4°C和8000r/min下离心5min， 上清液上样至预先用PH7. 2的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交 换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含OmM~300mM的NaCl的 Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为lmL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱 似(：1浓度为〇1111、3〇1111、10〇1111，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗 脱峰的β-FFase的酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩， 其β-FFase酶活为 3. 526U/mg〇
[0074] (4)将经过第⑶步所得的β-FFase组分上样至预先用ρΗ7· 2的含（NH4) 2S04 为25%的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含（NH4)2S04S0%~25%的 Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0. 5mL/min，分部收集，洗脱过 程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行酶活性测定，合并具有β-FFase酶活 的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为8. 657U/mg。
[0075] 在2mL的蔗糖浓度为500g/L溶液中加入50μL的第（4)步得到的β-FFase酶液， 按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量（占干 物质）为53. 18%。
[0076] 实施例6
[0077] (1)以体积百分比7 %的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉F0S-0620的菌悬液 接种于发酵诱导培养基中，接入黑曲霉F0S-0620种子液，于37°C和133r/min下培养48h 后，所得发酵液用400目的滤袋过滤，所得菌泥用无菌水清洗后再8000r/min离心lOmin，清 洗和离心的操作重复2次，得到菌体，在-40°C、真空度为0. 030psi下干燥得到黑曲霉菌体。 所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗糖7份，酵母浸膏2. 5份，玉米粉2. 5份，NaN030. 3 份，pH6. 5,用蒸馏水定容至100份，混合均勾后于121°C下灭菌冷却后备用。
[0078] (2)在⑴中黑曲霉菌种中，加入含2yg/mL的胰蛋白酶抑制剂和1. 5ymol/mL的 DTT的提酶缓冲液，使黑曲霉菌体浓度为10mg/mL，加入蜗牛酶并使其浓度为0. 4mg/mL，混 匀后于37°C和120r/min下进行黑曲霉F0S-0620菌体破壁5h，然后在4°C用8000r/min离 心lOmin，离心后的上清液为β-FFase粗酶液，其β-FFase酶活为0. 1783U/mg。
[0079] (3)将经过第（2)步所得的β-FFase粗酶液于4°C和8000r/min下离心5min， 上清液上样至预先用PH7. 2的不含NaCl的50mM的Tris-HCl缓冲液平衡好的阴离子交 换层析柱上，先用无NaCl的缓冲液将蛋白质洗至基线，再用含OmM~300mM的NaCl的 Tris-HCl缓冲液进行NaCl梯度洗脱，流速为lmL/min，分部收集，从左到右蛋白峰的洗脱 似(：1浓度为〇1111、3〇1111、10〇1111，整个洗脱阶段出现3个大小不一的蛋白质峰，在测定每个洗 脱峰的β-FFase酶活性，合并具有β-FFase组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其 β-FFase酶活为 3. 895U/mg〇
[0080] (4)将经过第⑶步所得的β-FFase组分上样至预先用ρΗ7· 2的含（NH4) 2S04 为25%的Tris-HCl缓冲液平衡的疏水亲和层析柱上，再用含（NH4)2S04S0%~25%的 Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，流速为0. 5mL/min，分部收集，洗脱过 程中出现4个不同的蛋白质峰，在对各个洗脱峰进行酶活性测定，合并具有β-FFase酶活 的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩，其β-FFase酶活为10. 706U/mg。
[0081 ] 在2mL的蔗糖浓度为200g/L溶液中加入50μL的第（4)步得到的β-FFase酶液， 按照实施例1的条件进行反应后，采用HPLC法测定反应体系中蔗果低聚糖的总含量（占干 物质）为56. 66%。
【主权项】
