一种治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物及制备方法

专利名称：一种治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物；具体地说是以中草药为原料制备的中成药；另外本发明还涉及该药物的制备方法。
背景技术：
胆汁淤积是胆汁生成障碍以及流动停滞或受抑，临床上以黄疸、瘙痒和血清碱性磷酸酶增高为特征；在许多胆汁淤积相关的人类肝脏疾病中，有不同程度和方式的胆管上皮细胞增生。如1.原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)是引起成人慢性淤胆最常见的疾病之一，其中期病理特征是汇管区胆管损害导致其周围胆小管反应性增生，并可向肝实质延伸，增生的胆小管互相交叉吻合，管腔多发育不全，有的仅见一层扁平或柱状上皮(Desmet VJ，Roskams T，Van Eyken P.Ductular reaction in the liver.Pathol ResPract，1995，191513-24.)。2.原发性硬化性胆管炎(Primary sclerosing Cholangitis)也是一种慢性胆汁淤积性疾病，其病变可累及肝外和/或肝内胆管，表现为胆管壁的增厚和胆管狭窄，肝脏组织病理学特点为胆管的纤维化和炎症及小胆管的增生。慢性肝炎、肝硬化及胆道梗阻患者肝组织活检标本，发现肝小叶周围、纤维隔、肝硬化小节节边缘部常见增生的胆小管、小胆管样上皮细胞及胆管样排列的小肝细胞和肝细胞，这些细胞周围总是伴随基底膜增厚、胶原纤维增多，甚至完全纤维化(洪明理，黄向红，李云生，等.实验胆汁性肝硬化形成机制的病理研究.首都医科大学学报，1996，17(1)36-39.)。药物性性胆汁淤积主要影响小胆管的上皮细胞。肝纤维化是多种慢性肝脏疾病共有的病理改变，是慢性肝炎发展之肝硬化的必经病理过程。
熊去氧胆酸为治疗胆汁淤积、尤其是原发性胆汁性肝硬化早期的有效药物，对中后期病变的效果有限，对其他慢性肝炎、肝硬化的胆汁淤积并无明确的治疗效果。以茵陈、栀子、大黄等为主的中药制剂为传统的治疗药物，但均有一定的局限性。化学及生物药物中尚无明确疗效的抗肝纤维化治疗药物。

发明内容
本发明的目的是在于提出一种能有效改善肝脏胆汁淤积、抗肝损伤、逆转肝纤维化的药物。
本发明的另一目的是提供该药物的制备方法。
本发明的药物(以下称“芪甘通”)是由下列组分制成的(用量为重量份)黄芪300-900甘草100-300大枣100-300制备本发明药物的配方优先重量(份)配比范围是黄芪400-800甘草150-250大枣150-250本发明药物的最佳重量(份)配比是黄芪600甘草200大枣200将上述各组分制成本发明药物的方法是将黄芪、甘草细碎，与大枣一起加水10倍量，浸泡2小时，煎煮30分钟，滤过取汁；药渣加水8倍量，煎煮1小时，滤过取汁，浓缩干燥成干膏，混合粉碎，压片，即可得治疗胆汁淤积、肝纤维化的膏剂药品。
上述膏剂也可再加工成类似饼干大小的固体块状剂型，此时需要再添加适量的粘结剂，在负压下压制成型，干燥并以真空方式包装，即可得到膨松的块状剂型。
我们综合评价针对肝硬化证候病机的不同治法例方干预大鼠胆汁淤积性肝纤维化、四氯化碳大鼠肝纤维化以及二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化的作用研究中发现，“芪甘通”对上述3种动物模型均显示出改善胆汁淤积及减轻肝组织纤维化的作用，对胆管上皮细胞增殖这—慢性肝病常见的病理变化具有显著抑制作用。


