专利名称：变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株及其构建方法
技术领域：
本发明属于口腔预防医学领域，尤其涉及一种变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株，还涉及一种变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株的构建方法。
背景技术：
龋病是危害人类健康的第三大疾病，目前已公认变形链球菌(Streptococcus mutans，以下称变链菌)是最重要的致龋菌。在变链菌致龋毒力因子中，葡糖基转移酶(glucosyltransferase，GTase)倍受关注。
变链菌含有三种GTase①葡糖基转移酶-I(GTase-I)，又称为细胞吸附型GTase(CAGTase)，主要以细胞结合的形式存在于细菌表面，仅合成非水溶性葡聚糖；②葡糖基转移酶-SI(GTase-SI)，既能合成非水溶性葡聚糖又能合成水溶性葡聚糖；③葡糖基转移酶-S(GTase-S)，仅能合成水溶性葡聚糖。变链菌葡糖基转移酶通过合成葡聚糖，特别是非水溶性葡聚糖，在以下几方面发挥致龋作用1.介导变链菌紧密地粘附于牙面；2.葡聚糖作为基质形成致密的菌斑，使细菌所产生的酸不易扩散而较长时间储留于牙面；3.菌斑“饥饿”时，为细菌的生存提供能量来源。
编码葡糖基转移酶-I(GTase-I)、葡糖基转移酶-SI(GTase-SI)、葡糖基转移酶-S(GTase-S)的基因分别是gtfB、gtfC、gtfD，已被克隆及测序。葡糖基转移酶-I(GTase-I)与葡糖基转移酶-SI(GTase-SI)的氨基酸序列高度同源，且抗葡糖基转移酶-I(GTase-I)的多克隆抗体不能区分gtfB和gtfC的基因产物。
龋病被认为是人类最普遍的感染性疾病。关于免疫防龋的研究已有近30年历史。近来的研究表明，利用致龋菌毒力因子制备疫苗是预防龋病的有效手段。用提纯的细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)免疫鸡，将所获得的抗细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)抗体用于被动免疫获得了明显的抗龋效果。但由于变形链球菌所含细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)量少，提取十分困难，成为妨碍细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)疫苗实际应用的主要原因。
发明内容
本发明的目的在于提供一种变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株，通过构建变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)过度表达株，解决了变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)量少、提取困难的问题。
本发明的另一个目的在于提供一种制备细胞吸附型变形链球菌葡糖基转移过度表达株的方法，用该方法构建的表达株对于研制细胞吸附型葡糖基转移酶抗龋疫苗有广泛的应用价值。
本发明技术方案如下首先，构建携带细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)基因的大肠杆菌——链球菌穿梭质粒pZB1，并将变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株B29-33(pZB1)，CCTCCNOM201045转化至变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)缺陷突变株B29中(变链菌B29由边专等人于日本大阪大学构建)，然后对变链菌葡糖基转移酶(CAGTase)过度表达株进行筛选及对其特征的研究，其步骤如下(1)根据菌落形态筛选变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表现为菌落体积较小，较坚硬，菌落中间凹陷，深入嵌入琼脂中。
(2)免疫印迹鉴定变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶CAGTase过表达株野生株MT8148含两种能与葡糖基转移酶-I(GTase-I)多克隆抗体反应的蛋白带，分别代表葡糖基转移酶(GTase-I 156KDa)和GTase-SI(148KDa)，B29因缺乏葡糖基转移酶-I(GTase-I)故仅有葡糖基转移酶-SI(GTase-SI)。29(pZB1)-4，B29(pZB1)-33(CCTCCNo.M201045)均表达出葡糖基转移酶-I(GTase-I)，但B29(pZB1)-4的表达水平接近野生型变链株MT8148，而B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11过度表达葡糖基转移酶-I(GTase-I)。