1. 一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，其特征在于，该菌株为黑曲霉 (Aspergillusniger)F0S_0620,已于2012年9月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理 委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo. 6640。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括如下步骤： (1) 以体积百分比5%~10%的接种量，将处于对数期生长的黑曲霉F0S-0620的菌悬 液接种于发酵诱导培养基中，进行诱导发酵培养，将得到的培养液离心或过滤得菌泥，用无 菌水清洗后再离心或过滤，冷冻干燥，得到黑曲霉菌体； (2) 在上述黑曲霉菌体中加入提酶缓冲液，使黑曲霉F0S-0620菌体浓度为5mg/mL~ 30mg/mL，加入蜗牛酶，混匀后进行菌体破壁，破壁后的菌液经离心后的上清液为β-呋喃 果糖苷转移酶粗酶液，经分离纯化，得到β-呋喃果糖苷转移酶。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（1)所述诱导发酵培养的条件为 30°C~40°C，100r/min~200r/min摇床培养，发酵时间为36h~72h。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的发酵诱导培养基：按重量份计，蔗 糖2~10份，酵母浸膏1~5份，玉米粉1~5份，NaN03 0· 1~0· 5份，pH6. 0~7. 5,用 蒸馏水定容至100份，灭菌后冷却即可。5. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2)所述蜗牛酶的浓度为0.2mg/ mL~0· 8mg/mL〇6. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤（2)所述提酶缓冲液中含有胰蛋白酶 抑制剂和二硫苏糖醇，其浓度分别为1μg/mL~3μg/mL和0· 5μmol/mL~2. 0μmol/mL。7. 根据权利要求2或3或4或5或6所述的应用，其特征在于，所述分离纯化的步骤如 下：所述粗酶液经过高流速离子型琼脂糖凝胶阴离子交换层析柱和苯基-琼脂糖凝胶疏水 亲和层析柱中的一种或两种层析，制得β-呋喃果糖苷转移酶。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于， 所述阴离子交换层析是将粗酶液上样至阴离子交换层析柱上，先用不含NaCl的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含OmM~300mM的NaCl的Tris-HCl缓冲液进行 NaCl梯度洗脱，分部收集，测定每个洗脱峰的β-呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有β-呋 喃果糖苷转移酶的组分，透析除盐后用聚乙二醇20000浓缩； 所述疏水亲和层析是经阴离子交换层析后所得的β-呋喃果糖苷转移酶组分上样至 疏水亲和层析柱上，先用含（NH4)2S04S25%的Tris-HCl缓冲液将层析柱洗至基线，再用含 0%~25% (见14)2504的Tris-HCl缓冲液进行从高浓度到低浓度的梯度洗脱，分部收集，测 定每个洗脱峰的呋喃果糖苷转移酶酶活，合并具有呋喃果糖苷转移酶的组分，透析 除盐并用聚乙二醇20000浓缩。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于， 所述Tris-HCl缓冲液的浓度为20mM~100mM，pH为7. 0~7. 5 ; 所述阴离子交换层析和疏水亲和层析中洗脱的流速分别为lmL/min和0. 5mL/min。10. 根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤（1)所述清洗和离心或过滤的操作 至少重复1次；步骤（2)所述菌体破壁温度为30°C~40°C，破壁时间为2h~5h。
【专利摘要】本发明公开了一种黑曲霉在制备β-呋喃果糖苷转移酶中的应用，所述黑曲霉(Aspergillus？niger)FOS-0620，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.6640。黑曲霉FOS-0620在诱导发酵培养基中发酵后，经过过滤、洗涤、冷冻干燥、酶解破壁后得到β-呋喃果糖苷转移酶粗酶液，粗酶液通过分离纯化，获得高纯度的β-呋喃果糖苷转移酶。本发明所制备的β-呋喃果糖苷转移酶酶活高，具有较广泛的温度适用范围；利用该酶以蔗糖为底物催化制备的蔗果低聚糖，工艺简单，含量高，达到国家标准。
【IPC分类】C12N9/26, C12R1/685
【公开号】CN105274075
【申请号】CN201510716163
【发明人】刘冬梅, 周劲松, 杨丹霞, 吴晖, 肖性龙, 余以刚, 唐语谦, 李晓凤
【申请人】华南理工大学
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月28日