专利名称：TrPK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种TrPK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。
背景技术：
随着全球能源和环境危机的日益恶化，寻找新的可再生能源已成为当前社会关注的热点问题，纤维素生物质作为植物吸收太阳能并通过光合作用形成的产物，是地球上最为丰富的、最可行的可再生新能源物质。但如何将生物质转化成现代工业可利用的能源物质却存在诸多问题，其中最关键问题就是实现天然生物质的高效降解。纤维素酶是自然界中存在最广泛、最有效的生物质降解酶，在木质纤维素资源转化过程起着关键性作用，其产量、活性的高低直接关系着新的生物质能源的开发、利用。丝状真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是主要的纤维素酶生产菌株,全球大约90%以上纤维素酶产品是通过木霉发酵生成的。五十年来，人们通过优化培养条件、基因突变和菌株诱变等方法使里氏木霉生产纤维素酶的能力获得大幅提高。但是，生产纤维素酶成本高、产量低仍是制约生物质能源不能规模化的瓶颈。通过传统方法进一步提高纤维素酶产量已经非常困难。
发明内容
本发明的目的是提供一种TrPK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。本发明提供了一种构建工程菌的方法，包括如下步骤抑制木霉中TrPK基因的表达，得到工程菌；所述TrPK基因编码如下(a)或(b)所述的TrPK蛋白(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列I衍生的蛋白质。所述TrPK基因为如下I)至4)中任一所述的DNA分子I)序列表的序列2所示的DNA分子；2)序列表的序列3所示的DNA分子；3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。所述严格条件为在0. I XSSPE (或0. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65°C条件下杂交并洗膜。所述“抑制木霉中TrPK基因的表达”的实现方法如下通过同源重组敲除木霉中的所述TrPK基因。所述“通过同源重组敲除木霉中的所述TrPK基因”的实现方法如下将含有DNA片段甲的重组质粒导入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrPK基因的上游同源臂和所述TrPK基因的下游同源臂。所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还具有筛选标记基因。所述筛选标记基因具体可为pyr4基因；所述pyr4基因为编码序列表的序列5所示的pyr4蛋白的基因。所述pyr4基因的反向互补序列具体可如序列表的序列4自5’末端第3000至4145位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可依次包括所述上游同源臂、所述pyr4基因的表达盒的反向互补序列和所述下游同源臂。所述上游同源臂具体可如序列表的序列4自5’末端第9至1994位核苷酸所示。所述下游同源臂具体可如序列表的序列4自5’末端第5511至7506位核苷酸所示。所述pyr4基因的表达盒的反向互补序列具体可如序列表的序列4自5’末端第2001至5504位核苷酸所示。所述DNA片段甲具体可为序列表的序列4自5’末端第9至7506位核苷酸所示的双链DNA分子。所述含有DNA片 段甲的重组质粒具体可为将所述DNA片段甲导入质粒pBluescript SK(+)的多克隆位点得到的重组质粒。所述木霉可为里氏木霉，具体可为TU6 A tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。以上任一所述方法得到的工程菌均属于本发明的保护范围。本发明还保护一种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤发酵所述工程菌，得到纤维素酶。所述发酵的具体条件为，将所述工程菌接种于发酵培养基，28°C，200rpm震荡培养48-144 小时。本发明还保护抑制所述TrPK基因表达的物质在促进木霉生产纤维素酶中的应用。所述抑制所述TrPK基因表达的物质为含有以上任一所述DNA片段甲的重组质粒。所述抑制所述TrPK基因表达的物质具体可为将所述DNA片段甲导入质粒pBluescript SK (+)的多克隆位点得到的重组质粒。所述木霉可为里氏木霉，具体可为TU6 A tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。本发明还保护所述TrPK蛋白在调节木霉中的纤维素酶合成中的应用。所述木霉可为里氏木霉，具体可为TU6 A tku70菌株、TU6菌株或QM9414菌株。本发明发现，敲除TrPK基因后，木霉生产纤维素酶的能力显著增加。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于解决能源危机和环境危机具有潜在影响。
