炎症性疾病的判定方法

专利名称：：炎症性疾病的判定方法
技术领域：
：本发明涉及炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于蛋白酶体a亚基6型基因中的基因多态性；还涉及该方法中使用的寡核苷酸；含有该寡核苷酸的炎症性疾病诊断用试剂盒；以及它们的应用。本发明进一步涉及利用蛋白酶体a亚基6型基因进行的炎症性疾病治疗药物的筛选方法。
背景技术：
：炎症是动脉粥样形成、斑块破裂以及导致腔内血栓的动脉粥样性损伤的迅速发展的一个因素，因此在冠状动脉疾病的发病中发挥重要作用(非专利文献i)。最近，心肌梗塞感受性的几种候选基因通过使用含有单核苷酸多态性(SNPs)的基因多态性标志的连锁分析和/或患者.对照相关分析进行鉴定(非专利文献2-7、以及专利文献1和2)。令人感兴趣的是，这些基因产物的大部分都显示与炎症相关。26S泛素-蛋白酶体系统是在编程性细胞死亡、细胞周期、细胞分裂/分化以及炎症相关蛋白质水平的调节中担当重要作用的主要的蛋白质分解途径(非专利文献8-11)。与炎症途径相关的蛋白酶体的最重要功能之一是分解抑制核内因子kappaB(NFkB)活化的IkappaB(IkB)蛋白质。这里，NFkB是调节参与蛋白酶体发生的细胞因子或粘着分子等的炎症相关基因的表达的中心性转录因子(非专利文献8)。非专利文献l:HanssonG.K.,N.Engl.J.Med.352，1685-1695(2005)非专利文献2:Yamada,Y茅人.，N.Engl.J.Med.347,1916-1923(2002)非专利文献3:OzakiK等人.，NatGenet.32,650-654(2002)非专利文献4:WangL等人.，Science302:1578-81(2003)非专利文献5:HelgadottirA等人.，Nat.Genet.36:233-239(2004)非专利文献6:Ozaki，K等人.，Nature429:72-75(2004)非专利文献7:Cipollone，F等人.，JAMA291:2221-2228(2004)5非专利文献8:Karin，M.等人.，Semin.Immunol.12:85-98(2000)非专利文献9:Maki,C.等人.，CancerRes.56:2649-2654(1996)非专利文献10:Salghetti，S.E.等人.，EMBOJ.18:717-726(1999)非专利文献ll:Dimmeler,S.等人.，J.Exp.Med.189:1815-1822(1999)专利文献l:WO2004/015100号^H艮专利文献2:WO2005/017200号7/^艮
发明内容本发明的课题在于提供鉴定与心肌梗塞具有相关性的基因多态性、利用该基因多态性判定以心肌梗塞为代表的炎症性疾病的方法；可在该方法中使用的寡核苷酸；炎症性疾病诊断用试剂盒；以及炎症性疾病的治疗药物等。在此之前，本发明人通过使用92,778个SNP标志的全基因组患者.对照相关分析，发现了编码在血管炎症进程的初期阶段产生的细胞因子之一的淋巴毒素a基因(LTA)的功能性SNP具有心肌梗塞感受性(非专利文献3)。LTA刺激LTA受体，则作为抑制伙伴(inhibitorypartner)的IkB蛋白质被蛋白酶体分解，由此使NFkB活化(Beinke,S.,等人.，Biochem丄382:393-409(2004)),由此确立了以下的假说编码蛋白酶体蛋白质的基因的突变可能会产生心肌梗塞的风险。由7a-亚基和10p-亚基构成的20S蛋白酶体是26S蛋白酶体系统的中心颗粒(Coux,O.，等人.，Annu.Rev.Biochem.65:801-847(1996))。才艮据国际性的HapMap才居库(http:〃hapmap,org)(TheinternationalHapMapconsortium.TheInternationalHapMapProject.Nature426:789-796(2003);和TheinternationalHapMapconsortium.INTEGRATINGETHICSANDSCIENCEINTHEINTERNATIONALHAPMAPPROJECT.NatureReviewsGenetics5:467-475(2004)),以及JSNP数才居库(http:〃snp.ims.u-tokyo.ac.jp)(Haga,H等人.，J.Hum.Genet.47:605-610(2002))信息，本发明人选择了最小等位基因频率超过10%、覆盖编码该亚基的基因的基因组区域的大部分单倍型的SNP。接着，对450名心肌梗塞患者和450名对照，比较他们的SNP基因座中的基因型频率(表1和表2),了解到PSMA6外显子1中的一个SNP(dbSNPID:rsl048990)(5'UTR-8C〉G)与心肌梗塞显著相关(表1和表2)。还发6现，该SNP对该基因的转录活性有影响，结果基因产物量变化，该变化可能引起心肌梗塞等疾病。本发明根据上述认识完成。即，本发明提供炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于蛋白酶体a亚基6型基因中的至少一种基因多态性。本发明还提供炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于蛋白酶体a亚基6型基因中的至少一种单核普酸多态性。本发明又提供炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测选自下述(1)-(3)的至少一种单核普酸多态性(1)蛋白酶体a亚基6型基因的外显子1第-8位碱基的C/G多态性，(2)蛋白酶体a亚基6型基因的内含子1第1233位碱基的A/T多态性，以及(3)上述(1)或(2)所述多态性、和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性。本发明还提供炎症性疾病的判定方法，其特征在于以蛋白酶体a亚基6型的表达量或活性作为指标进行判定。优选炎症性疾病为心"几梗塞。本发明又提供寡核苷酸，该寡核苷酸可以与含有选自下述(l)-(3)的至少一个位点的、连续至少10个碱基的序列、或者其互补序列杂交，在上述任意方法中用作探针(1)蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位，(2)蛋白酶体a亚基6型基因内含子1的第1233位，(3)上述(1)或(2)所述的多态性和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性位点。