(3)测定细胞吸附型葡糖基转移酶CAGTase酶活力变链菌B29转化株葡糖基转移酶-I(GTase-I)酶活力测定表明转化株B29(pZB1)-4葡糖基转移酶(GTase)酶活力与野生型MT8148相似，但B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)葡糖基转移酶(GTase)酶活力显著高于MT8148。
(4)蔗糖依赖性粘附试验 结果表明变链菌野生型MT8148及变链菌葡糖基转移酶-IGTase-I缺陷株B29的粘附水平、非水溶性葡聚糖合成量与接种量无关，但B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)随接种量的增加非水溶性葡聚糖合成增加但粘附水平下降。
(5)对阳性蛋白带行薄层扫描以确定细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)的高表达水平。
最后，进行变形链球菌细胞吸附型葡糖基转移酶高表达株GTase-I基因上游DNA序列分析。发明优点和效果
迄今为止，本项研究所获得的细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)过度表达株在国内、外尚未见报告。通过这些细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)过度表达株，进一步探索了细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)在变链菌致龋机制中的作用。同时，由于变链菌葡糖基转移酶的量少，难以提取，曾阻碍了利用细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)作为抗龋疫苗的研究。运用基因工程技术构建了变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)过度表达株后，将其免疫奶牛，测得牛乳中含高水平的抗变链菌抗体。将该免疫牛奶用于自愿受试人群含漱，结果显示，牙舌面变链菌水平显著下降。因此，构建的这些细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)过度表达株，对于研制细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)抗龋疫苗可能有潜在的应用价值。
图1质粒(pTF37)的构建质粒(pSP73)用NdeI和HpaI消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离出221bp多克隆区(multiclonal site)。质粒(pMW119)经PuvII消化，琼脂糖凝胶电泳并分离出3.9Kb(千碱)的DNA片段后与221bp DNA片段混匀，末端平齐后连接，所产生的重组质粒多克隆区有2个方向，如图方向者为质粒(pTF37)。
图2 质粒(pTF41)，质粒(pTF42)的构建质粒(pSK6)经KpnI和BglII消化后，分离纯化GTase基因(5.0Kb)。将gtfB基因与经KpnI和BglII消化后的质粒(pTF37)连接。质粒(pSK16)经KpnI消化，分离提纯gtfC基因(4.7b)。将gtfC基因与经KpnI和SphI消化后的pTF37连接，重组质粒为pTF42。
图3 质粒(pZB1)和质粒(pZB2)的构建质粒(pVA838)经XbaI和SalI消化后分离出6.2Kb DNA片段，将该DNA片段与经XbaI和SalI消化后的pTF41连接，所产生的重组质粒为质粒(pZB1)。质粒(pVA838)经EcoRI和BamHI消化后，提取7.0Kb DNA片段与经EcoRI和BglII消化后的质粒(pTF42)连接，所产生的重组质粒为质粒(pZB2)。
图4 变链菌葡糖基转移酶(GTase-I)高表达株在轻唾培养基上菌落形态采用质粒(pZB1)转化变链菌B29后分离到大量转化株，其中多数在MS琼脂上表现为粗糙菌落。根据转化株特征分别命名为B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)、B29(pZB1)-11。变链菌MT8148、B29及葡糖基转移酶(GTase-I)高表达株在MS琼脂上呈现出各不相同的菌落形态。变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表现为菌落体积较小，较坚硬，菌落中间凹陷，深入嵌入琼脂中。