图1是肝组织HE染色(上)及胶原染色(下)照片；图2是肝组织LM免疫组织化学照片。
图3是肝组织FN免疫组织化学照片。
图4是肝组织Col I免疫组织化学照片。
图5是肝组织Col VI免疫组织化学照片。
图6是肝组织α-SMA免疫组织化学照片。
图7是透射电镜下大鼠肝组织超微结构的变化照片。
图8是肝组织PCNA免疫组织化学照片。
图9是肝组织天狼猩红胶原染色照片。
具体实施例方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1将黄芪600克、甘草200克细碎，与大枣200克一起加水10千克，浸泡2小时，煎煮30分钟，滤过取汁；药渣加水8千克，煎煮1小时，滤过取汁，浓缩干燥成干膏，混合粉碎，压片，即制得“芪甘通”干浸膏309克。
实施例2黄芪300克、甘草300克、大枣300克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏280克。
实施例3黄芪500克、甘草300克、与大枣200克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏313克。
实施例4黄芪500克、甘草100克、大枣300克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏274克。
实施例5将黄芪400克、甘草150克、大枣250克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏240克。
实施例6黄芪800克、甘草150克、大枣250克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏371克。
实施例7黄芪600克、甘草300克、大枣100克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏301克。
实施例8黄芪700克、甘草200克、大枣300克，按照实施例1所述的方法制得“芪甘通”干浸膏352克。
实施例I(“芪甘通”防治胆汁性大鼠肝纤维化)1 实验药物实施例1-8任一项制备获得“芪甘通”干浸膏。
2 实验动物SD大鼠，雄性，清洁级，体重200±20g，购自中国科学院上海实验动物中心。
3 实验方法3.1 模型制备选用清洁级雄性SD大鼠(200±20g)，沿腹正中线切开，暴露胆总管，逆行向肝门部注入硬化剂，远近端结扎胆总管，中间剪断，关腹。假手术仅开腹并游离胆总管后关腹。
3.2 给药方法及剂量造模一周后随机分为模型对照组和药物干预组，药物干预经口灌胃(干浸膏加入蒸馏水溶解)，模型对照组给予等量生理盐水。灌胃剂量1ml/100g(相当于65kg体重成人每公斤剂量的8倍)。干预用药4周后杀鼠取材。
3.3 样品的采集和处理用药4周结束后，大鼠用2％戊巴比妥钠以2ml/kg体重剂量腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，打开腹腔，观察大体情况，肝脾的色、质、形态、体积及腹水情况。经下腔静脉采血，摘取肝、脾，称重后，获取0.3-0.4cm厚肝组织，OTC液包埋，液氮迅速冷冻，-70℃保存，用于制备冰冻切片；于肝右侧厚叶切取1.0×0.8×0.3cm大小肝组织2块，10％中性福尔马林固定，自动脱水机逐级酒精脱水、二甲苯透明，包埋、切片4um厚，用于HE及胶原染色，观察组织的病理变化，肝组织纤维化程度，并制定肝组织胶原纤维增生程度的半定量判断标准及胶原沉积的图像半定量分析。
3.4 肝功能检测血清丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase，ALT)活性，血清门冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase，AST)，赖氏法(Rriman-Frankel)；血清总胆红素(Totalbilirubin，T-BIL)，J-P法；血清白蛋白(Albumin，Alb)含量溴甲酚绿法(BBG)；血清总蛋白(Total protein，TP)含量双缩脲比色法；采用卫生部上海生物制品研究所试剂盒说明书测定；血清碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyltranspetidase，γGT，GGT)按照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书测定；总胆汁酸(TBA美国AEROSET公司，Abbott全自动生化仪)。
3.5 肝组织羟脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)含量测定Jamall氏法(Jamall IS，Finelli VN，Que Hee SS.A simple method to determine nanogram levels of 4-hydroxyproline in biological tissues.AnalBiochem 1981；11270-75.)。
3.6 肝组织染色常规HE染色；天狼猩红胶原纤维染色3.7 免疫组织化学染色(两步法)PBS(pH7.4)作空白对照染色。
免疫组化图像半定量分析采用HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文分析系统，免疫组化染色切片每组各取3张，随机选择5个不同视野，在20×10放大倍数下，测定计算阳性区域与标准测量窗口的面积比。
3.8 PCNA阳性染色细胞计数PCNA判定以细胞核呈界限清楚的棕色反应为阳性。每组各取3张免疫组化片，低倍镜(×100)下观察并确定有代表性PCNA染色阳性视野，后在高倍镜(×400)每个视野分别计数PCNA阳性胆管上皮细胞和肝细胞，每张组织片观察5个视野，取其阳性细胞计数均数进行统计分析。
3.9 胆管上皮细胞Procollα1(IV)、PDGF-B、CTGF、TGF-β1mRNA的检测对冰冻切片进行HE染色后采用LCM显微切割仪切割胆管上皮细胞。每组取3只大鼠的肝组织片，切割胆管上皮细胞1,000个，计算机自动计数，在eppendorf的帽子上加5-7μl的RLT溶液，将胆管上皮细胞收集到帽子上，加入RLT100μl混匀，低温离心。
胆管上皮细胞mRNA表达的实时荧光定量PCR法检测提取胆管上皮细胞的总RNA，并反转录为cDNA，然后进行实时荧光PCR定量。
4 实验结果4.1 各组大鼠存活率、腹水出现率、体重、肝脏与脾脏重量、肝/体重比值、脾/体重比值及门静脉直径等一般状况的变化如表1.1、表1.2所示。
自造模开始观察至5周末，模型对照组死亡率为41％，“芪甘通”组为56.3％；5周末假手术对照组大鼠均未见明显腹水，腹水发生率模型对照组为90％，”芪甘通”组为29％(2只均为少量腹水)，显著低于模型对照组(P＜0.05)；模型对照组大鼠的门静脉直径较假手术对照组显著增加(P＜0.01)，“芪甘通”组有所减小，但与模型对照组比较无显著性差异(P＞0.05)。结果见表1.1所示。
表1.1 各组大鼠死亡率、腹水发生率及门脉直径的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*，P＜0.05与假手术对照组比较，模型对照组大鼠体重显著减轻，肝、脾重量及肝/体重比值与脾/体重比值的显著增加(P＜0.01)。与模型对照组比较，”芪甘通”组的肝重、脾重、肝/体重比值及脾/体重比值均显著降低(P＜0.05)。结果见表1.2。
表1.2.各组大鼠体重、肝重、脾重、肝/体重比及脾/体重比的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*，P＜0.05；**，P＜0.014.2 各组大鼠肝功能的变化与假手术对照组比较，模型对照大鼠的血清TBiL含量(均值为假手术对照组大鼠的22倍)，TBA含量、ALP、GGT、AST、ALT活性均显著增高(P＜0.01)；Alb含量显著降低(P＜0.01)。与模型对照大鼠比较，“芪甘通”干预组大鼠的血清TBiL，TBA含量、ALP、GGT、AST、ALT活性均显著降低(P＜0.05)，Alb含量、A/G比值显著升高；结果见表1.3、表1.4所示。
表1.3.各组大鼠血清TBil、TBA含量及ALP、GGT活性的变化(x±s)