本发明还提供寡核苷酸，该寡核苷酸可以扩增含有选自下述(1)-(3)的至少一个位点的、连续至少IO个碱基的序列、和/或其互补序列，在上述任意方法中可用作引物(1)蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位，(2)蛋白酶体a亚基6型基因内含子1的第1233位，(3)上述(1)或(2)所述的多态性和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性位点。优选引物是正向和/或反向引物。本发明还提供炎症性疾病诊断用试剂盒，该试剂盒含有上述任意一项所述的寡核苦酸的一种以上。优选炎症性疾病是心肌梗塞。本发明提供蛋白酶体a亚基6型的表达状态的分析方法，该方法包含检测蛋白酶体a亚基6型基因的外显子1第-8位碱基的C/G的单核苷酸多态性。本发明还提供蛋白酶体a亚基6型的转录活性的测定方法，该方法包括将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1的第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性的蛋白酶体a亚基6型基因片段导入细胞，培养该细胞，对该基因的表达进行分析。本发明还提供抑制蛋白酶体a亚基6型基因转录活性的物质的筛选方法，该方法包含将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性的蛋白酶体a亚基6型基因片段导入细胞，在抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的候选物质存在下培养该细胞，分析该基因的表达。本发明又提供通过上述筛选方法获得的、抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的物质。优选将在上述蛋白酶体a亚基6型基因片段的下游结合报道基因而成的转录单元导入细胞中，培养该细胞，通过测定报道活性来分析该基因的表达。优选上述报道基因是萤光素酶基因。本发明还提供蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的筛选方法，该方法包括将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G的单核苦酸多态性的基因片段与预想可能存在蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的试样接触，检测上述片段与转录控制因子的结合。优选检测通过凝胶移位分析进行。本发明又提供炎症性疾病的治疗药物，该药物含有抑制蛋白酶体a亚基6型基因的表达或活性的物质作为有效成分。优选抑制蛋白酶体a亚基6型的表达或活性的物质是针对蛋白酶体a亚基6型的siRNA或抗体。本发明还提供炎症性疾病治疗药物的筛选方法，该方法包含以下步骤使细胞与候选物质接触的步骤；对细胞内编码蛋白酶体a亚基6型的基因的表达量进行分析的步骤；以及与不存在在候选物质的条件进行比较，选择使该基因的表达量降低的候选物质作为炎症性疾病的治疗药物的步骤。根据本发明，可以正确且迅速地进行以心肌梗塞为代表的炎症性疾病的是否发病的判断、疾病发病可能性的判断。已经证实粥样动脉硬化病变的新生内膜区域中，泛素与a平滑肌细胞肌动蛋白共存，以及泛素-蛋白酶体系统在动脉粥样发病初期、进行期和末期发挥重要作用(Hermann,J,等人.，Cardiovasc.Res.61:11-21(2004))。并且，有报道指出泛素-蛋白酶体途径的药理学抑制剂通过抑制NFkB的活化，显著减弱动物模型的心肌回流障碍、缺血性脑梗塞以及粥样动脉硬化(Meiners,S.等人.，Circulation105:483-489(2002);Pye，J.等人.，Am.J.Physiol.HeartCirc.Physiol.284:H919-H926;Elliott,P丄等人.，J.Mol.Med.81:235-245(2003);Dagia,N.M.等人.，Am.J.Physiol.CellPhysiol.285:C813-C822(2003);WojcikC.等人.Stroke35:1506-1518(2004);以及Heyninck,K等人.TrendsBiochem.Sci.30:1-4(2005))。因此，结合考虑本发明的PSMA6的SNP基因相关及其功能性作用，泛素-蛋白酶体途径可能在心肌梗塞发病方面发挥重要的功能。实施发明的最佳方式[l]炎症性疾病的判定方法曰J定基因中的基因多态性，特别是单核苷酸多态性(SNPs),来判定炎症性疾病是否有发病、或者炎症性疾病发病的可能性的方法。上述特定基因是指蛋白酶体a亚基6型基因，基因多态性是存在于含有该基因的基因组DNA的外显子或内含子中。本发明中，"检测存在于蛋白酶体a亚基6型基因中的至少一种基因多态性(单核苷酸多态性等)"是指(i)直接检测该基因多态性(称为基因一侧多态性)，以及(ii)检测存在于上述基因的互补序列一侧的基因多态性(称为互补一侧多态性)，由其结果推定基因一侧多态性的两者。基因一侧的碱基和互补序列一侧的碱基并不一定为完全的互补关系，因此更优选直接检测基因一侧多态性。本发明中，作为检测对象的单核苷酸多态性，例如有存在于蛋白酶体a亚基6型基因中的基因多态性，更具体地说，有选自下述(1)-(3)中至少一种单核普酸多态性(1)蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G多态性，(2)蛋白酶体a亚基6型基因内含子1的第1233位碱基的A/T多态性，(3)上述(1)或(2)所述的多态性和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性位点。蛋白酶体a亚基6型基因(PSMA6基因)的碱基序列是公知的，例如在美国国立生物信息中心(NCBI)以登记号NC_000014登记。本说明书中，将外显子或内含子中的第X位碱基用表示其位置的数字X和表示碱基的符号组合表示。例如，蛋白酶体a亚基6型基因外显子1的"-8C/G"表示位于外显子1第-8位(自起始密码子起上游方向第8个碱基的位置)的C或G。序列表的SEQIDNO.l表示外显子1及其上游的碱基序列。外显子1的第-8位相当于SEQIDNO.l中第102位的碱基(C)。蛋白酶体a亚基6型基因内含子1的1233A/T表示位于内含子1第1233位位置的A或T。