50%组织培养 剂量（TCIDJ
[0040] 以上上述各项操作均在生物安全三级实验室（BSL-3)中进行。
[0041] 以上所述的对HIV-1培养的改进均属于本发明的保护范围。
[0042] 本发明的实验证明，本发明的主要内容是改进体外细胞培养技术，制备滴度达到 9. 0~10.Olog的HIV-1毒种，用于HIV灭活验证、病毒裂解抗原制备等。建立并拟保护的 关键技术包括：细胞培养过程中去支原体抗生素使用方法和剂量；改进的HIV-1接种和起 始培养方法；HIV的"细胞/液体交替补充/更换"培养模式；病毒收获和冻存方法。用以 佐证的实例为用MT4细胞培养HIV-1IIIB株，用于验证静注人免疫球蛋白生产工艺中的低 pH法（pH4. 0)灭活HIV的效果。用这种方法收获的病毒滴度达10. 501og，待验证的方法使 病毒滴度下降5. 73~6. 731og，是有效的病毒灭活工艺。本发明培养高滴度、高感染性、高 抗原表达的HIV-1，收获的培养上清液可用于：（1)血液（生物）制品及其他植入性医疗器 械生产工艺HIV灭活或去除有效性的验证；（2)同种（骨）异体植入性医疗器械生产工艺 HIV灭活或去除有效性的验证；（3)抗HIV药物体外筛选和评价；(4)HIV-1裂解抗原的制备 等。对于艾滋病的防治具有重要意义。
[0043] 本发明的方法制备的病毒可以应用于血液制品、同种异体植入性材料工艺的病毒 灭活验证等实验，解决了部分实验中产品本身及灭活工艺中细胞毒性偏大与病毒滴度过低 无法开展实验的矛盾，为产品的使用安全提供了保障。同时，也解决了由于病毒滴度偏低 而不得不盲传3代进行灭活验证的问题，免去盲传步骤使实验周期缩短为要原来的1/4， 极大地节约了人力和物力。
【附图说明】
[0044] 图1为去支原体抗生素处理前细胞。
[0045] 图2为去支原体抗生素处理后细胞。
[0046] 图3为常规方法培养的细胞病变。
[0047] 图4为改进方法培养的细胞病变。
【具体实施方式】
[0048] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0049] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0050] 细胞培养瓶：Greinerbi〇-〇ne(德国、25cm2、75cm2);
[0051] 96 孔细胞培养板：Greinerbio-one(德国）；
[0052] 二氧化碳孵箱：Therm〇-Fisher(美国，371);
[0053] RPMI1640 培养基：Gibco11875-093(美国）；
[0054] 胎牛血清：Gibco16000-044(澳大利亚）；
[0055] 青链霉素抗生素：Gibco15140-122(美国）；
[0056] HIV-1IIIB株：公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研 究所获得；记载在如下参考文献中：IslamSl，HoqueSA，AdnanN，TanakaA，Jinno_0ue A,HoshinoH.X4-tropichumanimmunodeficiencyvirusIIIButilizesCXCR4as coreceptor,asdistinctfromR5X4_tropicviruses.MicrobiolImmunol. 2013 ； 57(6) :437-44.
[0057] MT4细胞：公众可以从中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所获 得；记载在如下参考文献中：LiWG，NieWM,Chenffff,JiangTJ,XuXY,ZhaoM.Inhibition ofCXCR4expressionbyrecombinantadenovirusescontaininganti-senseRNA resistsHIV-linfectiononMT4celllines.Gene. 2013 ；526 (2):443-8.