图5变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶GTase-I过度表达株免疫印迹分析一抗兔抗GTase-1多克隆抗体二抗碱性磷酸酶标记羊抗免IgG免疫印迹清楚地显示野生株MT8148含两种能与葡糖基转移酶(GTase-I)多克隆抗体反应的蛋白带，分别代表葡糖基转移酶(GTase-I 156KDa)和葡糖基转移酶(GTase-SI148Kda)、B29因缺乏葡糖基转移酶(GTase-I)故仅有葡糖基转移酶(GTase-SI)。29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)均表达出GTase-I，但B29(pZB1)-4的表达水平接近野生型变链株MT8148，而B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11过度表达GTase-I。B29(pZB1)-4上清样本中还存在一条100KD的过度表达带。
具体实施例方式
1.构建携带葡糖基转移酶(CAGTase)基因的大肠杆菌—链球菌穿梭质粒(pZB1)本研究首先分离质粒(pSP 73)上多克隆区(multiclonal site)并连接至低拷贝质粒(pMW 119)，构成新质粒(pTF37)。将葡糖基转移酶(GTase-I)及葡糖基转移酶(GTase-SI)基因分别连接到质粒(pTF37)分别构成质粒(pTF41)和质粒(pTF42)。然后从源于链球菌质粒(pVA838)中分离链球菌复制子片段并连接至质粒(pTF41)和质粒(pTF42)，分别构成大肠杆菌-变形链球菌携带GTase基因穿梭质粒(pZB1)和质粒(pZB2)。具体步骤如下(1)构建质粒(pTF37) 质粒(pSP73)用NdeI和HpaI消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离出221bp多克隆区(multiclonal site)。质粒(pMW119)经PuvII消化，琼脂糖凝胶电泳并分离出3.9Kb(千碱)的DNA片段后与221bp DNA片段混匀，末端平齐后连接，所产生的重组质粒多克隆区有两个方向，如图方向者为质粒(pTF37)(图1)。
(2)构建质粒(pTF41)、质粒(pTF42) 质粒(pSK6)经KpnI和BglII消化后，分离纯化GTase基因(5.0Kb)。将gtfB基因与经KpnI和BglII消化后的质粒(pTF37)连接(图2)。质粒(pSK16)经KpnI消化，分离提纯gtfC基因(4.7b)。将gtfC基因与经KpnI和SphI消化后的pTF37连接，重组质粒为pTF42。
(3)构建质粒(pZB1)和质粒(pZB2) 质粒(pVA838)经XbaI和SalI消化后分离出6.2Kb DNA片段，将该DNA片段与经XbaI和SalI消化后的质粒(pTF41)连接，所产生的重组质粒为质粒(pZB1)(图3)。质粒(pVA838)经EcoRI和BamHI消化后，提取7.0Kb DNA片段与经EcoRI和BglII消化后的质粒(pTF42)连接，所产生的重组质粒为质粒(pZB2)。
在选择载体质粒时其拷贝数是重要的考虑因素。含葡糖基转移酶(GTase)基因的高拷贝质粒(pBR322)和pUC系列不能在大肠杆菌中生存。因为这类质粒在大肠杆菌中大量繁殖，其携带的葡糖基转移酶(GTase)基因过度表达，在大肠杆菌细胞浆内合成多量葡糖基转移酶(GTase)。葡糖基转移酶(GTase)可能对大肠杆菌具有毒性作用，因此，在克隆这一蛋白基因时常采用低拷贝质粒。质粒(pMW119)为低拷贝质粒，携带了葡糖基转移酶(GTase-I)基因和葡糖基转移酶(GTase-SI)基因的质粒(pMW119)，分别为质粒(pSK6)和质粒(pSK16)，转化大肠杆菌后，大肠杆菌能低水平表达葡糖基转移酶(GTase)并稳定生长。
质粒(pSK6)和质粒(pSK16)仅携带能在大肠杆菌中复制的复制子，为了构建链球菌—大肠杆菌穿梭质粒，必须在质粒(pSK6)和质粒(pSK16)上加上能在链球菌中复制的复制子。质粒(pVA838)含这种链球菌复制子(图3)。质粒(pVA838)经XbaI和SalI消化后可分离出完整的链球菌复制子，但质粒(pSK6)上缺乏SalI酶切区，为了解决这一问题，从质粒(pSP73)上分离出221bp的多酶切区(其中含XbaI和SalI单一酶切点)并将其整合至质粒(pMW119)，形成质粒(pTF37)。随后将葡糖基转移酶(GTase-I)基因和葡糖基转移酶(GTase-SI)基因整合至质粒(pTF37)分别构建质粒(pTF41)和质粒(pTF42)。质粒(pTF41)既含葡糖基转移酶(GTase-I)基因又具有SalI和XbaI酶切点，因而含链球菌复制子的质粒(pVA838)SalI和XbaI片段能整合至质粒(PTF41)而形成质粒(pZB1)。由于在质粒(pTF42)构建中已失去SalI和XbaI酶切点，因此质粒(pVA838)经BamHI和EcoRI消化、分离出链球菌复制子后将该片段连接于质粒(pTF42)的EcoRI和BglII上。因为BamHI和BglII为同裂酶(isoschizomer)产生相同的粘性末端，因而可以连接。通过红霉素耐性挑选重组质粒，本研究所构建质粒见表1。由于质粒(pZB1)和质粒(pZB2)分别含大肠杆菌低拷贝复制子和链球菌复制子，故既能在大肠杆菌中生存复制也能在链球菌中生存复制。
