呋喃果糖苷转移酶催化生产蔗果低聚糖的 HPLC(F0S_Nytose为鹿果四糖、鹿果五塘；Ι-Kestose为鹿果三糖；Sugar为鹿糖；glucose 为葡萄糖；fructose为果糖）。
[0032] 图4为实施例1中经凝胶层析柱分离后β-呋喃果糖苷转移酶的SDS-PAGE电泳 图（分离胶浓度为12. 5%，浓缩胶浓度为4%，从左至右1、2、3条带分别为蛋白质标准、经 阴离子柱层析柱分离后、经阴离子柱层析柱和疏水亲和层析柱分离后）。
[0033] 图5为实施例1中β-呋喃果糖苷转移酶在不同温度下的稳定性曲线。
【具体实施方式】
[0034] 以下结合实施例对本发明做进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。
[0035] 实施例1
[0036] (1)以体积百分比5 %的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉F0S-0620的菌悬液 接种于发酵诱导培养基中，于33°C和133r/min的恒温摇床上进行诱导发酵培养48h后，将 得到的培养液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再用400目的滤袋过滤，清洗 和过滤的操作重复2次，得到菌体，在-40°C、真空度为0. 030psi下干燥得到具有β-FFase 活性的黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖7份，酵母浸膏2份，玉米粉 1. 5份，NaN030. 3份，pH6. 5,用蒸馏水定容至100份，混合均勾后于121°C下灭菌冷却后备 用。
[0037] (2)在⑴中黑曲霉菌体中，加入含2yg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1. 5ymol/mL的 二硫苏糖醇（简称DTT)提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为10mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度 为0. 5mg/mL，混匀后于37°C和120r/min下进行黑曲霉F0S-0620菌体破壁3h，然后在4°C用 8000r/min离心lOmin，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0. 2517U/ mg，取粗酶液进行分离纯化。
[0038] 以蔗糖为底物，采用高效液相色谱法测定各步骤得到的β-FFase酶活和产物中 蔗果低聚糖的含量。具体测定和计算方法如下：
[0039] β-FFase反应体系和反应过程：将0· 2mol/L磷酸氢二钠溶液和0·lmol/L梓檬酸 溶液配制成PH6. 5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，用上述缓冲液配制200g/L的蔗糖溶液， 用作底物溶液；在2mL底物溶液中加入50μL酶液，在30°C~40°C、133r/min气浴摇床中 反应24h，100°C水浴中煮沸lOmin终止反应，最后测定反应体系中各糖组分的含量。
[0040] 采用高效液相色谱法检测F0S的含量。流动相为双蒸水，使用前经0. 22μm滤膜 过滤，超声脱气，流动相流速为〇. 6mL/min，柱温80°C;样品溶液在8000r/min下离心lOmin 后取上清液，然后再用〇. 22μm膜过滤后进样，进样体积为10μL;蔗果三糖、蔗果四糖、蔗 果五糖、葡萄糖、果糖等标准品的质量浓度均为1. 333g/L、2. 670g/L、3. 560g/L、5. 333g/L; 鹿糖标准品浓度分别为1. 333g/L、3. 333g/L、4. 670g/L、6. 670g/L。用Empower积分软件 进行数据处理。F0S含量为蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖绝对含量的总和，单位为g/L。 β-FFase催化生产得到的F0S糖浆的各糖组分的HPLC结果如图4所示，蔗果四糖和蔗果五 糖无法分开，一起出峰时间为8. 410min，蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的出峰时间分别为 8·855、9· 725、11· 504、和 14.610min。
[0041] 酶活计算方法：以反应体系中每分钟转移1μmol果糖基所需的酶量为一个果糖 转移酶活力单位（U)，酶的比活力是反应体系中每毫克蛋白的酶活力，单位为U/mg。酶活计 算公式如下：
[0042] Activity(U) = ^/504+(2Xm2)/666+(3Xm3)/828)/t
[0043] 其中叫为酶解产物中蔗果三糖的质量，单位为μg，504为蔗果三糖的摩尔质量， 单位为g/mol邱2为酶解产物中鹿果四糖的质量，单位为μg, 666为鹿果四糖的摩尔质量， 单位为g/mol;m3为酶解产物中鹿果五糖的质量，单位为μg，828为鹿果五糖的摩尔质量， 单位为g/mol;t为反应时间，单位为min。