序列表的SEQIDN0.2表示内含子1的碱基序列。内含子1第1233位在SEQIDN0.2中相当于第1233位碱基。本发明中，蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位i威基为G时、或蛋白酶体a亚基6型基因内含子1第1233位碱基为T时，可以判定炎症性疾病发病或者发病的可能性高。与此相对，蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基为C时、或蛋白酶体a亚基6型基因内含子1第1233位石咸基为A时，可以判定炎症性疾病不发病或者发病的可能性低。本发明中，可以使用上述(1)或(2)所述的多态性、和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性。链锁不平衡是指以比两个等位基因分别独立遗传时更大的频率互相连锁遗传。SNPs标志在包括日本人的亚洲人和欧洲人中，在平均22kb以内保持链锁不平衡。在非洲人中在平均11kb以内保持链锁不平衡。并且，将表示上述链锁不平衡的一组等位基因称作单倍型。蛋白酶体a亚基6型基因座中，如果有多个SNPs,则其多态性的组合因人而异。该组合即所谓的单倍型标志，表示了个体的多样性。利用上述单倍型标志可以建立受试者的遗传信息与炎症性疾病的因素的相关性。对于2个SNP,以第一SNP的各等位基因为(A,a)，第二SNP的各等位基因为(B,b),四个单倍型(AB、Ab、aB、ab)的各频率分别为PAB'、PAb、PaB'、Pab,可由下式获得链锁不平衡系数D'。D'=(PP-PP)/Min[(P+P)(P+P),(P+P)(P+P)]ABabAba3ABaBoBabABAbAbftb是指(p+p)(p+p)和(p+ABaBaBabABAbAbfibABoBaBabABP)(P+P)中的较小值。]处Abab本发明中，可以使用链锁不平衡系数D'为0.8以上、更优选0.95以上、进一步优选0.99以上、最优选l的多态性。本说明书中，疾病的"判定"是指疾病是否发病的判断、疾病发病可能性的判断(罹患危险性的预想)、疾病的遗传因素的分析等。疾病的"判定"可以将上述单核苷酸多态性的检测方法所得的结果、根据需要进行的其它的多态性分析(VNCR或RFLP)和/或其它检查结果组合进行。本说明书中，"炎症性疾病"只要是可见诱导了与炎症性病态相关的、已知细胞粘着因子或细胞因子的疾病即可，没有特别限定，例如有慢性类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮、炎症性肠炎、各种变应反应、细菌性休克、心肌梗塞或脑卒中等动脉硬化性疾病等，特别是心肌梗塞。(检测对象)基因多态性的检测对象优选基因组DNA，可以根据情况(即，多态性位点及其相邻区域的序列为与基因组相同或完全互补时)使用cDNA或mRNA。另外，由上述对象采集的试样可以是任意的生物学试样，例如血液、骨髓、精液、腹腔液、尿液等体液；肝脏等组织细胞；毛发等体毛等。基因组DNA等可根据常规方法从这些试样中提取纯化并制备。(扩增)检测基因多态性时，首先扩增含有基因多态性的部分。扩增例如可通过PCR法进行，也可以通过其它公知的扩增方法，例如NASBA法、LCR法、SDA法、LAMP法等进行。ii引物的选择可以通过扩增，例如SEQIDNO.l或2所示的石威基序列中含有上述单核普酸多态性位点的连续至少10个碱基以上、优选10-100个石威基、更优选10-50个碱基的序列和/或其互补序列进行。引物只要是可发挥扩增含有上述单核苷酸多态性位点的规定碱基数的序列的引物功能即可，其序列可以含有一或多个取代、缺失、附加。扩增所使用的引物可以选择试样仅在等位基因型一方的情况下被扩增，并且正向引物或反向引物其中一方与单核苷酸多态性位点杂交。引物可根据需要用荧光物质或放射性物质等标记。(基因多态性的检测)基因多态性的检测可以通过特异性的探针与等位基因型一方杂记:探针只要;有上述单核苦酸多态性;:点、与受检试样杂i在所采用的检测条件下具有可检测的程度的特异性即可，没有任何限定。探针例如可使用可以与SEQIDNO.1或2所示的序列中的含有上述单核苷酸多态性位点的连续至少IO个碱基以上、优选10-100个碱基的序列，更优选10-50个碱基的序列，或它们的互补序列杂交的寡核苷酸。优选选择单核苷酸多态性位点处于探针的大致中心部位的寡核苷酸。该寡核苷酸只要可发挥探针的功能，即，在与目标等位基因型序列杂交、但与其它等位基因型的序列不杂交的条件下杂交即可，其序列中可以含有1或多个取代、缺失、附加。另外，探针可以与基因组DNA退火，形成在RCA(滚环扩增)法扩增中使用的单链探针，也包含由于形成环状而满足上述探针条件的探针。本发明使用的杂交条件是足以区别等位基因型的条件。例如，试样为等位基因型一方时杂交、为其它等位基因型时则不杂交的条件，例如严格条件。这里，"严格条件"例如有分子克隆实验手册第二版(Sambrook等人.，1989)中所述的条件等。具体来说，例如有在含有6xSSC(lxSSC的组成0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠，pH7.0)、0.5%SDS、5xDenhardt试剂和100mg/mL绅鱼精子DNA的溶液中与探针一起在65。C下保温过夜的条件等。探针可以将一端固定在基板上、以DNA芯片的形式使用。这种情况下，DNA芯片上可以只固定与等位基因型一方对应的探针，也可以固定与等位基因型双方对应的探针。基因多态性的检测可通过限制酶片段长度多态性分析(RFLP)进行。该方法中，用限制酶消化试样核酸，调查消化产物片段的大小，由此可以调查该限制酶是否切断了试样核酸，由此可以分析试样的多态性，其中，是否被限制酶切断是根据单核苷酸多态性位点采取哪一种基因型而不同。基因多态性的检测可通过扩增产物直接进行序列确定(直接测序)。序列确定例如可通过双脱氧法、Maxam-Gilbert法等公知的方法进行。基因多态性的检测可通过侵入检测(Invaderassay)进行。该方法使用了具有侵入寡聚物和5'侧翼(7，少7°)结构的、用于检测SNP的互补性寡聚物(信号探针)，所述的侵入寡聚物具有与测试是否有SNP的DNA靶片段互补的序列。首先，使针对靶DNA的侵入寡聚物和信号探针杂交。此时，侵入寡聚物和探针的一个碱基具有重叠结构(侵入性结构)。裂解酶(由Archaeoglobusfulgidus分离的侧翼内切核酸酶)作用于这一部分，当SNP位点的信号探针的碱基与靶的碱基互补(没有SNP)时，信号探针的5'侧翼(7卩^7°)被切断。