30r/min的速度搅拌7h。
[0029]本实施例中，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干。将溶液浓度为3% (w/w)的海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在12°C条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入3g共价固定化的果糖基转移酶。将混合后料液缓缓滴入溶液浓度为4% (w/w)的CaC12溶液中，形成滴丸。最后将形成的滴丸放入同浓度的CaC12溶液中硬化处理15h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
[0030]经检测，果糖基转移酶的复合固定化效率高，酶活回收率达79% ;分批反应时，可反复使用87次。
[0031]实例三
一种果糖基转移酶的复合固定化方法，包括如下步骤:
Cl)将产酶菌株一黑曲霉接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量1500ml/min、搅拌速度80r/min的条件下，培养4天，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比:
蔗糖15%，豆柏5%，余量水，初始ρΗ7.5 ；
(2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液；其中，菌体破裂采用自然裂解法，具体步骤包括:用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体5次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体5d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
[0032](3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在200U/ml ；
(4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。其中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
[0033]本实施例中，共价固定化的反应条件为:选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活?οου/g载体的比例进行混合后，按0.5% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节PH值7.5，共价固定化温度40°C，以160r/min的速度搅拌5h。
[0034]本实施例中，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干。将溶液浓度为4% (w/w)的海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在15°C条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入5g共价固定化的果糖基转移酶。将混合后料液缓缓滴入溶液浓度为3% (w/w)的CaC12溶液中，形成滴丸。最后将形成的滴丸放入同浓度的CaC12溶液中硬化处理20h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
[0035]经检测，果糖基转移酶的复合固定化效率高，酶活回收率达73% ;分批反应时，可反复使用92次。
[0036]实例四
一种果糖基转移酶的复合固定化方法，包括如下步骤:
(1)将产酶菌株一米曲霉接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量500ml/min、搅拌速度150r/min的条件下，培养4天，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比:
蔗糖5%，豆柏10%，余量水，初始ρΗ6.5 ；
(2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液；其中，菌体破裂采用自然裂解法，具体步骤包括:用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体3次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体5d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
[0037](3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在200U/ml ；
(4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。其中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
[0038]本实施例中，共价固定化的反应条件为:选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活?οου/g载体的比例进行混合后，按0.5% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节PH值7.5，共价固定化温度30°C，以160r/min的速度搅拌5h。
[0039]本实施例中，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干。将溶液浓度为2% (w/w)的海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在10°C条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入5g共价固定化的果糖基转移酶。将混合后料液缓缓滴入溶液浓度为3% (w/w)的CaC12溶液中，形成滴丸。最后将形成的滴丸放入同浓度的CaC12溶液中硬化处理20h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
[0040]经检测，果糖基转移酶的复合固定化效率高，酶活回收率达76%;分批反应时，可反复使用88次。
[0041]实例五
一种果糖基转移酶的复合固定化方法，包括如下步骤:
Cl)将产酶菌株一米曲霉接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量1500ml/min、搅拌速度80r/min的条件下，培养6天，制得发酵液；
上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比:
蔗糖15%，豆柏5%，余量水，初始ρΗ7.5 ；
(2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液；其中，菌体破裂采用自然裂解法，具体步骤包括:用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体5次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体3d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
[0042](3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在150U/ml ；
(4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。其中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
[0043]本实施例中，共价固定化的反应条件为:选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活200U/g载体的比例进行混合后，按1% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节pH值6.5，共价固定化温度40°C，以100r/min的速度搅拌10h。
[0044]本实施例中，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干。将溶液浓度为4% (w/w)的海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在15°C条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入Ig共价固定化的果糖基转移酶。将混合后料液缓缓滴入溶液浓度为5% (w/w)的CaC12溶液中，形成滴丸。最后将形成的滴丸放入同浓度的CaC12溶液中硬化处理1h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
[0045]经检测，果糖基转移酶的复合固定化效率高，酶活回收率达81%;分批反应时，可反复使用92次。
【主权项】
1.一种果糖基转移酶的复合固定化方法，其特征在于，包括如下步骤: (1)将产酶菌株接种于发酵培养基中，在温度28-32°C、通气量500-1500ml/min、搅拌速度80-150r/min的条件下，培养4_6天，制得发酵液； 上述发酵培养基组分如下，均为重量百分比: 蔗糖5%-15%，豆柏5%-10%，余量水，初始ρΗ6.5-7.5 ； (2)将步骤(I)制得的发酵液经菌体破壁、过滤，制得果糖基转移酶粗酶液； (3)将果糖基转移酶粗酶液进行真空减压浓缩，用高效液相色谱法测定浓缩后料液的酶活力，控制浓缩液的酶活在100U/ml以上； (4)将浓缩后果糖基转移酶酶液分别与壳聚糖、海藻酸钠和氯化钙进行复合固定化处理，最终制得固定化果糖基转移酶。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(I)中的产酶菌株为黑曲霉或米曲霉O
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的菌体破裂采用的方法是自然裂解法。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，条件如下: 用滤布将经步骤(I)发酵培养后的菌体进行过滤并收集菌体，用无菌水洗涤菌体3-5次，接入与发酵液相同体积的无菌水中继续培养菌体3-5d后，过滤除去破碎菌体，即得果糖基转移酶酶液。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，复合固定化包括共价固定化和包埋固定化两步。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，共价固定化的反应条件为: 选择壳聚糖为共价固定化载体，将果糖基转移酶与壳聚糖载体按酶活100-200U/g载体的比例进行混合后，按0.5%-1% (w/w)的比例加入交联剂戊二醛，调节pH值6.5-7.5，共价固定化温度30-40°C，以100-160r/min的速度搅拌5_10h。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，包埋固定化的反应条件为:将共价固定化的果糖基转移酶充分洗涤后，离心甩干；将海藻酸钠溶液与经过共价固定化的果糖基转移酶在10-15°C条件下充分混合，混合比例为每10ml海藻酸钠溶液中加入l_5g共价固定化的果糖基转移酶；将混合后溶液缓缓滴入CaCl2溶液中，形成滴丸；最后将形成的滴丸放入同浓度的CaCl2S液中硬化处理10_20h后，即获得复合固定化的果糖基转移酶。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的海藻酸钠溶液浓度为2%-4%(w/w)o
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的CaCl2溶液浓度为3%-5% (w/w)o
【专利摘要】一种果糖基转移酶的复合固定化方法，属于生物技术领域。本技术的优点是，果糖基转移酶提取的工艺设备简单；果糖基转移酶经壳聚糖共价固定化后再用海藻酸钙包埋，可解决壳聚糖共价固定化酶的成型和整型问题，酶的固定化效率高（酶活回收率达70%以上），分批反应时，可反复使用85次以上。
【IPC分类】C12N11-10, C12R1-685, C12R1-69, C12N11-04
【公开号】CN104560936
【申请号】CN201510000076
【发明人】刘宗利, 王乃强, 刘峰, 李克文, 王京博, 栾庆民, 张姝, 郝荣治, 张莉
【申请人】保龄宝生物股份有限公司
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2015年1月2日