专利名称：用于苏丹红Ⅰ和对位红检测的单克隆抗体及酶联免疫方法与试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种能识别苏丹红I苏丹红I和对位红的单克隆抗体和一种用于动物源性食品中苏丹红I苏丹红I和对位红检测的酶联免疫方法(ELISA)与试剂盒。
背景技术：
苏丹红染料和对位红均属于偶氮类染料，是常见的红色染料，由于这类染料含有芳香族结构，进人人体后可被分解还原成芳香胺，形成致癌的芳香胺化合物，严重危害到人类健康。研究表明，苏丹红I苏丹红I是一种潜在的致癌剂，可引发鼠肝脏、膀胱和脾脏等脏器的肿瘤，因此，国际癌症研究中心将其列为三类致癌物。对位红也被怀疑具有致癌性， 自1995年起，包括我国在内的许多国家均颁布了法律禁止这类物质作为食品添加剂使用。因此，建立分析方法以监控苏丹红和对位红的违法使用尤显重要。目前HPLC是最常用的方法，但是需要配备昂贵的仪器和专业性强的操作人员，样品的前处理复杂，检测时间长，不利于大批量样品的筛选，不能在现场进行快速的检测。相对于仪器分析法，免疫学分析法具有操作简单、快速、灵敏度高、特异性强、检测费用低等优点，适用于大批量样品的初筛，目前对于苏丹红和对位红的免疫学检测方法较少。申请号为200810201463.9的中国专利公开了一种单克隆抗体的制备及其用途，该专利以羧基苏丹红为半抗原，分别以牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白与半抗原偶联制备免疫原和包被原；经动物免疫和细胞筛选，获得了保藏编号为CCTCC NO C200813的单克隆细胞株，该细胞株分泌的单克隆抗体与苏丹红I苏丹红I和对位红的交叉反应率分别为100%和20%，可用于番茄酱等食品中苏丹红I苏丹红I的检测。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种能识别苏丹红I苏丹红I和对位红的单克隆抗体。本发明的第二个目的是利用该单克隆抗体，建立一种能检测动物原性食品中苏丹红I苏丹红I和对位红的酶联免疫方法。本发明的第三个目的是提供一种能检测动物源性食品中苏丹红I苏丹红I和对位红的酶联免疫试剂盒。本发明的第四个目的是提供所述单克隆抗体在制备检测动物源性食品中苏丹红 I苏丹红I和对位红的酶联免疫试剂盒中的应用。本发明的第五个目的是提供含有所述单克隆抗体的试剂盒在动物源性食品中苏丹红I苏丹红I和对位红检测中的应用。本发明是通过以下技术方案实现的一种能识别苏丹红I苏丹红I和对位红的单克隆抗体，它是由保藏号为CCTCCN0 C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7所分泌的。
上述杂交瘤细胞SU I/1H7，保藏在位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO :C201185。所用的免疫原是由半抗原I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚与牛血清白蛋白偶联制备的。进一步，本发明提出了一种适用于苏丹红I苏丹红I和对位红检测的酶联免疫方法，具体步骤如下(I)将半抗原1-(4-羧基苯偶氮基)-2_萘酚与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；(2)将半抗原I-(4-羧基苯偶氮基)-2_萘酚与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCC NO C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7 ；(4)用保藏号为CCTCC NO C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7制备单克隆抗体；(5)用步骤⑵的包被原包被固相载体(如酶标板)；(6)称取均质后的动物组织样品，用乙腈提取后，取乙腈层用氮气吹干，残渣用含 O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)溶解，得到待测物；(7)取待测物进行酶联免疫检测。步骤(6)含O. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液(Tris-HCl溶液)的配制方法为准确称取三羟甲基胺基甲烷(Tris)1.211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至7. 4，再加O. 5mL吐温20溶解， 定容至1000mL。本发明以上述单克隆抗体和包被原作为核心试剂与常规的其他试剂组合，制成了能检测动物源性食品中苏丹红I苏丹红I和对位红的酶联免疫试剂盒，结合上述酶联免疫方法，实现了对动物源性食品中苏丹红I苏丹红I和对位红的酶联免疫检测。本发明的有益效果是I、本发明制备的单克隆抗体能识别苏丹红I苏丹红I和对位红，专属性强，灵敏度高。2、本发明设计的半抗原合成工艺简便，合成效率高，所用的主要有机试剂避免了闻毒性，对操作者身体健康危害较小。3.本发明涉及的酶联免疫检测方法以含O. 05体积％吐温-20的IOmM PH为7. 4 的Tris-HCl溶液为标准品稀释液和样品稀释液，对待测物的溶解性好，所得标准曲线线性好，检测结果的准确度和精密度好。
图I为本发明的单克隆抗体与苏丹红I苏丹红I标准品的间接竞争ELISA反应曲线，X轴为苏丹红I苏丹红I标准溶液浓度对数值，Y轴为苏丹红I苏丹红I标准品溶液的光密度值除以“O”孔光密度值(B/Bd。