切断的5'侧翼与FRET探针(焚光共振能量转移探针)杂交。在FRET探针上，荧光染料与猝灭剂接近，焚光受到抑制，但通过结合5'侧翼DNA，裂解酶将荧光染料部分切断，可检测出荧光信号。基因多态性的检测还可以采用变性梯度凝胶电泳法(DGGE)、单链构象多态性分析(SSCP)、等位基因特异性PCR、ASO(等位基因特异性寡核苷酸)的杂交法、错配位点的化学切割(CCM)、HET(异源双链)法、PEX(引物延伸)法、RCA(滚环扩增)法等。炎症性疾病诊断用试剂盒作为上述引物或探针的寡核苷酸可以以含有它们的炎症性疾病诊断用试剂盒的形式提供。试剂盒可以含有在上述基因多态性分析法中使用的限制酶、聚合酶、核苷三磷酸、标识、緩冲液等。蛋白酶体a亚基6型表达状态的分析方法根据本发明，通过检测蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位13碱基的C/G碱基的单核苷酸多态性，可以分析蛋白酶体a亚基6型的表达状态。即，当蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基为G时，可以判断蛋白酶体a亚基6型的表达量多，当蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基为C时，可以判断蛋白酶体a亚基6型的表达量少。蛋白酶体a亚基6型转录活性的测定方法根据本发明，将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性的蛋白酶体a亚基6型基因片段导入细胞中，培养该细胞，分析该基因的表达，由此可以测定蛋白酶体a亚基6型转录活性。根据本发明的优选方案，将在上述蛋白酶体a亚基6型基因片段的下游结合有报道基因的转录单元导入细胞中，培养该细胞，通过测定报道活性，由此来分析该基因的表达。单核苷酸多态性存在于启动子部位时，将在含有该单核苷酸多态性的基因的下游插入了报道基因的系统导入到细胞中，培养该细胞，测定报道活性，由此可以测定单核香酸多态性导致的转录效率差异。这里，报道基因可以使用萤光素酶、氯霉素、乙酰转移酶、半乳糖苷酶等的基因。抑制蛋白酶体a亚基6型基因转录活性的物质的筛选方法
技术领域：
：本发明中，将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G单核普酸多态性的蛋白酶体a亚基6型基因片段导入细胞，在抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的候选物质的存在下培养该细胞，分析该基因的表达，由此可以筛选抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的物质。根据本发明的优选方案，将在上述蛋白酶体a亚基6型基因片段的下游结合有报道基因的转录单元导入细胞，培养该细胞，测定报道活性，由此可以分析该基因的表达。例如，在具有可见蛋白酶体a亚基6型基因表达量显著高的单核苷酸多态性(例如蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基为G时)基因的下游插入报道基因，在候选物质的存在或非存在两种情况下培养导入了上述系统的细胞，如果在候选物质存在下培养时报道活性降低，则可以选择该候选物质作为抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的物质。这里，报道基因可使用上述所例举的基因。候选物质可以使用任意的物质。候选物质的种类没有特别限定，可以是各种低分子合成化合物，也可以是存在于天然提取物中的化合物，或者可以是化合物文库、噬菌体展示文库、组合文库。候选物质优选为低分子化合物，优选为低分子化合物的化合物文库。化合物文库的构建是本领域公知的，也可以使用市售的化合物文库。由上述筛选方法得到的抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的物质也在本发明的范围内。上述抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的物质可用作心肌梗塞治疗药、抗炎症药、免疫抑制药等各种药物的候选物质。蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的筛选方法
技术领域：
：本发明中，还可以将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性的基因片段与预想存在蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的试样接触，通过检测上述片段与转录控制因子的结合，可以筛选蛋白酶体a亚基6型转录控制因子。对含有上述单核苷酸多态性的基因片段与预想存在蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的物质的结合的检测，可通过凝胶移位法(电泳迁移率变动分析(EMSA))、DNaseI足迹法等进行，优选凝胶移位法。凝胶移位法中，如果与蛋白质(转录控制因子)结合，则分子大小增加，电泳中DNA迁移率降低，因此将用32P标记的基因片段与转录控制因子混合，进行凝胶电泳。如果通过放射自显影观察DNA的位置，则会看到与因子结合的DNA移动緩慢，因此检测出比通常的条带移动緩慢的条带。炎症性疾病的治疗药物本发明中，如以下实施例所示，在心肌梗塞患者中，蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基为G的概率高，由此显示蛋白酶体a亚基型的表达亢进。结果，蛋白酶体a亚基6型显示与心肌梗塞等炎症性疾病的发病、进展相关，同时有望通过抑制蛋白酶体a亚基6型的表达或活性来治疗心肌梗塞等炎症性疾病。另外，抑制蛋白酶体a亚基6型活性的途径，例如可以使用通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质、或蛋白酶体a亚基6型的抗体。含有抑制蛋白酶体a亚基6型的表达或活性的物质作为有效成分的炎症性疾病的治疗药也包含在本发明的范围内。这里所使用的抑制蛋白酶体a亚基6型表达或活性的物质可以是低分子化合物，也可以是通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质，还可以是蛋白酶体a亚基6型的抗体，优选低分子化合物或通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质。