注与模型对照组比较，**，P＜0.01；*，P＜0.05表1.4 各组大鼠血清ALT、AST活性及Alb含量、A/G比值的变化(x±s)

注与模型对照组比较，**，P＜0.01；*，P＜0.054.3 肝组织病理学变化4.3.1 HE染色假手术对照组大鼠肝小叶结构清晰。模型对照组大鼠肝内小胆管大量增生，增生的胆管呈花环样，胆管上皮细胞周围有较多的细胞外基质沉积；炎症及坏死均不明显，肝组织内肝细胞比例明显减少，肝细胞的形态结构尚正常。与模型对照组比较，“芪甘通”组胆小管增生显著减少，肝细胞数量较多(图1)。“芪甘通”组胆管增生程度显著低于模型对照组(P＜0.05)，结果见表1.5所示。
表1.5 各组大鼠肝组织胆管增生程度变化

天狼猩红染色假手术组仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维。模型对照组大鼠大量增生胆管上皮细胞周围有密集的胶原纤维沉积；肝实质内有少量的细胞外基质沉积。增生的胆管周围有密集的胶原纤维形成间隔，与临近增生的间隔互相连接、包绕、分割肝组织而形成假小叶。与模型对照组比较，“芪甘通”组大鼠的胶原纤维沉积显著减少；肝组织纤维化程度计分评定结果显示，“芪甘通”组肝组织纤维化程度显著低于模型对照组比较(P＜0.05)，结果如图1所示、表1.6所示。
表1.6.各组大鼠胆汁性肝纤维化程度评分变化(x±s)

注与模型对照组比较，#，P＜0.001；*，P＜0.054.4 大鼠肝组织Hyp含量的变化肝组织Hyp含量在模型对照组大鼠显著增高(P＜0.01)，为假手术对照组大鼠的4倍；”芪甘通”组显著低于模型对照组(P＜0.05)，结果见表1.7所示。
表1.7.各组大鼠肝组织Hyp含量的变化(x±s)