[0058] 细胞培养基为RPMI1640 (Gibco)，一般添加10 %胎牛血清（Gibco)。
[0059] 实施例1、高滴度HIV-1毒种的制备
[0060] 一、高滴度HIV-ι毒种的获得
[0061] 用MT4细胞培养高滴度的HIV-1IIIB株，具体如下：
[0062] 1、去除靶细胞培养中的支原体
[0063] 将复苏后的MT4细胞数量调整至IX106(图1)，在10ml含10 %血清和37. 5μg/ ml去支原体抗生素（Plasmocin?Treatment，购自InvivoGen公司，目录号：ant-mpt)的 RPMI1640培养液培养，每3天进行传代处理，细胞数量和去支原体抗生素浓度等条件保持 不变，3周后，将培养后细胞在含10%血清和25μg/ml去支原体抗生素的RPMI1640培养液 继续培养1周，得到处理后靶细胞悬液（图2)，实现除靶细胞培养中的支原体。
[0064] 含10 %血清和37. 5μg/ml去支原体抗生素的RPMI1640培养液为将胎牛血清、去 支原体抗生素和RPMI1640培养液混匀，得到的培养液；其中胎牛血清在培养液中的体积百 分含量为10 %，去支原体抗生素在培养液中的浓度为37. 5μg/ml。
[0065] 含10 %血清和25μg/ml去支原体抗生素的RPMI1640培养液为将胎牛血清、去支 原体抗生素和RPMI1640培养液混匀，得到的培养液；其中胎牛血清在培养液中的体积百分 含量为10 %，去支原体抗生素在培养液中的浓度为25μg/ml。
[0066] 检测处理后靶细胞悬液是否含有支原体，具体方法如下：
[0067] 米用HDBiosences公司的MycoScan?支原体检测试剂盒检测，通过PCR检测保守 的16S和23SrRNA的基因中的间隔区域来检测支原体的存在。这些间隔区域的某些部分 在不同物种之间甚至在不同类型支原体之间存在差异。同时试剂盒还有内部指控DNA，反应 成功后会在电泳时显示一个502bp的条带。
[0068] 第 1 步PCR
[0069] 1)按照下表1所示在薄壁管中准备反应混合物：
[0070] 表 1
[0071]
[0072]2)、加入处理过处理后靶细胞悬液上清液2μ1，总体积为50μ1
[0073]3)、将管子置于热循环仪器上，设置反应参数：94°C2min1个循环；94°C30sec30 个循环；55°Clmin;72°Clmin;冷却至 4°C。
[0074] 第 2 步PCR:
[0075]1)、按照下表2所示在薄壁管中准备反应混合物
[0076] 表 2
[0077]
[0078] 2)加第1步PCR反应产物2μ1至反应混合物中，总体积达到50μ1
[0079] 3)将管子置于热循环仪器上，设置反应参数：94°C2min1个循环；94°C3〇Sec30 个循环；51°C30sec;72°C30sec;冷却至 4°C。
[0080] 阳性对照加2μ1内部指控DNA，阴性对照加2μ1水。
[0081] 结果处理后靶细胞悬液为阴性，没有支原体。
[0082] 2、接种
[0083]将处理后靶细胞悬液的细胞数量调整为5X105个/ml，取1ml处理后靶细胞悬液、 0.9ml含5%胎牛血清的RPMI1640培养液和0.lmlHIV-1IIIB病毒液混匀，共同孵育；其中 病毒和细胞MOI(multiplicityofinfection，感染倍数）=0.2。
[0084] 3、交替补液和补细胞
[0085] 将每次补液或每次补细胞前体系记作初始培养体系，每次补液或每次补细胞后体 系记作补充后培养体系；
[0086] 接种后6h补液：在上述2共同孵育6小时后，得到接种后6小时初始体系，向接种 后6小时初始体系中加入含胎牛血清和去支原体抗生素的细胞培养液，得到接种后6小时 补充后培养体系，使胎牛血清在接种后6小时补充后培养体系中的体积百分含量均为5%、 去支原体抗生素在接种后6小时补充后培养体系中的浓度均为12. 5μg/ml;
[0087] 继续培养；
[0088] 接种后第3天补细胞：在接种第3天（以接种当天记作第1天），收集接种后第3天 初始培养体系的上清液lml，将其与39ml含有胎牛血清和去支原体抗生素的细胞悬浮液混 匀，得到接种后第3天补充后培养体系，使胎牛血清在接种后第3天补充后培养体系中的体 积百分含量为5 %，去支原体抗生素在接种后第3天补充后培养体系中的浓度为12. 5μg/ ml，含有胎牛血清和去支原体抗生素的细胞悬浮液中的细胞在接种后第3天补充后培养体 系中的含量为4X106个/ml;
[0089] 继续培养；
[0090] 上述细胞悬浮液由细胞和上述含胎牛血清和去支原体抗生素的细胞培养液组 成；
[0091] 上述含胎牛血清和去支原体抗生素的细胞培养液由胎牛血清、去支原体抗生素和 1640培养液组成。
[0092] 接种后第5天补液：在接种第5天，弃去反应体系中的10ml上清液，得到接种后 第5天初始体系，向接种后第5天初始体系中加入10ml含胎牛血清和去支原体抗生素的细 胞培养液，得到接种后第5天补充后培养体系，使胎牛血清在接种后第5天补充后培养体系 中的体积百分含量均为5%、去支原体抗生素在接种后第5天补充后培养体系中的浓度均 为 12. 5μg/ml;
[0093] 继续培养；
[0094] 接种后第7天补细胞：在接种第7天（以接种当天记作第1天），收集接种后第7天 初始培养体系的上清液lml，将