[0044] (3)将经过第（2)步所得的β-FFase粗酶液于4°C和8000r/min下离心5min，上 清液上样至预先用PH7. 2的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交换层 析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含OmM~300mM的NaCl的Tris-HCl 缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为lmL/min，分部收集，测定每个洗脱峰的β-FFase酶活， 合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，结果如图1所示，第3个峰有 β-FFase活性，其β-FFase酶活为 6. 003U/mg〇
[0045] (4)将经过第⑶步所得的β-FFase组分上样至预先用ρΗ7· 2的含25 % (NH4) 2S04 的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含（NH4)2S04S0%~25%的Tris-HCl 缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为〇. 5mL/min，分部收集，测定每个洗脱峰 的β-FFase酶活，合并具有β-FFase酶活的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，结 果如图2所示，第3个峰有β-FFase活性，其β-FFase酶活为16. 95U/mg。
[0046] 本例第（4)步得到的β-FFase催化反应中蔗果低聚糖的总含量（占干物质）为 56. 64%，符合GB/T23528-2009低聚果糖中的非强制性国家标准的固形物中的总低聚糖的 含量彡50%的要求。
[0047] 以上阴离子交换层析和疏水亲和层析等步骤中，β-FFase的纯化倍数和得率如下 表1所示。各步骤分离后获得的β-FFase的SDS-PAGE电泳图如图4所示，经阴离子交换 层析和疏水亲和层析收集的β-FFase经SDS-PAGE电泳后可以看到较明显的条带，疏水亲 和层析后的目的蛋白条带含量很少，因此跑出来的条带颜色很浅，β-FFase的分子量最可 能为 75KDa，与文献（（Guimar^lesLHS，TerenziHF，PolizeliML，etal.Production andcharacterizationofathermostableextracellularβ-d-fructofuranosida seproducedbyAspergillusochraceuswithagroindstrialresiduesascarbon sources.EnzymeandMicrobialTechnology, 2007, 42 (1) : 52-57)中从A.ochraceus中分 离出的β-FFase的分子量79KDa接近。取经过以上疏水亲和层析收集的β-FFase进行酶 的反应及温度稳定性实验，还对产物蔗果低聚糖进行检测。
[0048] 表 1 黑曲霉F0S-0620 的β-FFase纯化
[0049]
[0050] 备注：No. 1为β-FFase粗酶；No. 2为经过阴离子层析柱纯化后β-FFase;No. 3为 经过阴离子层析柱疏水亲和层析纯化后的β-FFase。
[0051 ]β-FFase的温度稳定性实验：考察了温度范围为20 °C~70 °C酶活变化，将 0-卩?&86在2〇、3〇、4〇、5〇、6〇、7〇°(：下分别保温3〇1^11，在？册.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲 液配制的β-FFase反应体系中进行酶活测量，结果如图5所示。结果表明，该酶的最适反 应温度为30°C~40°C，在60°C仍保留有50%以上的酶活，具有高温反应活性。
[0052] 实施例2
[0053] (1)以体积百分比5 %的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉F0S-0620的菌悬液 接种于发酵诱导培养基中，于30°C和lOOr/min下培养36h后，所得发酵液用400目的滤袋 过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再8000r/min离心10min，清洗和离心的操作重复2次，得到 菌体，在-40°C、真空度为0. 030psi下干燥得到黑曲霉菌体。所述的发酵诱导培养基：按重 量份计，鹿糖2份，酵母浸膏1份，玉米粉1. 0份，NaN030. 1份，pH6. 0,用蒸馏水定容至100 份，混合均匀后于121°C下灭菌冷却后备用。
[0054] (2)在⑴中黑曲霉菌种中，加入含1μg/mL的