注与模型对照组比较，**，P＜0.01；*，P＜0.054.5 免疫组织化学观察4.5.1 大鼠肝组织LM表达的变化假手术对照组大鼠肝组织内LM仅见于血管和大胆管周围，肝窦内不明显。模型对照组大鼠在增生的胆管周围LM表达显著增加。“芪甘通”组的LM阳性染色显著低于模型对照组(P＜0.05)，结果如图2所示、表1.8所示。
表1.8 各组大鼠肝组织LM免疫组化图像分析的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*，P＜0.05；#，P＜0.0014.5.2 大鼠肝组织FN表达的变化假手术对照组大鼠肝组织中FN在肝窦内呈连续表达，在血管周围也有阳性染色。模型对照组FN除在肝窦内有阳性染色外，强烈地表达于增生的胆管周围。与模型对照组比较，“芪甘通”组阳性染色面积显著低于模型对照组(P＜0.05)，结果如图3所示、表1.9所示。
表1-9 各组大鼠肝组织FN免疫组化图像分析的变化(x±s)

注与模型对照组比较，#，p＜0.001，*，P＜0.05；4.5.3 大鼠肝组织I型胶原表达的变化假手术对照组Col I在血管壁有轻度阳性染色。模型对照组大鼠肝组织实质内的Col I阳性染色增强，增殖的胆管上皮细胞周围未见明显阳性染色。“芪甘通”组染色面积显著低于模型对照组(P＜0.05)。结果如图4、表1.10所示。
表1-10.各组大鼠肝组织Col I免疫组化图象分析的变化(x±s)

注与模型对照组比较，#，P＜0.001；*，P＜0.054.5.4 大鼠肝组织IV型胶原表达的变化假手术对照组大鼠肝脏Col IV主要存在于大血管壁和胆管壁，肝窦壁呈连续弱阳性表达。与假手术对照组大鼠相比，模型对照组大鼠肝组织肝窦壁Col IV表达未见明显变化，但强烈表达于增殖的胆管上皮细胞周围。“芪甘通”组大鼠肝组织内Col IV染色面积显著低于模型对照组(P＜0.05)，结果如图5所示、表1.11所示。
表1.11 各组大鼠肝组织Col IV免疫组化图象分析的变化(x±s)

注与模型对照组比较，#，P＜0.001；*，P＜0.054.5.5 大鼠肝组织α-SMA表达的变化假手术对照组大鼠肝脏α-SMA阳性染色仅见于血管壁，肝小叶内未见阳性灶。模型对照组大鼠α-SMA阳性染色见于汇管区周围的肌成纤维细胞上，且这些肌成纤维细胞围绕在增生的胆管上皮细胞周围。“芪甘通”组大鼠肝脏α-SMA染色阳性灶显著少于模型对照组(P＜0.05)，结果如图6所示、表1.12。
表1.12 各组大鼠肝组织α-SMA免疫组化图象分析的变化(x±s)

注与模型对照组比较，#，P＜0.001；*，P＜0.054.6 透射电镜下大鼠肝组织超微结构的变化假手术对照组大鼠肝细胞和胆管上皮细胞内无淤胆，胆管上皮细胞周围少有成纤维细胞，胆管腔内微绒毛较多，无胆栓，胆管上皮细胞周围有少许胶原纤维。模型对照组大鼠肝细胞和增生的胆管上皮细胞胞浆内淤胆，管腔内有较多的胆栓形成，微绒毛减少，胆管上皮细胞周围有大量的胶原沉积和成纤维细胞聚集。“芪甘通”组大鼠胆管上皮细胞周围成纤维细胞的聚集较少，肝细胞和胆管上皮细胞内淤胆轻，胆管上皮细胞周围胶原纤维沉积较少(如图7所示，图中A正常胆管上皮细胞周围有少量胶原沉积；B.模型对照组胆管周围大量ECM沉积；C.芪甘通组胆管周围ECM沉积较少)。
4.7 大鼠肝组织PCNA表达的变化增殖性细胞核抗原(PCNA)表达于新增生细胞的胞核内，是新增生细胞的特异性标记，以PCNA阳性计数增生的BEC和肝细胞。
4.7.1 大鼠肝组织内PCNA阳性肝细胞数的变化与假手术对照组大鼠比较，模型对照组大鼠肝组织内PCNA阳性肝细胞计数显著减少(P＜0.001)，为假手术对照组的11.2％；与模型对照大鼠相比，“芪甘通”组大鼠PCNA阳性肝细胞计数显著增多(P＜0.05)；如图8所示、表1.13所示。
4.7.2 各组大鼠肝组织PCNA阳性胆管上皮细胞计数的变化与假手术对照组大鼠比较，模型对照组大鼠肝组织PCNA阳性胆管上皮细胞数显著增多(照片P＜0.001)；“芪甘通”组大鼠PCNA阳性胆管上皮细胞数较模型对照组大鼠显著减少(P＜0.05)；结果见表1.13。
表1.13 PCNA阳性肝细胞计数变化分析(x±s)