图I为实施例I中的PCR鉴定电泳图。图2为实施例3中粗酶液SDS-PAGE分析电泳图。图3为实施例3中粗酶液的纤维素酶酶活。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。里氏木霉(Trichoderma reesei)QM9414菌株美国模式培养物集存库(简称ATCC,网址 WWW. atcc. org/)，ATCC 编号为 26921。里氏木霉(Trichoderma reesei) TU6菌株是由QM9414菌株衍生的,pyr4基因功能丧失的、尿嘧啶营养缺陷菌株，ATCC编号为MYA-256。
微晶纤维素(AvicelKPH_101):购自fluka公司，产品目录号11365。质粒pBluescript SK(+):购自 Stratagene 公司，产品目录号 212205。里氏木霉(Trichoderma reesei)TU6 A tku70菌株是由TU6菌株衍生的，敲除介导非同源重组的tku70基因得到的菌株，公众可从中国科学院微生物研究所获得；提及 TU6 A tku70 菌株(T. reesi KU70)的文献Zhang Guangtao, Lukas Hartl, AndreSchuster, Stefan Polak,Monika Schmoll, Tianhong Wang, Verena Seidl, BernhardSeiboth.Gene targeting in a nonhomo logous end joining deficient Hypocreajecorina. Journal of biotechnology, 2009, 139(2):146-151.。土豆培养基(PDA固体培养基):将20g去皮马铃薯切碎，加入90mL /K，煮沸30min，双层纱布过滤并收集滤液，加入2g葡萄糖和I. 8g琼脂粉，用水定容至lOOmL。MM 液体培养基(pH 为 5. 2+0. I) : (NH4) 2S04 0. 5g/100mL、KH2PO4I. 5g/100mL、MgSO4O. 06g/100mL、CaCl2 0. 06g/100mL、FeSO4 7H20 0. 0005g/100mL,MnSO4 H2OO. 00016g/100mL、ZnSO4 7H20 0. 00014g/100mL、CoCl2 0. 0002g/100mL，其余为水。MM固体培养基在MM液体培养基的基础上，每升添加20g琼脂粉。LB培养基(自然pH値):lg/100mL蛋白胨、lg/100mL氯化钠、0. 5g/100mL酵母提取物，其余为水。DNS试剂50g 3，5_ 二硝基水杨酸溶于4L水中，不断搅拌，缓缓加入80g氢氧化钠，使之完全溶解，继续搅拌，将1500g酒石酸钾钠分数次加入,并小心加热,溶液最高温度不超过45°C,冷却至室温后定容至5L,如果溶液不澄清,用Whatmanl号滤纸过滤,然后棕色瓶室温贮藏。TrPK蛋白(又称trpk蛋白)如序列表的序列I所示，由1166个氨基酸残基组成，理论分子量128. 98kDa，等电点(PI)5. 205。TrPK蛋白的编码基因(又称TrPK基因或trpk基因)的开放阅读框如序列表的序列2所示，其全长cDNA如序列表的序列3所示。实施例I、重组菌甲的制备一、重组质粒的构建I、trpk基因上游同源臂(Ptrpk,约1987bp)的获得以TU6 A tku70菌株的基因组DNA为模板，用Fup和Rup组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fup :5’ -GCGGCCGCCTTGCCCGTTTGCTACCTATGATG-3’ (下划线标注 NotI 酶切识别序列)；Rup :5’ -GGATCCGTGGGAGGGGGAGATAGTTG-3，(下划线标注 BamHI 酶切识别序列)。PCR扩增采用的Taq酶为高保真fastpfu (购自全是金公司)。PCR 扩增程序95°C预变性 5min ;94°C变性 30s、55°C退火 40s、72°C延 lmin，30 个循环；72°C扩展延伸3min。2、trpk基因下游同源臂(Ttrpk,约1996bp)的获得以TU6 A tku70菌株的基因组DNA为模板，用Fdown和Rdown组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fdown :5’ -AAGCTTCGAGGTAAGTCTGATATATCGAG-3 (下划线标注 HindIII 酶切识别序列)；Rdown :5’ -GGTACCGTCTGTTCTATTTCTGGTCCTTTC-3 (下划线标注 KpnI 酶切识别序列)。PCR扩增采用的Taq酶为高保真fastpfu (购自全是金公司)。PCR 扩增程序95°C预变性 5min ;94°C变性 30s、52°C退火 40s、72°C延 lmin，30 个循环；72°C扩展延伸3min。