表1质粒 特征pTF37 Ampr(L)源于pMW119含来源于pSP73的多克隆区[4.05Kb]*pTF41 Ampr(L)源于pFT37含gtfB基因[9.0Kb]pTF42 Ampr(L)源于pFT37含gtfC基因[9.0Kb]pZB1 EmrAmpr(M)链球菌—大肠杆菌穿梭质粒含gtfB基因[15.2Kb]pZB2EmrAmpr(M)链球菌—大肠杆菌穿梭质粒含gtfC基因[16Kb]*[ ]内为质粒分子量，Kb千碱基对，(L)低拷贝，(M)中等拷贝
2.质粒(pZB1)对变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)陷突变株B29的转化变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶(CAGTase)缺陷突变株B29由边专等人在日本大阪大学构建。变链菌B29于变链菌转化培养基(Todd-Hewitt培养基及5％失活马血清)中37℃，18hr，以变链菌转化培养基1∶40稀释(10ml)，37℃，1.5hr，加入质粒(pZB1)至终浓度25ug/ml，37℃，2hr，离心；浓缩10倍，涂皿。
3.对变链菌葡糖基转移酶CAGTase过度表达株的筛选及对其特征的研究(1)采用质粒(pZB1)转化变链B29后分离到大量转化株，其中多数在MS琼脂上表现为粗糙菌落。根据转化株特征分别命名为B29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCCNo.M201045)。B29(pZB1)-11。变链菌MT8148、B29及葡糖基转移酶(GTase-I)高表达株在MS琼脂上呈现出各不相同的菌落形态。变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)表现为菌落体积较小，较坚硬，菌落中间凹陷，深入嵌入琼脂中(图4)。
(2)免疫印迹清楚地显示野生株MT8148含两种能与葡糖基转移酶GTase-I多克隆抗体反应的蛋白带，分别代表葡糖基转移酶GTase-I(156KDa)和葡糖基转移酶GTase-SI(148KDa)。B29因缺乏葡糖基转移酶(GTase-I)故仅有葡糖基转移酶(GTase-SI)。29(pZB1)-4、B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)均表达出葡糖基转移酶(GTase-I)，但B29(pZB1)-4的表达水平接近野生型变链株MT8148，而B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11过度表达GTase-I(图5)。B29(pZB1)-4上清样本中还存在一条100KD的过度表达带。
(3)变链菌B29转化株葡糖基转移酶(GTase-I)酶活力测定表明转化株B29(pZB1)-4葡糖基转移酶(GTase)酶活力与野生型MT8148相似，但B29(pZB1)-11和B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)葡糖基转移酶(GTase)酶活力显著高于MT8148。
(4)蔗糖依赖性粘附试验按Koga等描述的方法，测试菌于BHI肉汤中37℃生长18hr，将25μl、50μl、100μl和200μl该生长物分别接种至3ml含1％蔗糖的BHI肉汤中，30°水平角倾斜培养18小时。轻柔旋转培养试管，将脱落菌体倾至另一试验管中，粘附菌体量采用比色测量(OD550)并以占总生长菌体数百分比表示。每份测试样品一式三份。在另一次实验中，接种菌液量为25μl，分别于培养时间15、18、21、24hr，测定蔗糖依赖性粘附水平。
非水溶性葡聚糖合成的测定在蔗糖依赖性粘附试验后，菌体样本合并，蒸馏水洗涤4次，悬混于3ml蒸馏水中，以葡萄糖为标准液，用蒽酮比色法测定总己糖量(代表非水溶性葡聚糖)。
结果表明变链菌野生型MT8148及变链菌葡糖基转移酶-I(GTase-I)缺陷株B29的粘附水平、非水溶性葡聚糖合成量与接种量无关，但B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)随接种量的增加非水溶性葡聚糖合成增加但粘附水平下降。
4.变形链球菌葡糖基转移酶高表达株GTase-I基因上游DNA序列分析从变链菌B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)，B29(pZB1)-11中提取DNA，转化大肠杆菌JM109，于含氨苄青霉素(100ug/ml)和红霉素(250ug/ml)的LB琼脂中生长，筛选合适转化株。
DNA测序方法按Sanger双脱氧链终止法进行。