注与模型对照组相比，*，P＜0.001；**，P＜0.054.8 胆管上皮细胞Procollagen α1(IV)、PDGF-B、CTGF及TGF-β1mRNA表达量的变化4.8.1 胆管上皮细胞Procollagen α1(IV)mRNA表达量的变化Procollagen α1(IV)mRNA在假手术对照组大鼠胆管上皮细胞有微量表达，而模型大鼠胆管上皮细胞的表达量显著增高(P＜0.001)，为假手术对照大鼠的16倍；“芪甘通”组大鼠胆管上皮细胞的表达量显著低于模型对照大鼠(P＜0.01)，降至模型对照大鼠的31％。各组大鼠胆管上皮细胞表达Procollagen α1(IV)mRNA量的结果见表1.14所示。
表1.14 各组大鼠胆管上皮细胞Procollagen α1(IV)mRNA表达量的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*，P＜0.001；**，P＜0.014.8.2 各组大鼠胆管上皮细胞表达CTGFmRNA量的变化假手术对照组大鼠胆管上皮细胞有微量CTGF mRNA表达，模型对照组大鼠胆管上皮细胞表达CTGF mRNA的量显著增高(P＜0.001)，为假手术对照大鼠的9倍；与模型对照组大鼠比较，“芪甘通”组大鼠胆管上皮细胞表达CTGF mRNA的量显著降低(P＜0.01)，为模型对照大鼠的26％。各组大鼠胆管上皮细胞表达CTGF mRNA量的结果见表1.15所示。
表1.15.各组大鼠胆管上皮细胞表达CTGF mRNA量的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*，P＜0.001；**，P＜0.01；
4.8.3 各组大鼠胆管上皮细胞表达TGF-β1mRNA量的变化假手术对照组大鼠胆管上皮细胞有少量TGF-β1mRNA表达，模型对照组大鼠胆管上皮细胞表达TGF-β1mRNA的量显著增高(P＜0.001)，为假手术对照大鼠的4.3倍；与模型对照大鼠比较，“芪甘通”组大鼠胆管上皮细胞表达TGF-β1mRNA的量显著降低(P＜0.01)，各组大鼠胆管上皮细胞表达TGF-β1mRNA量的结果见表1.16所示。
表1.16.各组大鼠胆管上皮细胞表达TGF-β1mRNA量的变化(x±s)

注与模型对照组比较，*，P＜0.001；*，P＜0.01；5 结论“芪甘通”能有效地抑制胆管阻塞性肝纤维化大鼠的胆管增生及增生胆管上皮细胞的病理变化，抑制肝纤维化的发展。
实施例II(“芪甘通”抑制四氯化碳大鼠肝纤维化进展的作用)1 实验药物实施例1-8任一项制备获得“芪甘通”干浸膏。
2 实验动物与试剂Wistar大鼠，雄性，44只，清洁级，体重170-230g，购自中国科学院上海实验动物中心。上海中医药大学实验动物中心饲养。四氯化碳(CCl4、批号20021219)、橄榄油均购自中国医药集团上海化学试剂公司。
3 实验方法3.1 模型的制备以橄榄油稀释CCl4为50％浓度，以2ml.kg-1剂量腹部皮下注射，每周2次，共12w。
3.2 模型的分组与给药造模第8w后，随机取6只模型组大鼠作用药前观察。并将其余大鼠按完全随机的方法分为模型对照组14只、“芪甘通”组12只。于第9周第1天起，“芪甘通”组给于“芪甘通”浸膏溶液经口灌胃，药物用量同实验一，共计4周。正常对照组、模型对照组给于同量生理盐水经口灌胃。于造模第12周结束，用2％戊巴比妥钠以2ml/kg体重剂量腹腔注射麻醉，下腔静脉采血，观察大体形态，摘取肝、脾并称重．3.3 肝功能、肝组织Hyp含量测定及肝组织学观察方法同实施例I。
4 实验结果4.1 各组大鼠肝功能的变化与同期正常对照组大鼠比较，造模8w、12w的大鼠肝功能显著异常，表现为血清ALT、AST、GGT、ALP活性及血清Tbil含量显著增高；与12w模型对照组大鼠比较，“芪甘通”用药组的血清ALT、AST、ALP活性有所降低，但无显著性差异；血清GGT活性及Tbil含量显著降低(P＜0.05)，结果见表2.1所示。
表2.1 CCl4肝纤维化各组大鼠肝功能的变化(x±s)