3、pyr4基因表达盒(约3504bp)的获得以QM9414菌株的基因组DNA为模板，用Fpyr4和Rpyr4组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。Fpyr4 5，-GGATCCGGTTGATTGTTGCCGTCCGTTTCG-3，(下划线标注 BamHI 酶切识别序列)。Rpyr4 :5’ -AAGCTTTCGACTAGACTGACCCCCCCG-3，(下划线标注 HindIII 酶切识别序列)。PCR扩增采用的Taq酶为高保真fastpfu (购自全是金公司)。PCR 扩增程序95°C预变性 5min ;94°C变性 30s、55°C退火 40s、72°C延 2min，30 个循环；72°C扩展延伸3min。4、用限制性内切酶NotI和BamHI双酶切步骤I的PCR扩增产物，回收酶切产物。5、用限制性内切酶Hindi 11和KpnI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。6、用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切步骤3的PCR扩增产物，回收酶切产物。7、用限制性内切酶NotI和KpnI双酶切质粒pBluescript SK(+)，回收载体骨架(约 296 Ibp )。8、将步骤4的酶切产物、步骤6的酶切产物、步骤5的酶切产物和步骤7的酶切产物连接，得到重组质粒pSK-Ptrpk-pyr4-Ttrpk (trpk基因敲除载体)。根据测序结果，对重组质粒pSK-Ptrpk_pyr4_Ttrpk进行结构描述如下在质粒pBluescript SK (+)的NotI和KpnI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子。序列表的序列4中，自5’末端第I至8位核苷酸为NotI酶切识别序列，第9至1994位核苷酸为trpk基因上游同源臂，第1995至2000位核苷酸为BamHI酶切识别序列，第2001至5504位核苷酸为pyr4基因表达盒的反向互补序列(其中第2001至2999位核苷酸为终止子的反向互补序列、第3000至4145位核苷酸为pyr4基因的反向互补序列、第4146至5504位核苷酸为启动子的反向互补序列)，第5505至5510位核苷酸为HindIII酶切识别序列，第5511至7506位核苷酸为trpk基因下游同源臂，第7507至7512位核苷酸为KpnI酶切识别序列。二、重组菌甲的获得I、Tu6 A tku70菌株原生质体制备(I)取Tu6 A tku70菌株的孢子，用适量无菌水洗涤孢子并制成孢子悬液，用200目筛子过滤除去残余的菌丝，将过滤后的孢子悬液接种至装有IOOmL丽液体培养基的500mL三角瓶中，28°C培养至菌丝伸展(13h-14h)。(2)将步骤(I)得到的培养体系经200目筛子过滤，收集菌体，用无菌水洗涤2-3次，然后用1.2M MgSO4水溶液洗涤一次。(3)将步骤(2)得到的菌体加入装有15mL裂解液的三角瓶中(裂解液是含有150mg的裂解酶和15mg纤维素酶的I. 2M MgSO4水溶液)，30°C、80rpm振荡反应I. 5h，显微镜下观察原生质体产生的情况,反应Ih后每隔IOmin取样观察一次。(4)步骤(3)中，当原生质体大量产生并且仍有大量菌丝存在时，加等体积0. 6M山梨醇水溶液终止反应，经200目筛子过滤除去残余的菌丝，室温3000rpm离心lOmin，收集原生质体沉淀。
(5)将步骤(4)的原生质体沉淀用I. OM山梨醇水溶液重悬，室温3000rpm离心IOmin,收集原生质体沉淀。(6)将步骤(5)的原生质体沉淀用I. OM山梨醇水溶液重悬，室温3000rpm离心IOmin,收集原生质体沉淀并悬浮于200 u L I. OM山梨醇水溶液中，血球板计数器观察并计数(IO8个原生质体/mL)。2、重组菌甲的获得50%PEG4000 溶液含有 50g/100g PEG4000、50mM CaCl2 的 IOmM Tris-HCL (pH8. 0)缓冲液。(I)将重组质粒pSK-Ptrpk_pyr4_Ttrpk加入步骤一制备的原生质体中，轻轻混匀，再加入50 ii L 50% PEG4000溶液，再次混匀，冰上放置30min。(2)在步骤(I)的培养体系中加入ImL 50% PEG4000溶液，混匀，室温放置20min。(3)在步骤(2)的培养体系中加入ImL I. OM山梨醇水溶液，混匀后分四次且每次与一支4ml融化的丽固体培养基(58°C以下)混和，立即铺于含I. OM山梨醇的丽固体培养基平板上，30°C培养4-7d。(4)待转化子长出后，将其转移至PDA平板上，28°C培养3_5天(有孢子生成)，用无菌水将平板上的孢子洗下来制备成孢子悬液，做梯度稀释后，将其涂布在含0. 1% (体积比)Triton-XlOO的丽固体培养基平板上分单孢，待菌丝长出后，抽提基因组DNA进行PCR鉴定。