DNA测序引物为引物1 GAACGCGGCTACAATTAATAC 21mer引物2 GCCAGATGCTGTAAGCAGCG20merDNA测序反应RM反应液5×测序反应缓冲液 2ul标记缓冲液2ulDTT 1ulSequenase 2ulDATP-35S 0.5ulMn缓冲液 1ul混匀、静置冰中备用2％ Soft agarose 3ml引物(OD280＝1)3ul待测DNA 7ul混匀后98℃，10min，37℃ 10min，加8.5ul RM反应液，37℃ 5min，分别取4.5ul加至ddG，ddA，ddT，ddC(每种2.5ul)中，37℃ 10min，加终止反应液4ul，70℃ 2min，立即上样电泳。
电泳条件在恒压1700V下预电泳30min，待电泳胶表面55℃时方上样电泳。
电泳后胶处理凝胶取下，置于5％甲醇，5％乙酸中固定15min，在固定液加2000mlH2O漂洗5min，取出胶，吸干水份，置于干胶机中，80℃真空干胶1hr，置于X片盒中-80℃感光过夜。
测序结果表明质粒pZB1与从B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)和B29(pZB1)-11中所提质粒在GTase-I上游区无任何差别(图5)，说明pZB1在转化进入变链菌过程中未发生突变。虽然pZB1在大肠杆菌宿主中为低拷贝质粒，但该质粒在变链菌中的复制数量尚不清楚，因此推测可能是由于pZB1在变链菌中的大量复制导致GTase-I基因数量增加而引起B29(pZB1)-33(CCTCC No.M201045)的GTase-I高表达。另外一种可能的机制是变链菌GTase-I基因的调控基因仅对染色体上的GTase-I基因有调控作用，因此，位于质粒上的GTase-I基因得以大量表达。
变链菌MT8148 GTase-I基因与变链菌GS-5株gtfB上游比较存在着广泛的一致性，这一结果与Fujiwara等的Southern杂交结果一致。因为变链菌MT8148与GS-5在遗传型分类上为同一型，因此推测变链菌GTase基因可能在遗传型同型菌株间高度保守。
权利要求
1.一种变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株，其特征在于变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株B29-33，CCTCC NOM201045。
2.一种实现权利要求1所述的变形链球菌葡糖基转移酶过度表达株的构建方法，包括下列步骤A、构建携带葡糖基转移酶基因的大肠杆菌—链球菌穿梭质粒，首先构建质粒pTF37，质粒pSP73用NdeI和HpaI消化，经聚丙烯酰胺凝胶电泳后分离出221bp多克隆区，质粒pMW119经PuvII消化，琼脂糖凝胶电泳并分离出3.9Kb的DNA片段后与221bp DNA片段混匀，末端平齐后连接；其次是构建质粒pTF41、质粒pTF42，质粒pSK6经KpnI和BglII消化后，分离纯化GTase基因5.0Kb，将gtfB基因与经KpnI和BglII消化后的质粒pTF37，质粒pSK16经KpnI消化，分离提纯gtfC基因4.7b，将gtfC基因与经KpnI和SphI消化后的pTF37连接，重组质粒为pTF42；最后构建质粒pZB1和质粒pZB2，质粒pVA838经XbaI和SalI消化后分离出6.2Kb DNA片段，将该DNA片段与经XbaI和SalI消化后的质粒pTF41连接，所产生的重组质粒为质粒pZB1，质粒pVA838经EcoRI和BamHI消化后，提取7.0KbDNA片段与经EcoRI和BglII消化后的质粒pTF42连接，所产生的重组质粒为质粒pZB2；B、质粒pZB1对变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶CAGTase陷突变株B29的转化，变链菌B29于变链菌转化培养基中37℃，18hr，以变链菌转化培养基1∶40稀释，37℃，1.5hr，加入质粒pZB1至终浓度25ug/ml，37℃，2hr，离心，浓缩10倍，涂皿；C、对变链菌葡糖基转移酶CAGTase过度表达株的筛选，首先采用质粒pZB1转化变链B29后分离到转化株，其中在MS琼脂上表现为粗糙菌落；D、变形链球菌葡糖基转移酶高表达株GTase-I基因上游DNA序列分析，从变链菌B29(pZB1)-33 CCTCC No.M201045，变链菌B29(pZB1)-11中提取DNA，转化大肠杆菌JM109，于含氨苄青霉素和红霉素的LB琼脂中生长，筛选转化株。
全文摘要
本发明公开了一种变形链球葡糖基转移酶过度表达株方法及构建方法,采用变列链球菌葡糖基转移酶过度表达株B29－33 pZB1,CCTCC NO:M201045,构建携带葡糖基转移酶基因的大肠杆菌－链球菌穿梭质粒;质粒pZB1对变链菌细胞吸附型葡糖基转移酶陷突变株B29的转化;对变链菌葡糖基转移酶过度表达株的筛选。本发明解决了变形链菌细胞吸附型葡糖基转移酶量少,提取困难的问题,对抗龋疫苗有广泛的应用价值。
文档编号C12N15/63GK1369554SQ0211552
公开日2002年9月18日 申请日期2002年2月5日 优先权日2002年2月5日
发明者边专 申请人:武汉大学