RNAi(RNA干扰)指导入到细胞中的双链RNA抑制具有相同序列的基因表达的现象。通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质的具体例子有下述的siRNA或shRNA等。siRNA是小干扰RNA的简称，是约21-23个碱基左右长度的双链RNA。siRNA只要可以引起RNAi即可，可以是任何形态，例如可以是化学合成或生物化学合成、或生物体内合成所得到的siRNA,或者约40个碱基以上的双链RNA在体内分解得到的10个碱基对以上的短链双链RNA等。siRNA的序列优选与蛋白酶体a亚基6型的mRNA的部分序列100%—致，也可以不必100%—致。siRNA的碱基序列与蛋白酶体a亚基6型基因的碱基序列之间具有同源性的区域优选不含有蛋白酶体a亚基6型基因的翻译起始区域。具有同源性的序列优选距离蛋白酶体a亚基6型基因翻译起始区20个碱基，更优选距离70个碱基。具有同源性的序列，例如可以是蛋白酶体a亚基6型基因的3'末端附近的序列。通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质可以使用生成siRNA的、约40个碱基以上的dsRNA等。例如可以使用含有与蛋白酶体a亚基6型基因的核酸序列的一部分具有约70%以上、优选75%以上、更优选80%以上、更优选85%以上、进一步优选90%以上、特别优选95%以上、最优选100%同源性的序列的、含有双链部分的RNA或其变异体。具有同源性的序列部分通常至少为15个核苷酸以上、优选约19个核苷酸以上、更优选至少20个核苷酸以上、进一步优选21个核普酸以上。通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质可以使用在3'末16端具有突出部分的、含有短的发夹结构的shRNA(短发夹RNA)。shRNA是指在单链RNA中通过含有部分回文状的碱基序列形成分子内双链结构的、形成发夹状的结构的约20个碱基对以上的分子。shRNA优选具有3'突出末端。双链部分的长度没有特别限定，优选10个核苦酸以上、更优选20个核苷酸以上。这里，3'突出末端优选为DNA，更优选为至少2个核苷酸以上的DNA,进一步优选为2-4个核苷酸的DNA。通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质可以通过人工化学合成，也可以将使有义链和反义链的DNA序列相反连接而成的发夹结构的DNA用T7RNA聚合酶体外合成RNA来制备。体外合成时，使用T7RNA聚合酶和T7启动子，可以由模板DNA合成反义和有义RNA。将它们在体外退火，然后导入到细胞中，则发生RNAi，可以抑制蛋白酶体a亚基6型的表达。向细胞内的导入，例如可通过采用磷酸钓或各种转染试剂(01igofectamine、LipofectAMINE和脂质转染)的方法等进行。通过RNAi抑制蛋白酶体a亚基6型表达的物质可以使用含有编码上述siRNA或shRNA的核酸序列的表达载体。还可以使用含有该表达载体的细胞。上述表达载体或细胞的种类没有特别限定，优选已经作为药物使用的表达载体或细胞。蛋白酶体a亚基6型的抗体可通过常规方法制备。例如蛋白酶体a亚基6型的多克隆抗体可以以蛋白酶体a亚基6型作为抗原，」接照本领域公知的方法免疫任意哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、牛等)，从该哺乳动物中采集血液，从采集的血液中分离并纯化抗体获得。给予抗原时，可以使用适当的佐剂。从血液中分离、纯化抗体，例如可以通过离心、使用硫酸铵或聚乙二醇的沉淀、凝胶过滤层析、亲和层析等层析等通常的方法进行。另外，蛋白酶体a亚基6型的单克隆抗体可以使用杂交瘤，按照常规方法制备。炎症性疾病的治疗药物的筛选方法
技术领域：
：本发明中，炎症性疾病显示与蛋白酶体a亚基6型的表达或活性的亢进有关，由此，使蛋白酶体a亚基6型的表达或活性降低的物质可用作炎症性疾病的治疗药物。根据本发明，进一步提供筛选使蛋白酶体a亚基6型的表达或活性降低的物质的方法。上述筛选的一个例子可通过以下步骤进行使细胞与候选物质接触的步骤；对细胞内编码蛋白酶体a亚基6型的基因表达量进行分析的步骤；以及与候选物质非存在的条件比较，选择使该基因的表达量降低的候选物质作为炎症性疾病的治疗药物的步骤。另外，上述筛选的另外的例子还可通过以下步骤进行使蛋白酶体a亚基6型与候选物质接触的步骤；测定蛋白酶体a亚基6型的活性的步骤；以及与候选物质非存在的条件比较，选择使蛋白酶体a亚基6型活性降低的候选物质作为炎症性疾病的治疗药物的步骤。这里所述的蛋白酶体a亚基6型的活性例如有分解IkB蛋白、活化NFkB的活性。可以使用任意物质作为候选物质。候选物质的种类没有特别限定，例如可使用本说明书中上述[5]所述的各种文库等。通过以下实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不限于下述的实施例。实施例实施例1:(方法)本实施例中，是以由大阪急性冠状动脉不全研究会(OACIS)调查的3，459名日本人心肌梗塞患者为对象。心肌梗塞的确诊按照已有报道(OzakiK.等人.,NatGenet.32,650-654(2002))。对照受试者由经由曰本的多个医疗机构募集的3,955名的一般人群构成。全部对象均为曰本人，在参予本研究时均有书面的知情同意。并且，20岁以下的受试者按照横滨理研研究所基因多态性研究中心伦理委员会所认可的手续征得了监护人的同意。在以下SNP分析中，对于PCR引物的设计、PCR实验、DNA提取、DNA测序、SNP的发现、SNP基因型鉴定和统计分析均按已有报道进行(OzakiK.等人.，NatGenet.32,650-654(2002)、和Ozaki,K.等人.,Nature429:72-75(2004))。(结果)本发明人首先确立了编码蛋白酶体蛋白质的基因的突变可能赋予发生心肌梗塞的风险的假说。由7a亚基和IO卩亚基构成的20S蛋白酶体是26S蛋白酶体系的中心颗粒(Coux，O.,等人.,Annu.Rev.Biochem.65:801-847(1996))。