检测刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法
【专利摘要】本发明公开了检测刺猬紫檀（Pterocarpus?erinaceus?Poir.）的专用探针、引物、基因芯片和方法。该专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?NO.12所示序列的反向互补序列的DNA片段。通过该基因芯片能够在短时间内对常见的花梨木刺猬紫檀进行鉴别，实现了在“种”的水平上对红木进行的鉴定，提升了红木鉴定的准确性和分辨率。
【专利说明】检测刺猬紫擅的专用探针、引物、基因芯片和方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，特别涉及检测刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法。
【背景技术】
[0002]红木是一类外表呈红色的优质硬木的统称，多产于热带亚热带地区，历来就受到世界各地人民的青睐。尤其是在中国的明清两代，经传统工艺制成的红木家具更是创造了中国古典家具的典范。根据我国的国家标准GB18107-2000《红木》，“红木”范围确定为5属8类、33个主要品种。目前，传统的鉴定方法依据心材颜色、气味、管孔弦向直径、气干密度、射线等指标将红木分为八类，鉴定结果只分辨到“类”，很难再深入到“种”的层面进行鉴定。
[0003]基因芯片是DNA识别技术的一种体现，利用芯片高通量的优势，可以在一张芯片上同时对多种红木的多个DNA条形码进行检测，不仅极大地提高了鉴定的准确性，而且还可以区分红木种与种之间的微小DNA差异，即基因芯片可以在“种”的水平上对不同红木进行准确鉴定。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是，针对目前在“种”的水平上对不同红木进行准确鉴定的缺陷，提供一种检测刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法，该方法能够在“种”的水平上对刺猬紫檀进行准 确鉴定。
[0005]本发明解决上述技术问题的技术方案如下:
[0006]本发明的技术方案之一为:检测刺猬紫檀(Pterocarpus erinaceus Poir.)的专用探针，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示序列的反向互补序列的DNA片段。
[0007]上述探针检测刺猬紫檀的靶序列是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.9所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.9所示序列的反向互补序列的DNA片段。
[0008]本发明的技术方案之二为:检测刺猬紫檀的基因芯片，其含有所述的专用探针。本发明所述的基因芯片如本领域常规，而其上的检测探针则是如上所述的专用探针。
[0009]本发明的技术方案之三为:检测刺猬紫檀的装置，其包括所述的专用探针或者所述的DNA芯片。本发明所述的装置如本领域常规，其中，优选的，所述的装置还包括引物对，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.11所示。其中，优选的，所述的引物上含有荧光标记。
[0010]本发明的技术方案之四为:检测刺猬紫檀的引物，其是核苷酸序列如序列表中SEQID N0.10或SEQ ID N0.11所示的DNA片段。其中，优选的，所述的引物上含有荧光标记。
[0011]本发明的技术方案之五为:一种检测刺猬紫檀的方法，包括以下步骤:[0012](I)制备待测样本的总DNA，作为模板，用含检测标记的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.11所示；
[0013](2)将专用探针结合于基因芯片的片基上，洗去未结合的探针，获得检测刺猬紫檀的基因芯片，所述的专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示序列的反向互补序列的DNA片段；
[0014](3)在步骤(2)所得的检测刺猬紫檀的基因芯片中加入步骤(1)所得的PCR产物，进行杂交，洗去未杂交的PCR产物；
[0015](4)检测步骤(3)所得的杂交后的基因芯片。
[0016]其中，步骤(1)所述的制备待测样本的总DNA的方法是常规的。所述PCR的扩增方法也是常规的，较佳的PCR扩增程序如下:95°C预热5min ；35个循环:95°C 30s, 55°C 30s，72°C 30s ;最后 72°C延伸 5min。[0017]其中，步骤(2)所述的将专用探针结合于基因芯片的片基上的方法是常规的。基因芯片的片基是常规的，优选的，所述的片基是醛基片基，所述的探针是氨基化探针。优选的，在步骤(2)所述的基因芯片的另外的加样孔中加入花梨木管家基因检测探针，所述的花梨木管家基因检测探针是常规的，优选的是序列如序列表中SEQ ID N0.16所示序列的核苷酸片段。优选的，在步骤(2)所述的基因芯片的另外的加样孔中还可以加入其它试剂，如作为各种对照的试剂、检测其他种花梨木的检测探针等。
[0018]其中，步骤(3)所述的杂交是常规的。
[0019]其中，步骤(4)所述的检测方法是常规的，优选激光共聚焦扫描仪检测基因芯片，获得杂交结果。优选的，根据步骤(4)检测所得的杂交结果评判如下:杂交结果为阳性，则所述待测样本为刺猬紫檀；杂交结果不为阳性，则所述待测样本不为刺猬紫檀。
[0020]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0021]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0022]本发明的积极进步效果在于:
[0023]本发明提供了鉴别刺猬紫檀的专用探针、引物、基因芯片和方法。对刺猬紫檀该种花梨木进行DNA鉴定，在“种”的水平上对该花梨木进行检测和鉴定，为传统的木材鉴定提供了一种新的技术和思路。
[0024]本发明的特点包括:
[0025](I)高通量:能同时鉴定多个刺猬紫檀样品；若将多个花梨木的检测探针置于同一芯片上，能同时鉴定多个花梨木品种；
[0026](2)准确性:基于DNA差异的检测，结果更可靠；
[0027](3)时效性:相比于传统红木鉴定耗时15天，本发明只需要8小时即可完成对红木品种的鉴定。
[0028](4)可靠性:含有内对照点，对检测操作的准确性进行质控。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图1为安达曼紫檀的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
[0030]图2为印度紫檀的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点；也是芯片的质控位点。
[0031]图3为的检测结果图。图中Pd为安达曼紫檀的检测位点；Pi为印度紫檀的检测位点；Pe为的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
[0032]图4对照组越柬紫檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
[0033]图5对照组刀状黑黄檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。[0034]图6对照组刀绒毛黄檀的检测结果。图中Pc为越柬紫檀的检测位点；Dc为刀状黑黄檀的检测位点；Df为绒毛黄檀的检测位点；QC为管家基因的检测位点，也是芯片的质控位点。
【具体实施方式】
[0035]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0036]实施例1靶序列的确定
[0037]根据报道的安达曼紫檀(Pteroearpus dalbergioides Benth.)、印度紫檀(Pterocarpus indicus Wiild.)、刺猬紫擅(Pterocarpus erinaceus Poir.)基因序列，选择一段特异性较好、片段长度适合的基因序列作为检测的靶序列。所选取的靶序列经过同源性比对检索后，目前确定为一段特异性较高的DNA序列。
[0038]3种花梨木的特异性检测靶序列分别为:
[0039]安达曼紫檀:
[0040]5，AGTTTATTTTGAAATAATTCATTTTTTTTTCCTTACAATACAAAGAGAAATNTATGTTTGGCAAAATTTTGAAAAAGGGGGTAAAATNTTCAATGTNTTTCTTTAGATNTTAAAAAGGTAAAAAAAAAGATAAAAAAAGGGGGGGGTAAGATATATGGGTAATTAATCAAAGAAGAATTAGTTTTCCTTTTGAGAACCGAAGGAAGGTTTTTCCCCTGACCCGGAGCAATG—3，(SEQ ID N0.1)；
[0041]印度紫檀:
[0042]5，GAAAGGAAAAGGCTATACATATATATATATGTATATATACGTATTTGTACTGAAATACTATTTCAATTGAGTAATGAAGACTCCAAATCTCTATTTGTGACTCTTTATATCACAAATGACAAATGAAAAATGTGAATCAAATCAATCCAAGTTGA—3’ (SEQ ID N0.5)；
[0043]刺猬紫檀:
[0044]5，CAATCCCGGCGCCTCCGGGCACCGGGCGGGGCGGATGCTGGCCTCCCGCGAGCGAGCGCCTCTCGGTTGGCCGAAAATCGGGTTCGTGGCGGAGGGCAGCGCCACGACAGGTGGCGGTTGAGCGCAATCTCGAGGCCGGCCGTGCGCGCGCCCCCTCCGTCGTTGCGGACCCTAAGACCCGCGGGCGGCACCGATCCGCCGCCCATGACGCGACCTC—3’(SEQ ID N0.9)。[0045]实施例2引物与探针的设计和合成
[0046]靶序列确定后，根据引物与探针设计原则，设计引物与探针如下:
[0047]安达曼紫檀:
[0048]引物1:5，Hex—AGTTTATTTTGAAATAATTCA— 3J (SEQ ID N0.2)；
[0049]引物2:5’ 一CATTGCTCCGGGTCAGGGGAAAAAC—3，(SEQ ID N0.3)；
[0050]检测探针:
[0051]5’NH3— TTTTTTTTTTTCAAAAGGAAAACTAATTCTTCTTTGATT— 3’ (SEQ ID N0.4)。
[0052]将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的安达曼紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出安达曼紫檀。
[0053]印度紫檀:
[0054]引物1:5，Hex—GAAAGGAAAAGGCTATACAT— 3J (SEQ ID N0.6)；
[0055]引物2:5’ 一TCAACTTGGATTGATTTGATTC—3，(SEQ ID N0.7)；
[0056]检测探针:
[0057]5’NH3— TTTTTTTTTTGATATAAAGAGTCACAAATAGAGATT— 3’ (SEQ ID N0.8)。
[0058]将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的印度紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出印度紫檀。
[0059]刺猬紫檀:
[0060]引物1:5，Hex—CAATCCCGGCGCCTCCGGGCACC—3，(SEQ ID N0.10)；
[0061]引物2:5’ 一GAGGTCGCGTCATGGGCGGCGG—3，(SEQ ID N0.11)；
[0062]检测探针:
[0063]5’ NH3-TTTTTTTTTTTTGAGATTGCGCTCAACCGCCACCTGTCG— 3J (SEQ ID N0.12)。
[0064]将所设计的引物和探针在NCBI上进行同源性比对，结果显示引物和探针序列只与报道的刺猬紫檀序列100%相似。另外，比对结果显示序列与其他树种虽有一定的相似，但是无法与其他树种序列进行有效结合，从而只能扩增和检测出刺猬紫檀。
[0065]并且，通过同源比对，在3种花梨木的叶绿体基因组上找到了一段高度保守的基因序列，并将其作为管家基因对制备的芯片进行质控。序列如下:
[0066]5， AATAATTTTTCGTCTACCTTATCCTTCTTCAAGGATCCTTTGATTCATTATGTTAGATATCAAGGAAAATCCATTCTGGCTTCAAAGAATGCGCCTCTTTTGATGAATAAATGGAAATACTATCTCATCTATTTCTGGCAATGTCATTTTGATGTTTGGTCTCAACCAGGAACGATCCATATAAACCAATTATTATCCG—3’ (SEQ ID N0.13)
[0067]针对管家基因序列，设计PCR扩增引物及其修饰位点如下:
[0068]质控引物1:5，Hex—AATAATTTTTCGTCTACCTTATC—3，(SEQ ID N0.14)；
[0069]质控引物2:5’ 一CGGATAATAATTGGTTTATATG— 3，(SEQ ID N0.15)。
[0070]针对管家基因序列，设计检测探针的序列及其修饰位点如下:
[0071]5JNH3-TTTTTTTTTGATAGTATTTCCATTTATTCATCAAAAGAGGCGC— 3J (SEQ ID N0.16)。
[0072]将以上引物和检测探针送上海生物工程有限公司进行人工合成。引物的5’端带HEX荧光标记，备用。探针的5’端带氨基基团，即探针的氨基化，备用。
[0073]实施例3模板提取[0074]用OMEGA的植物基因组提取试剂盒SP Plant DNA Maxi Kit (购自美国OmegaBio-Tek公司)，取用安达曼紫檀、印度紫檀、刺猬紫檀三种木材的心材部分提取总DNA。提取方法及步骤详见说明书。最后将DNA溶解于水中，制备成浓度为lOng/μ I的溶液。
[0075]实施例4PCR扩增及荧光标记
[0076]用已经荧光标记的引物对提取的模板进行PCR扩增(采用日本TaKaRa公司的PCRAmplification Kit), PCR 扩增体系如下:
[0077]
【权利要求】
1.检测刺猬紫檀(Pterocarpuserinaceus Poir.)的专用探针,其特征在于,其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ IDN0.12所示序列的反向互补序列的DNA片段。
2.检测刺猬紫檀的基因芯片，其特征在于，其含有权利要求1所述的专用探针。
3.检测刺猬紫檀的装置，其特征在于，其包括如权利要求1所述的专用探针或者如权利要求2所述的DNA芯片。
4.如权利要求3所述的装置，其特征在于，所述的装置还包括引物对，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.11所示。
5.如权利要求4所述的装置，其特征在于，所述的引物上含有荧光标记。
6.检测刺猬紫檀的引物，其特征在于，其是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.10或SEQID N0.11所示的DNA片段。
7.如权利要求6所述的引物，其特征在于，所述的引物上含有荧光标记。
8.—种检测刺猬紫檀的方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)制备待测样本的总DNA，作为模板，用含检测标记的引物对进行PCR扩增，获得PCR产物，所述的引物对中，一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.10，另一条引物的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID N0.11所示； (2)将专用探针结合于基因芯片的片基上，洗去未结合的探针，获得检测刺猬紫檀的基因芯片，所述的专用探针是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示的DNA片段，或者是核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0.12所示序列的反向互补序列的DNA片段； (3)在步骤(2)所得的检测刺猬紫檀的基因芯片中加入步骤(1)所得的PCR产物，进行杂交，洗去未杂交的PCR产物； (4)检测步骤(3)所得的杂交后的基因芯片。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的基因芯片的片基是醛基片基，所述的探针是氨基化探针。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的基因芯片的另外的加样孔中加入花梨木管家基因检测探针，所述的花梨木管家基因检测探针的序列如序列表中SEQID N0.16所示序列的核苷酸片段。
【文档编号】C12N15/11GK103834742SQ201410103717
【公开日】2014年6月4日 申请日期:2014年3月20日 优先权日:2014年3月20日
【发明者】李瑶, 周佳海, 张颖, 寿勇明 申请人:中国科学院上海有机化学研究所, 上海化学工业区医疗中心