注与12w模型对照组比较，*，p＜0.01；**，p＜0.054.2 各组大鼠肝组织Hyp含量的变化与正常对照大鼠比较，12w模型对照大鼠肝组织Hyp含量显著增加(P＜0.01)，而“芪甘通”干预治疗组大鼠不但显著低于12w模型对照组(P＜0.05)，较用药干预治疗前的8w模型对照组亦有降低的趋势。结果见表2.2所示。
表2.2 各组大鼠肝组织Hyp含量的变化(x±s)

注与12w模型对照组比较，*，p＜0.01；**，p＜0.054.3 肝组织学变化8w时模型组主要表现出中央静脉周区肝细胞的大面积气球样变、脂肪变和点状坏死，并伴有大量炎性细胞浸润；有较细的胶原纤维自汇管区向小叶内伸展，汇管区有明显的小胆管增生。12周时模型组除上述病理表现进一步加重，沉积的胶原纤维进一步向小叶内伸展，形成不完全假小叶；“芪甘通”肝内胶原纤维化沉积较12w模型组为轻，基本上停留在8周模型组的水平，结果如图9所示。
5 结论在造模刺激因子持续作用的情况下，“芪甘通”可以有效地改善胆汁淤积、阻止肝纤维化的进展。
实施例III(“芪甘通”治疗二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化的作用)1 实验药物实施例1-8任一项制备获得“芪甘通”干浸膏。
2 动物与试剂Wistar大鼠，雄性，44只，清洁级，体重160±15g，购自中国科学院上海实验动物中心。二甲基亚硝胺(dimethylinittrosamine，DMN)，东京化成工业株式会社产品，批号MAL05。
3 实验方法3.1 模型制备参考Jenkins方法(Jenkins SA，Grandison A，Baxter JN，et al.Adimethylnitrosamine-induced model of cirrhosis and portal hypertension in the rat.J Hepatol 1985；1489-99.)，生理盐水稀释DMN为0.5％(1199生理盐水)浓度，以2ml.kg-1剂量给大鼠作腹腔注射，每周连续3d，每天1次，共4w。
3.2 模型的分组与给药造模结束后，取6只模型组大鼠处死取材，作用药前观察。并将其余大鼠完全随机分为模型对照组16只、“芪甘通”治疗组12只；“芪甘通”治疗组按65kg成人体重临床1日用量等公斤体重剂量的8倍量，10ml/kg大鼠体重的剂量灌胃，共计2w，无间断。正常对照组与模型对照组大鼠以同体积生理盐水行相应处理。用药2w后，用2％戊巴比妥钠以2ml/kg体重剂量腹腔注射麻醉，下腔静脉采血，观察大体形态，摘取肝、脾并称重.
3.3 肝功能、肝组织Hyp含量测定及肝组织学观察方法同实施例I。
4 实验结果
4.1 DMN肝硬化大鼠体重、肝脾、腹水及死亡情况与同期正常大鼠比较，造模第2周体重开始下降，各组体重变化同模型组。各组体重、肝体、脾体指数参见表3.1所示。
表3.1 各组大鼠体重、肝/体比、脾/体比的变化(x±s)

注与同期正常大鼠对照组比较，*，p＜0.01造模4w后，8只模型大鼠中有4只大鼠出现不同程度的腹水；6w模型对照组17只大鼠有9只出现大量腹水。黄芪汤组12只大鼠中出现腹水4只(33.3％)，P＜0.05。
4.2 各组大鼠肝功能的变化与正常大鼠比较，DMN造模4w后大鼠血清AST、ALT活性及Tbil含量均显著增高、白蛋白含量显著降低(P＜0.01)；终止造模2w后的第6w较4w时均有改善，但仍显著异常；于6w模型对照组比较，“芪甘通”治疗组血清AST、ALT活性有所下降，但无显著性差异(P＞0.05)；而血清Tbil含量则显著降低、白蛋白含量显著增加(P＜0.05)。详细结果见表3.2所示。
表3.2 DMN肝纤维化各组大鼠血清肝功能的变化(x±s)