具体实施例方式下面通过实施例对本发明作进一步说明，但不限制本发明。
实施例I半抗原、免疫原和包被原的制备半抗原的制备准确称取2-萘酹3. 5g,磁力搅拌条件下加入60mL O. 02mol/L的氢氧化钠溶液溶解备用，此为A液。准确称取对氨基苯甲酸3. 24g,磁力搅拌条件下加入8ml 2mol/L HCl溶解,搅拌状态下加入20% NaN029 . 6ml，此为B液。搅拌条件下将B液滴加到A液中，5小时后，用盐酸调pH值至5. 4，继续搅拌30分钟，用布氏漏斗过滤，对产物进行质谱鉴定为半抗原I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚。免疫原的制备准确称取1-(4-羧基苯偶氮基)-2_萘酚29. 2mg，加入已干燥好的 N’ N-二甲基甲酰胺2ml，待完全溶解后加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 21. 5mg和1，3_ 二环己基碳二亚胺(DCC) 10. 6mg，反应16小时，将其加入到35ml含IOOmg BSA的缓冲溶液中， 反应过夜，SOOOr/分钟离心10分钟，取上清液放入处理过的透析袋中，对生理盐水充分透析；以SOOOr/分钟离心10分钟，取上清冷冻干燥，即得偶联物I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚-BSA，用作免疫原。包被原的制备依据上述免疫原的制备方法，将BSA换成OVA即可制得偶联物 I- (4-羧基苯偶氮基)-2-萘酌· -OVA,此为包被原。实施例2单克隆抗体的制备杂交瘤细胞的制备参照薛庆善《体外培养的原理与技术》科学出版社2001年版中的方法以实施例2制备的偶联物1-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚-BSA为免疫原免疫 Balb/C小鼠，免疫程序为基础免疫将免疫原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后，于小鼠背部皮下多点注射，以后每间隔2周加强免疫一次，换用不完全佐剂乳化，最后于融合前三天腹腔注射，强化免疫，抗原量加倍，不加佐剂。融合时，取经最后强化免疫的Balb/C鼠一只，眼眶放血处死(收集血清，即为阳性血清)，在75%酒精中浸泡5分钟消毒。将3-5X 107SP2/0骨髓瘤细胞和免疫小鼠脾脏细胞悬液加入到50mL离心管中，混匀，1500r/分钟离心5分钟。弃上清，控干水分。轻轻敲击管底，使管底细胞松动。将离心管置于37°C水浴中，I分钟内缓慢加入预温至37°C的50% PEGO. 8mL，边加边轻轻用吸管尖搅拌，加完后继续搅拌30秒，静置I分钟。缓慢加入37°C预温的RPMI-1640基础液10mL。具体方法为第I分钟逐滴加lmL， 第2分钟加2mL，之后缓慢加入剩余的RPMI-1640基础液，边加边轻摇离心管。缓慢加入 40mL RPMI-1640基础液，加完后，缓慢上下颠倒混匀，1500r/分钟离心5分钟，弃上清，IOmL 滴管吸取含饲养细胞HAT培养基，沿管壁缓慢滴加，用滴管缓慢机械搅拌，缓慢吸取融合细胞，接近饲养细胞液面滴加，机械搅拌混匀。接种于6块96孔培养板中，约150 μ L/孔，置于37°C，5% CO2细胞培养箱中培养。从融合当天起计为O天，3天后每个培养孔滴加I滴HAT培养基，5天后有规律地每隔2天吸去1/2体积的培养基，换入等量HT培养基。在融合后4天，开始对融合细胞进行跟踪观察，标记和记录有杂交瘤细胞生长的培养孔，并计算融合率。在融合后6-7天，待孔内细胞长至孔底1/10-1/5时，取培养上清，用间接竞争ELISA方法筛选阳性细胞孔。包被原浓度为10mg/L。每个细胞培养孔设置O孔和200 μ g/L药物孔，每孔中加入50 μ L培养上清进行间接竞争ELISA检测。选择4-6个上清检测呈强阳性且只有1-2个形态良好集落生长的孔，用有限稀释法进行亚克隆。经过3 4次克隆，最终筛选出分泌苏丹红I苏丹红I特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞。申请人将该杂交瘤细胞命名为SU I/1H7，并于2011年9月8日送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏号为CCTCC NO :C201185。腹水单抗制备与鉴定在接种前7天取Balb/c小鼠数只，每只小鼠腹腔注射
O.5ml弗氏不完全佐剂进行预处理。用RPMI-1640基础培养基悬浮由保藏号为CCTCC NO C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7扩大培养的细胞，并将细胞数调至I X IO6个/mL，每只小鼠腹腔接种O. 5ml。待小鼠腹部明显膨大，精神变差，濒死不动时采集腹水。按照文献方法 (朱立平，陈学清.免疫学常用实验方法.北京人民军医出版社，2000)，纯化获得单克隆抗体。采用购自ROCKLAND公司的鼠源单抗亚型鉴定试剂盒(Mouse Mab Isotyping Test Kit)对本发明所得到的单克隆抗体进行亚型鉴定，结果为小鼠IgG2b亚型。实施例3苏丹红I苏丹红I间接竞争ELISA检测方法的建立和方法考核3. IELISA相关试剂配制碳酸盐缓冲液(ρΗ9· 6):准确称取Na2CO3L 59g、NaHC032. 93g，少量超纯水溶解，定容至 1000mL。洗涤液(ρΗ7·4):准确称取 NaCl 8. 00g, KH2PO4O. 20g，Na2HPO4 · 12H20 2. 90g，KCl