根据国际性HapMap数据库(http:〃hapmap.org)(TheinternationalHapMapconsortium.TheInternationalHapMapProject.Nature426:789-796(2003);以及TheinternationalHapMapconsortium.INTEGRATINGETHICSANDSCIENCEINTHEINTERNATIONALHAPMAPPROJECT.NatureReviewsGenetics5:467-475(2004))以及JSNP数据库(http:〃snp.ims.u-tokyo.ac.jp)的信息，本发明人选择了最小等位基因频率超过10%、覆盖编码该亚基的基因的基因组区域的大部分单倍型的SNP。接着，对450名心肌梗塞患者和450名对照，比较他们的SNP基因座中的基因型频率(表1和表2),了解到PSMA6外显子1中的一个SNP(dbSNPID:rsl048990)(5'UTR-8C〉G)与心肌梗塞显著相关(表1和表2)。[表1]表l:心肌梗塞与编码20S蛋白酶体a和J3亚基的基因中的SNP的相关分析Ml对照等位基因l对等位基因2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表2:rs6E6819631714617卿287156134560.440.511.080.86-1.36)rs縱810125213035477219208274540.5S0.441.08(0.881.33)PSM83rs2019203267化923鄉262165214480.420.511.08(0.87-1.33)PS細3ra2282752032055465189194494320.020邻1,01(0.83-1.23)PSWS3rs65926215，7fi56447180182534151.1￡0.271.12(0.92-1.37)PSMB3rs22828Q15120083434"7195764190.070.791.03'(0.87-1.24)PSMB4rs2296840132218120470"422310S4460.090.761.03(0.8^1.24)rs2479383224f74.3643419516124380O.M0.711.M(0.84"1.30)PSMB5rs3751舰322137473301124194440.2C0.651.06{0.83"1.34)PS鹏.rs8021195-308142.15鄉2921342447.0.42.0.521.08(0脈1.37)'PS鹏rs2304975棚228584451601站664240.010.911.01(0.8W.23)PS細Srs23a49743769344733608454490.02瞎1-02(0J6-1.38)PS細7re3739477410'392.451387612柳4.820.031.邻(1:05-么31)re翻01315521276443133217854411.410.23"2(0.9W.35)PS膨ra78649412明14431473303129144465.050.031.30(1.03-1.64》PS柳7rs13308"'19322357473186做774490邻0.321.10(0.91-1.33)PSJW88rs37S33642102105347321518149柳0朋0.351.10(0.90-1.34)PSW88re207154337497847937471了4522.BC0.091.29《0.38"1.74)PS,rs2071541節.115847431911015444'0_241.17(0.90-1.51)尸SM朋re2071627236193384732邻170284443.020.081.20(0.S8"1.邻)ra471360018322868479174228534550.330朋1.06《0.88-1.28)rs927胡20138213"64671的2181174441.930.161.14(0.95-1.37)PSM89is376334817722174472175222494462.02D.161.15(0.95"1.39)PS細9ra1758725618330鄉2幼1612B4470.B5D.421.09(0_88"1.35)尸S鹏Ors2加12邻322141470325105134431.0C0.321.14(0.8^1.4)rs2292318355113647433B10084460.011.02(0.7ft"1.33)再使用这些SNP,分析包括PSMA6区的单倍型结构，发现与心肌梗塞相关的SNP与PSMA6区域内和周围的其它7个SNP均不是链锁不平衡(LD)(表3)。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>[表4]表4:第二分组的相关性复制X2[P值](机会比率)<95。/oCl><table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>*核苷酸编号根据突变的命名而定实施例2:萤光素酶测定(方法)在pGL3-基础载体(Promega制备)中，将PSMA6的5'-侧翼区的由nt-600至外显子1的10，相当于内含子1的由nt1133至1343的DNA片段沿5'-3'方向克隆到萤光素酶基因上游。经过48小时的转染后，将细胞用被动溶解緩沖液(Promega制备)溶解，使用双萤光素酶报道基因检测系统测定萤光素酶活性。(结果)为了明确PSMA5的2个SNP、即，外显子1的-8C/G和/或内含子1的1233A/T是否对其表达水平有影响，构建含有与这些SNP对应的DNA片段的四种质粒克隆。该构建物是沿5'-3'方向具有含有外显子1的SNP的基因组片段、内含子1的SNP(分别为-8C-1233A、-8G-1233A、-8C-1233T和-8G-1233T的各单倍型)的基因组片段和萤光素酶基因转录单元。由图2显示，含有-8G-1233A单倍型和-8G-1233T单倍型的克隆显示出含有其它两个单倍型的克隆的大约1.5-1.7倍的转录活性。这显示不是内含子1内的取代、而是外显子1内的取代对PSMA6的转录水平有影响。实施例3:凝月交移位试验(方法)在MgCl2和CaCl2的存在下，使已报道(Andrews，N.C.等人.，NucleicAcidRes.11,2499(1991))的HepG2细胞制备的核提取物，与利用DIG凝胶移位试剂盒(Roche制备)由地高辛(DIG)-11-dUTP标记的16个寡核苷酸(PSMA6的外显子1的第-15至l)的三个串联拷贝一起温育。反应是在没有Poly[I(dc)]试剂的条件下、在室温下进行。为了进行竟争实验，在添加DIG标记寡核苷酸之前，将核提取物与未标记寡核苷酸(过量125倍)一起预先温育。