PCR鉴定所用的引物如下Frup :5’ -CAACTATCTCCCCCTCCCAC-3’ ；位于上游同源臂末端Rfdown :5’ -CTCGATATATCAGACTTACCTCG-3’ ；位于下游同源臂前端Tu6 A tku70菌株只能得到约3930bp的片段，能得到约3559bp片段的菌株为重组囷甲。鉴定结果见图I (箭头标注目的条带)，其中M为Ikb DNA ladder marker, I为重组菌甲，2为Tu6 A tku70菌株。实施例2、重组菌乙的获得将质粒pBluescript SK (+)代替重组质粒 pSK_Ptrpk-pyr4_Ttrpk 进行实施例 I的步骤二的操作，得到重组菌乙。实施例3、重组菌的发酵和粗酶液的纤维素酶活性鉴定将实施例I获得的重组菌甲、实施例2获得的重组菌乙或出发菌(TU6 A tku70菌株)分别进行如下步骤一、重组菌的发酵
I、将菌株转至PDA固体培养基平板上产孢，然后用无菌水洗涤孢子并用无菌水制成高浓度的孢子悬液4X 107-5X IO7个孢子/mL。2、将0. 5mL孢子悬液接种于250mL三角瓶中的50mL含2g/100mL葡萄糖的MM液体培养基中，28°C，200rpm预培养48h，四层纱布过滤并收集菌体。3、称取1.8克菌体(湿重)于5011^发酵培养基中，281，200印111震荡培养，分别于振荡培养48小时、72小时、96小时、120小时和144小时后取样。发酵培养基(pH5. 2±0. I):含lg/1OOmL微晶纤维素的丽液体培养基。
4、将步骤3取得的样本12000r/min离心5min,收集上清液。将重组菌甲振荡培养48小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液48/>w。将重组菌甲振荡培养72小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液72/>w。将重组菌甲振荡培养96小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液96/>_。将重组菌甲振荡培养120小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液12M、w。将重组菌甲振荡培养144小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌甲粗酶液144/j、w。将重组菌乙振荡培养48小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液48/>w。将重组菌乙振荡培养72小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液72/>w。将重组菌乙振荡培养96小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液96/>_将重组菌乙振荡培养120小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液12M、w。将重组菌乙振荡培养144小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为重组菌乙粗酶液144小时。将出发菌振荡培养48小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液48,>w。将出发菌振荡培养72小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液72/>w。将出发菌振荡培养96小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液96/j、w。将出发菌振荡培养120小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液12(|/>w。将出发菌振荡培养144小时取样并进行步骤4得到的上清液命名为出发菌粗酶液144/j、w。二、SDS-PAGE 分析将步骤一得到的各个粗酶液进行SDS-PAGE分析，结果见图2。图2中，I代表出发菌，2代表重组菌甲，48h、72h、96h、120h和144h都代表发酵时间。因为粗酶液为发酵液上清，根据现有技术和文献记载，对于木霉来说，先以纤维素为底物进行发酵培养的条件下，分泌到胞外的蛋白基本上都是纤维素降解相关的酶，由图2中可以观察到，各个蛋白的表达量均随发酵时间上升。三、粗酶液的纤维素酶活性鉴定将步骤一得到的各个粗酶液参照IUPAC标准方法进行纤维素酶活性测定，具体方法如下(I)取IOOiU步骤一得到的上清液，加入IOmL含0. 05g/100mL苯甲酸钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. 05M、pH4. 8)中，得到稀释至101倍的酶液。(2)将Whatmanl号滤纸制成6cm长、Icm宽的形状(50mg左右),折成4折,呈M型。(3)分组处理实验组将步骤(2)的滤纸条置于试管底部，加入含0. 