0.20g，少量超纯水溶解，加入吐温200. 50mL，定容至1000mL。磷酸盐缓冲液(PBS)(ρΗ7· 4):准确称取 NaC18. 00g, KH2PO4O. 20g, Na2HPO4 · 12H20
2.90g, KCl 0. 20g,少量超纯水溶解，定容至IOOOmL0封闭液准确称取卵清蛋白10. OOg,加入IOOOmL磷酸盐缓冲液，搅拌混匀直至蛋
白完全溶解。含0. 05体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的Tris_HCl溶液的配制准确称取 Tris I. 211g，加入少量水搅拌溶解完全，至950mL，搅拌条件下用浓盐酸调pH值至7. 4，再加0. 5mL吐温20溶解，定容至IOOOmL0底物液购自武汉飞远科技有限公司。终止液2mol/L硫酸。3. 2包被原浓度和抗体工作浓度的确定包被原浓度和抗体工作浓度的初步确定采用方阵滴定初步确定包被原浓度和抗体工作浓度，抗原浓度设置l、2、4、8、16、32、64mg/L。抗体浓度为2、4、8、16、32、64X 103。酶标板每孔加入50 μ L PBS和50 μ L抗体，选择OD值接近2. O,且相邻孔OD值出现较大变化的包被浓度和抗体浓度做为最佳抗原、抗体组合。根据选择的不同包被原浓度下OD值接近2. O的抗体浓度，设置4个梯度，确定不同抗原浓度下OD值接近2. O的抗体浓度。苏丹红I苏丹红I做为竞争药物，以标准曲线 IC5tl值做为判定指标,确定最佳包被原工作浓度。实验结果显示包被原浓度达到32mg/L时,抗原抗体反应基本达到饱和。方阵滴定结果见表1，分别以4、8、16，32mg/L包被酶标板，在OD值在2. O附近的抗体工作浓度附近， 等差设置3个抗体浓度，确定OD值在I. 8-2. O之间的对应抗体工作浓度。以确定的抗体浓度建立抑制曲线，药物浓度设置I. 25-40 μ g/L，选择呈线性的浓度范围建立抑制曲线，计算抑制曲线的IC5(I。以IC5tl最低的包被浓度确定为最佳包被浓度，以该包被浓度下的抗体工作浓度确定为最佳抗体浓度。结果显示最佳包被浓度为16mg/L,抗体工作浓度3X 104。
表I抗体方阵测定结果
权利要求
1.一种能识别苏丹红I和对位红的单克隆抗体，其特征在于，它是由保藏号为CCTCC NO C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7所分泌的。
2.权利要求I所述的杂交瘤细胞SUI/1H7，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为 CCTCC NO C201185o
3.包含权利要求I所述的单克隆抗体的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，该试剂盒是用于检测动物源性食品中苏丹红I和对位红的酶联免疫试剂盒。
5.一种用于检测动物源性食品中苏丹红I和对位红的酶联免疫方法，包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测，其步骤如下(1)将半抗原I-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚与牛血清白蛋白偶联得到免疫原；(2)将半抗原I-(4-羧基苯偶氮基)-2-萘酚与卵清蛋白偶联得到包被原；(3)利用步骤(I)的免疫原免疫小鼠，通过细胞融合与筛选得到保藏号为CCTCCNO C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7 ；(4)用保藏号为CCTCCNO C201185的杂交瘤细胞SU I/1H7制备单克隆抗体；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)称取均质后的动物组织样品，用乙腈提取后，取乙腈层用氮气吹干，残渣用含O.05 体积％吐温20的IOmM PH为7. 4的三羟甲基胺基甲烷-HCl溶液溶解，得到待测物；(7)取待测物进行酶联免疫检测。
6.权利要求I所述的单克隆抗体在制备检测动物源性食品中苏丹红I和对位红的酶联免疫试剂盒中的应用。
7.权利要求3或4所述的试剂盒在动物源性食品中苏丹红I和对位红检测中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种能识别苏丹红I和对位红的特异性单克隆抗体和一种用于检测动物源性食品中苏丹红I和对位红的酶联免疫方法及试剂盒。本发明的单克隆抗体是由杂交瘤细胞SU I/1H7所分泌的，该杂交瘤细胞保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOC201185。本发明的酶联免疫检测方法包括免疫原、包被原、抗体的制备以及样品的处理和检测等步骤。与现有技术相比，本发明的方法和试剂盒具有简便、快速、灵敏、准确等优点。
文档编号G01N33/577GK102585008SQ20121004521
公开日2012年7月18日 申请日期2012年2月27日 优先权日2012年2月27日
发明者刘振利, 张丽燕, 彭大鹏, 戴梦红, 潘源虎, 王玉莲, 袁宗辉, 陈冬梅, 陶燕飞, 黄玲利 申请人:华中农业大学