蛋白质/DNA复合体是在0.5xTis-Borate/EDTA(TBE)緩冲液中的未改性6%聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen制备)上分离，转移至硝基纤维素膜。信号是使用化学发光检测系统(Roche制备)，按照使用说明书进行检测。(结果)对于为已知的蛋白质、虽然预想其并非与上述实施例2的DNA片段结合的物质、但是对有无可能与相当于-8C等位基因或-8G等位基因的基因组序列的寡核苷酸结合的核内因子进行了研究。使用来自HepG2细胞的核提取物，观察到显示不是与C等位基因对应的泳道、而是与G等位基因对应的泳道的、结合于寡核苷酸的核蛋白质的一个条带(图2c)。由该结果显示，在该区域相互作用的、未鉴定的核内因子调节PSMA6的转录，并且显示对心肌梗塞感受性有影响。实施例4:等位基因表达变化的定量(方法)用EBV转化的B细胞4朱从理研生物资源中心购入。对于外显子1的-8C/G的SNP，从具有杂合的(、f口接合)基因型的7个细胞林制备mRNA，由该mRNA合成cDNA。按照已有报道(ShuenLo,H等人.GenomeRes.13:1855-1862(2003)),使用下述引物对和等位基因特异性探针，通过TaqMan测定进行转录基因表达实验。正向引物5，-GGGCCCAGGGATTGTGTT(SEQIDNO.3)反向引物5'-AATGGTAATGTGGCGGTCAAA(SEQIDNO.4)C等位基因特异性探针5，-FAM-MGTAGTGCTTCTACCMC(SEQIDNO.5)G等位基因特异性探针5，-VIC-MGTAGTGCTTGTACCAAC(SBQIDNO.6)(TaqMan测定用的所有引物和探针均由AppliedBiosystems合24成)。PCR反应是使用ABIPRISM7700序列分析系统(AppliedBiosystems制备)，在以下条件下实施。90。C10分钟一次、在将92°C0.25分钟和6CTC下1分钟进行40个循环。(结果)为了确认本发明的SNP对于转录的效果，对于7个分别的EBV转化的人B细胞林(HEV细胞珠)，使用TaqMan探针进行等位基因特异性定量PCR。HEV细胞珠由在-8C/GSNP基因座中具有杂合的基因型的个体采集。这些细胞抹中，关于PSMA6的表达量，G等位基因为C等位基因的1.7-1.8倍(表5)。由该实验结果和实施例2、3的结果可知，本发明的PSMA6的外显子1内的SNP在体外和体内均对其转录水平有影响。表5:PSMA6表达水平的等位基因变化_HEV32HEV36HEV38HEV40HBM3HEV51HEV52G/C比1.68±0.021.72±0.021.77:Jfl.011.7930.041J0iO.021.69*0.041.71±0加各细胞林均显示平均士SD。各样品是每测定进行3次实验，各测定均独立重复三次。实施例5:siRNA实验和蛋白质印迹分析(方法)(siRNA实验)PSMA6的耙序列(5'-GTGTGATCCTGCAGGTTAC-3')(SEQIDN0.7)克隆于pSilencer2.0-U6siRNA载体(Ambion制备)中。阴性对照是使用pSilencer阴性对照载体(Ambion制备)。通过核苷Nucleofector系统(Amaxa制备)共转染pNifty质粒载体、结合了NFkB特异性E-选择蛋白启动子的萤光素酶报道载体(Invivogen制备)、和内标用的pRL-TK载体(Promega制备)，然后将Jurkat细胞用PMA(20ng/mL)刺激2小时，回收细胞，使用双荄光素酶报道基因检测系统(Promega制备)测定萤光素酶活性。为了进行人冠状动脉血管内皮细胞(HCAEC)(三光纯药制备)的实验，使用pSilencer5.1-U6retrosystem(Ambion制备)，建立组成型表达反專争录病毒PSMA6siRNA的稳定的pT67细胞抹。使用稳定的pT67细胞林的上清对HCAEC感染72小时，接着转导pNiFty载体。转染24小时后，使用双安光素酶报道基因检测系统，测定萦光素酶活性，与全细胞蛋白质浓度比较，进行标准化。mRNA的定量方法按已知方法进行(OzakiK.等人.，NatGenet.32，650-654(2002))。(蛋白质印迹分析)PSMA6和对照siRNA与上述siRNA的实验同样，转染HCAEC细胞。细胞是使用20ng/mLPMA(Sigma制备)，刺激0分钟、5分钟、IO分钟、15分钟和45分钟，然后回收细胞，溶解于标准SDS-样品緩冲液中。进行SDS/PAGE和印迹法后，使用针对IkB-a、磷酸化IkB-a的兔多克隆抗体(CellSignaling制备)、以及辣根过氧化物酶标记兔第二抗体(Amersham制备)或人a微管蛋白(SantaCruz制备)和辣根过氧化物酶标记抗小鼠IgG抗体(Amersham制备)，使免疫复合物可一见化。(结果)IkB蛋白质的分解是调节炎症基因表达的中心性转录因子NFkB活化所不可缺的步骤。蛋白酶体复合体在该分解程序中发挥重要作用，因此采用siRNA(小干扰RNA)的方法研究IkB的分解和之后的NFkB的活化是否受PSMA6蛋白质的细胞内水平影响。如图3所示，针对PSMA6的一个siRNA显著抑制PSMA6的mRNA水平(图3a:Jurkat细胞，以及图3b:人冠状动脉血管内皮细胞(HCAEC)),因此，通过Jurkat细胞和HCAEC两者可使NFkB活性受到抑制(图3c和d)。并且，在用PMA刺激的状态下研究siRNA的效果，结果，由于PMA刺激，IkB在5分钟以内被磷酸化，用对照siRNA处理的HCAEC在15分钟以内分解(图3e,右图)。但是，将细胞用PSMA6特异性siRNA处理，则磷酸化的IkB的分解可见显著迟緩(图3e,左图)。由以上结果显示，由于PSMA6表达的变化，使泛素-蛋白酶体的生理学功能受损，显示对NFkB依赖性炎症途径相关的基因表达可能产生影响。实施例6:LTA、半乳凝素(galectin)-2、和PSMA6的SNP的组合使心肌梗塞危险率增加(来自各3000人的结果)26在所有的SNPs中，具有与心肌梗塞无关的基因型时，称为基因型0。任意SNPs中具有一个风险基因型时称为基因型1。任意SNPs中具有两个风险基因型时称为基因型2。具有三个风险基因型时称为基因型3。基因型0-3的相对的心肌梗塞的风险率(机会比率)如以下表6所示。[表6]基因型机会比率0111.922.4333.73产业实用性通过本发明，可以正确且迅速地判断是否有以心肌梗塞为代表的炎症性疾病发病、判断疾病发病可能性。