础上，进一步将hsp-sTNFRI-Fc引入重组腺相关病毒基因组中，然后将腺相关病毒扩增纯化并定量。然后将定量后的腺相关病毒注射到小鼠右后腿部肌肉中。24小时后，将小鼠右腿浸入42℃恒温水浴中加热60分钟。48小时后，取小鼠尾静脉血，用ELISA方法检测小鼠血清中sTNFRII-Fc的浓度。对于白介素10，腺相关病毒的构建和检测方法与sTNFRII一致。
李川源.txtSEQUENCE LISTING<110>李.川源黄，倩<120>一种利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法<130>FD2005001<160>4<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>420<212>DNA<213>human<400>1ggtcgaggcg cgtcctcaga gccagccggg aggagctaga accttccccg cgtttctttc60agcagccctg agtcagaggc gggctggcct ggcatagccg cccagcctct cggctcacgg120cccgatccgc ccgaaccttc tcccggggtc agcgccgcgc tgcgccgccc ggctgactca180gcccgggcgg gcgggcggga ggctctcgac tgggcgggaa ggtgcgggaa ggttcgcggc240ggcggggtcg gggaggtgca aaaggatgaa aagcccgtgg aagcggagct gagcagatcc300gagccgggct ggcggcagag aaaccgcagg gagagcctca ctgctgagcg cccctcgacg360gcggagcggc agcagcctcc gtggcctcca gcatccgaca agaagctctc tagtcgacct420<210>2<211>768<212>DNA<213>human<400>2atggcgcccg tcgccgtctg ggccgcgctg gccgtcggac tggagctctg ggctgcggcg 60cacgccttgc ccgcccaggt ggcatttaca ccctacgccc cggagcccgg gagcacatgc 120cggctcagag aatactatga ccagacagct cagatgtgct gcagcaagtg ctcgccgggc 180caacatgcaa aagtcttctg taccaagacc tcggacaccg tgtgtgactc ctgtgaggac 240agcacataca cccagctctg gaactgggtt cccgagtgct tgagctgtgg ctcccgctgt 300agctctgacc aggtggaaac tcaagcctgc actcgggaac agaaccgcat ctgcacctgc 360aggcccggct ggtactgcgc gctgagcaag caggaggggt gccggctgtg cgcgccgctg 420cgcaagtgcc gcccgggctt cggcgtggcc agaccaggaa ctgaaacatc agacgtggtg 480tgcaagccct gtgccccggg gacgttctcc aacacgactt catccacgga tatttgcagg 540ccccaccaga tctgtaacgt ggtggccatc cctgggaatg caagcaggga tgcagtctgc 600acgtccacgt cccccacccg gagtatggcc ccaggggcag tacacttacc ccagccagtg 660tccacacgat cccaacacac gcagccaact ccagaaccca gcactgctcc aagcacctcc 720ttcctgctcc caatgggccc cagcccccca gctgaaggga gcactggc 768<210>3<211>684<212>DNA<213>human<400>3gacaaaactc acacatgccc accgtgccca gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc60
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李川源.txttgctccgtga tgcatgaggc tctgcacaac cactacacgc agaagagcct ctccctgtct 1440ccgggtaaat ga 145权利要求
1.一种利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，其特征是采用热诱导表达基因的5’端调控顺序作为启动子，构建人工基因，调控一个或多个抗炎基因在局部表达，包括下述步骤，1)用PCR或其他的方法分离并克隆人热休克蛋白基因的5’端调控顺序；2)克隆所选择的抗炎基因cDNA；3)抗炎基因cDNA置于热休克蛋白基因启动子之下，构建人工基因；4)将带有polyA尾的人工基因插入到病毒或非病毒载体中，所述的病毒载体包括腺病毒、腺相关病毒或慢病毒，非病毒载体包括裸质粒DNA或脂质体-质粒DNA复合物；5)将载体注入到关节内或关节周围的组织中，上述人工基因通过病毒或非病毒载体传输到风湿性关节炎病变关节局部；6)上述病变局部进行加热。
2.按权利要求1所述的利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，其特征是所述的热诱导表达基因的调控顺序来源于热休克蛋白基因hsp70B。
3.按权利要求1所述的利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，其特征是所述的抗炎基因包括下列一种或多种基因的组合，包括TNF-α的可溶性受体、干扰素1的可溶性受体、细胞因子IL-4、IL-10和vIL10。
4.按权利要求1中的所述的利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，其特征是所述的基因传输方式，包括病毒与非病毒载体，病毒载体包括腺相关病毒、慢病毒，非病毒载体包括单独使用质粒DNA或称裸DNA，或采用质粒DNA与脂质体、多聚基质、金属颗粒及电穿孔技术结合使用。
5.按权利要求1中的所述的利用加热诱导抗炎基因在局部表达的方法，其特征是所述的加热方式可采用热垫、微波、射频或/和局部超声方法。
全文摘要
本发明属于生物医学领域，采用局部加热调控抗风湿性关节炎基因只在病变关节局部表达，并可根据许要需要启动或关闭基因的表达。本发明建立了一种易于操作的、在时间和空间方面可调控的基因表达方式，用于控制或治疗风湿性关节炎，而没有明显的全身毒副作用。本发明以构建携带人工基因表达盒的病毒或非病毒载体为基础，通过局部加热调控基因表达来实现。所述人工基因表达盒采用热诱导基因5端调控顺序作为启动子，置于治疗基因上游，调控治疗基因表达。
文档编号A61P29/00GK1683017SQ200510024068
公开日2005年10月19日 申请日期2005年2月25日 优先权日2005年2月25日
发明者李川源, 黄倩 申请人:李川源, 黄倩