05g/100mL苯甲酸钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. 05M、pH4. 8) I. 5mL, 50°C水浴60分钟；然后加入0. 5mL步骤⑴得到的酶液，混合均匀，使管内溶液浸没滤纸，50°C水浴I小时，迅速冷却；向试管中加入3mLDNS试剂，混合均匀，在沸水中煮lOmin，迅速冷却，用蒸馏水定容至25mL。对照组将步骤(2)的滤纸条置于试管底部，加入含0. 05g/100mL苯甲酸钠的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(0. 05M、pH4. 8) I. 5mL，50°C水浴60分钟，使管内溶液浸没滤纸，50°C水浴I小时，迅速冷却；向试管中加入3mL DNS试剂，然后加入0. 5mL步骤(I)得到的酶液，混合均勻，在沸水中煮IOmin,迅速冷却,用蒸懼水定容至25mL。以对照组试管为参比，测 定540nm的吸光度(A54tlnm)。在50°C、pH4. 8的条件下，每分钟水解滤纸底物，产生Iumol还原糖(以葡萄糖计)所需要的酶量定义为一个国际单位滤纸酶活(1FPU)。采用葡萄糖作为标准品，制作A54tlnm和葡萄糖浓度的标准曲线，标准曲线方程如下Y=O. 6692X-0. 0082，Y 代表葡萄糖浓度(umol/mL)，X 代表 A54tlnm 数值；R2=0. 9988。每毫升粗酶液酶活检测结果见图3。重组菌甲得到的粗酶液的纤维素酶活力显著高于出发菌得到的粗酶液。重组菌乙得到的粗酶液的纤维素酶活力与出发菌得到的粗酶液一致。结果表明，敲除TrPK基因后，可以使木霉生产纤维素酶的能力显著增加。
权利要求
1.一种构建工程菌的方法，包括如下步骤抑制木霉中TrPK基因的表达，得到工程菌；所述TrPK基因编码如下(a)或(b)所述的TrPK蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求I所述的方法， 其特征在于所述TrPK基因为如下I)至4)中任一所述的DNA分子 1)序列表的序列2所不的DNA分子； 2)序列表的序列3所不的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子； 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
3.如权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述“抑制木霉中TrPK基因的表达”的实现方法如下通过同源重组敲除木霉中的所述TrPK基因。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述“通过同源重组敲除木霉中的所述TrPK基因”的实现方法如下将含有DNA片段甲的重组质粒导入所述木霉中；所述DNA片段甲自上游至下游依次包括所述TrPK基因的上游同源臂和所述TrPK基因的下游同源臂。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述DNA片段甲中，在所述上游同源臂和所述下游同源臂之间还具有筛选标记基因。
6.如权利要求I至5中任一所述的方法，其特征在于所述木霉为里氏木霉。
7.权利要求I至6中任一所述方法得到的工程菌。
8.—种生产纤维素酶的方法，包括如下步骤发酵权利要求7所述工程菌，得到纤维素酶。
9.抑制TrPK基因表达的物质在促进木霉生产纤维素酶中的应用；所述TrPK基因编码如下(a)或(b)所述的TrPK蛋白 Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列I衍生的蛋白质。
10.TrPK蛋白在调节木霉中的纤维素酶合成中的应用；所述TrPK蛋白是如下(a)或(b) Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列I衍生的蛋白质。
全文摘要
本发明公开了一种TrPK蛋白在调节纤维素酶产量中的应用。本发明提供了一种构建工程菌的方法，包括如下步骤抑制木霉中TrPK基因的表达，得到工程菌；所述TrPK基因编码如下(a)或(b)所述的TrPK蛋白(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与木霉中的纤维素酶合成相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明还保护所述TrPK蛋白在调节木霉中的纤维素酶合成中的应用。本发明发现，敲除TrPK基因后，木霉生产纤维素酶的能力显著增加。本发明对于纤维素酶的生产具有重大价值，对于解决能源危机和环境危机具有潜在影响。
文档编号C12N9/42GK102747067SQ20121024729
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月17日 优先权日2012年7月17日
发明者董志扬, 陈秀珍 申请人:中国科学院微生物研究所