附图简述图1表示PSMA6中的SNP与心肌梗塞的相关性。a表示PSMA6基因座中的SNP的图谱。约200名日本人的各SNP最小等位基因频率在括号内表示。B表示心肌梗塞与PSMA6外显子1的SNP的相关性。核香酸编号才艮才居突变命名法(mutationnomenclature)(DenDunnen,J.T.等.Hum.Mutat.15:7-12(2000))进行。图2表示HeLa细胞(a)和HepG2细胞(b)中PSMA6的外显子1的SNP转录调节活性。各实验重复三次，各试样分成三组用于研究。承student-T检验。c表示未知的核内因子与PSMA6的外显子1的结合。箭头为表示核内因子与G等位基因特异性结合的条带。图3表示PSMA6的表达水平对于NFkB的活化和IkB的分解的影响。a和b表示随机或PSMA6siRNA处理的Jurkat细胞(a)和HCAEC细胞(b)中的PSMA6mRNA水平。c和d表示Jurkat细胞(c)和HCAEC细胞(d)中的相对的NFkB活性。各实验重复三次，各试样分成三组用于研究。e表示PSMA6敲减(乂少夕夕、、々》)对HCAEC内的磷酸IkB-a分解的抑制。权利要求1.炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于蛋白酶体α亚基6型基因中的至少一种基因多态性。2.炎症性疾病的判定方法，该方法包含^r测存在于蛋白酶体a亚基6型基因中的至少一种单核苷酸多态性。3.炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测选自下述(l)-(3)的至少一种单核苷酸多态性.(1)蛋白酶体a亚基6型基因的外显子1第-8位碱基的C/G多态性，(2)蛋白酶体a亚基6型基因的内含子1第1233位碱基的A/T多态性，以及(3)上述(1)或(2)所述多态性、和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性。4.炎症性疾病的判定方法，其特征在于以蛋白酶体a亚基6型的表达量或活性作为指标进行判定。5.权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，炎症性疾病为心肌梗塞。6.寡核普酸，该寡核苷酸可以与含有选自下述(l)-(3)的至少一个位点的连续至少10个碱基的序列或者其互补序列杂交，在权利要求1-5中任一项所述的方法中用作探针(1)蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位，(2)蛋白酶体a亚基6型基因内含子1的第1233位，(3)上述(1)或(2)所述的多态性和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性位点。7.寡核苷酸，该寡核苷酸可以扩增含有选自下述(l)-(3)的至少一个位点的连续至少10个碱基的序列和/或其互补序列，在权利要求1-5中任一项所述的方法中用作引物(1)蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位，(2)蛋白酶体a亚基6型基因内含子1的第1233位，(3)上述(1)或(2)所述的多态性和链锁不平衡系数D'为0.8以上的链锁不平衡状态的多态性位点。8.权利要求7所述的寡核苷酸，其中，引物是正向和/或反向引物。9.炎症性疾病诊断用试剂盒，该试剂盒含有权利要求6-8中任一项所述的寡核苷酸的一种以上。10.权利要求9所述的试剂盒，其中，炎症性疾病是心肌梗塞。11.蛋白酶体a亚基6型的表达状态的分析方法，该方法包含检测蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性。12.蛋白酶体a亚基6型的转录活性的测定方法，该方法包括将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1的第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性的蛋白酶体a亚基6型基因片段导入细胞，培养该细胞，对该基因的表达进行分析。13.抑制蛋白酶体a亚基6型基因转录活性的物质的筛选方法，该方法包括将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G单核苷酸多态性的蛋白酶体a亚基6型基因片段导入细胞，在抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的候选物质存在下培养该细胞，分析该基因的表达。14.抑制蛋白酶体a亚基6型转录活性的物质，该物质通过权利要求13所述的筛选方法获得。15.权利要求12或13所述的方法，其中，将在上述蛋白酶体a培养该细胞，通过测定报道活性来分析该基因的表达。16.权利要求15所述的方法，其中，上述报道基因是萤光素酶基因。17.蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的筛选方法，该方法包含将含有蛋白酶体a亚基6型基因外显子1第-8位碱基的C/G的单核苷酸多态性的基因片段与预想可能存在蛋白酶体a亚基6型转录控制因子的试样接触，检测上述片段与转录控制因子的结合。18.权利要求17所述的方法，其中，检测通过凝胶移位分析进行。19.炎症性疾病的治疗药物，该药物含有抑制蛋白酶体a亚基6型基因的表达或活性的物质作为有效成分。20.权利要求19所述的治疗药物，其中，优选抑制蛋白酶体a亚基6型的表达或活性的物质是针对蛋白酶体a亚基6型的siRNA或抗体。21.炎症性疾病的治疗药物的筛选方法，该方法包含以下步骤使细胞与候选物质接触的步骤；对细胞内编码蛋白酶体a亚基6型的基因的表达量进行分析的步骤；以及与在候选物质非存在下的条件进行比较，选择使该基因的表达量降低的候选物质作为炎症性疾病的治疗药物的步骤。全文摘要本发明的目的在于提供可鉴定与心肌梗塞具有相关性的基因多态性、利用该基因多态性判定以心肌梗塞为代表的炎症性疾病的方法；可用于该方法的寡核苷酸；炎症性疾病诊断用试剂盒；以及炎症性疾病的治疗药等。本发明可提供炎症性疾病的判定方法，该方法包含检测存在于蛋白酶体α亚基6型基因中的至少一种基因多态性。文档编号C12N15/00GK101466832SQ20078002194公开日2009年6月24日申请日期2007年6月15日优先权日2006年6月15日发明者中村祐辅,堀正二,尾崎浩一,田中敏博,饭田有俊申请人:独立行政法人理化学研究所