注与DMN-6w模型对照组比较，*，P＜0.01；**，P＜0.054.3 肝组织病理学变化正常对照组肝小叶结构清晰。造模4周时可见出血，并见大量肿胀肝细胞，表现为浊胀，胞浆疏松，汇管区明显增宽，广泛增生的纤维组织将原来的肝小叶分割包绕成大小不等的结节，淋巴细胞、单核细胞等炎细胞浸润，肝窦壁细胞增生明显，有大量的长梭形细胞附着在窦壁，窦壁增厚，甚至肝窦扭曲。6w时，纤维间隔较4w时变细而致密，肝细胞肿胀，炎细胞浸润减少，肝窦内见成纤维细胞附着。“芪甘通”治疗组对肝细胞变性、纤维增生均显著减轻(照片)。
正常组仅在汇管区和中央静脉壁见少量胶原纤维。造模4w时胶原增生明显，纤维组织弥漫性增生并向肝小叶组织内伸展，分割包绕肝组织，大多数形成较厚的完全间隔，正常肝小叶结构紊乱形成假小叶。6w时大鼠纤维组织增生程度减轻，纤维间隔变窄。“芪甘通”治疗组大鼠纤维组织增生程度减轻，纤维间隔变窄，着色浅，多为不完全间隔，肝窦内连续性环状胶原减少或断续(照片)。各组大鼠胶原纤维增生程度见表3.3所示。
表3.2 DMN造模4周、6周大鼠及各用药组肝脏胶原沉积半定量Riddit分析

注与DMN-6w模型对照组比较，*，P＜0.054.4 肝组织Hyp含量的变化与正常对照大鼠比较，DMN造模4w的模型大鼠肝组织Hyp含量较显著升高(p＜0.01)，终止造模2w后的6w模型大鼠肝组织Hyp含量仍显著高于正常组(p＜0.01)。“芪甘通”治疗组大鼠肝组织Hyp含量显著低于同期模型对照组(p＜0.05)。见表3.3所示。
表3.3 DMN肝纤维化各组大鼠肝组织Hyp含量变化(x±s)

注与DMN-6w模型对照组比较，*，P＜0.01；**，P＜0.055 结论“芪甘通”可以有效地逆转已经形成的肝纤维化，促进血清胆红素的清除，改善肝内胆汁淤积。
权利要求
1.一种治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物，其特征是它是由下述重量配比的原料制成的药剂黄芪300-900；甘草100-300；大枣100-300。
2.根据权利要求1所述的治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物，其中各原料的重量配比是黄芪400-800；甘草150-250；大枣150-250。
3.根据权利要求1所述的治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物，其中各原料的重量配比是黄芪600；甘草200；大枣200。
4.根据权利要求1或2或3所述的治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物，其特征是所说的药剂是任何一种药剂学上所说的剂型。
5.根据权利要求4所述的治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物，其特征是所说的药剂是膏剂或块剂。
6.制备权利要求1-3任何一项所述治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物的方法，其特征在于先将黄芪、甘草细碎，与大枣一起加水10倍量，浸泡2小时，煎煮30分钟，滤过取汁；药渣加水8倍量，煎煮1小时，滤过取汁，浓缩干燥成干膏，混合粉碎，压片，制得膏剂。
全文摘要
本发明涉及一种治疗胆汁淤积、肝纤维化的药物；具体地说是以中草药为原料制备的中成药。该药物由下述重量配比的原料制成的药剂黄芪300－900；甘草100－300；大枣100－300。该药物对大鼠胆汁淤积性肝纤维化、四氯化碳大鼠肝纤维化以及二甲基亚硝胺大鼠肝纤维化均显示出改善胆汁淤积及减轻肝组织纤维化的作用，对胆管上皮细胞增殖这一慢性肝病常见的病理变化具有显著抑制作用。本发明还涉及该药物的制备方法。
文档编号A61P1/16GK1827132SQ20051002416
公开日2006年9月6日 申请日期2005年3月2日 优先权日2005年3月2日
发明者刘平, 王兵, 慕永平, 王磊, 龙爱华, 李风华 申请人:上海中医药大学