一种来源于虎眼万年青的苯丙氨酸解氨酶，其核苷酸序列及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种苯丙氨酸解氨酶，其编码基因及其在催化底物L-苯丙氨酸为反 式肉桂酸以及L-酪氨酸为对香豆酸反应中的应用，属于基因工程领域。特别涉及虎眼万年 青苯丙氨酸解氨酶，其编码基因及其在催化底物L-苯丙氨酸为反式肉桂酸以及L-酪氨酸 为对香豆酸反应中的应用。
[0002] 发明背景
[0003] 苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL, EC4. 3. 1. 5)是催化苯丙烧 类代谢途径第一步反应的酶，也是这个途径的关键酶和限速酶。在环境日益恶化的今天，绿 色化学大势所趋，生物酶作为一种高效、温和、具有立体选择性的工具在一些化学反应中具 有不可比拟的优势。苯丙氨酸解氨酶作为一种参与基础代谢的酶，其产物具有广泛应用前 景。其催化L-苯丙氨酸形成的产物反式肉桂酸可以用于合成调料、染料、香水和一些医药 中间体。催化L-酪氨酸形成的产物对香豆酸不仅能作为合成黄酮类药物的医药中间体，还 能合成各种化工原料。
[0004] 苯丙氨酸解氨酶不仅能在生物工程和医药行业有巨大的应用价值,在临床领域也 有应用。
[0005] 苯丙酮尿症（PKU)是一种遗传病，患者体内不能代谢L-苯丙氨酸而导致该物质累 积，造成患儿智力低下，在我国发病率约为1/16500,若不能及早发现并治疗将给家庭社会 带来沉重的负担。苯丙氨酸解氨酶在临床检验中可用于测定人体血液、尿液中L-苯丙氨酸 的含量，有利于PKU的发现。同时已有研究证明苯丙氨酸解氨酶能有效治疗该类疾病。
[0006] 迄今为止，已在多种植物，真菌，细菌等生物中发现并克隆得到苯丙氨酸解氨酶基 因。本实验室在前期对虎眼万年青（Ornithogalum saundersiae)进行了转录组测序，从中 获得了一条具有苯丙氨酸解氨酶活性的基因0saPAL2基因，正在申请专利。本发明通过对 获得的虎眼万年青转录组序列进行深入的分析，通过提取虎眼万年青RNA，利用RT-PCR，又 从虎眼万年青无菌鳞茎中克隆得到一条和苯丙氨酸解氨酶具有很高同源性的序列，命名为 0saPAL62,其编码氨基酸同0saPAL2相似性为85%。这是首次从虎眼万年青植物中克隆得到 这个基因。
【发明内容】
[0007] 本发明的首要目的是提供一种苯丙氨酸解氨酶。
[0008] 本发明的第二目的是提供编码该酶的核苷酸序列。
[0009] 本发明的第三目的是提供含有该核苷酸序列的表达载体。
[0010] 本发明的第四目的是提供含有该表达载体的宿主细胞。
[0011] 本发明的第五目的是提供苯丙氨酸解氨酶的应用。
[0012] 为了实现本发明之目的，采用的技术方案为：
[0013] 本发明提供一种来源于虎眼万年青的苯丙氨酸解氨酶，其特征在于：
[0014] a) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列；
[0015] b) SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列经替换，缺失或添加1-70个氨基酸形成的具有 同等功能的氨基酸序列。本发明还提供一种编码所述苯丙氨酸解氨酶的基因序列，其核苷 酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0016] 本发明还提供一种含有所述核苷酸序列的表达载体。
[0017] 本发明还提供一种所述表达载体的宿主细胞。其中所选宿主细胞优选大肠杆菌， 酿酒酵母，毕赤酵母，链霉菌和植物细胞，更优选的宿主细胞选自大肠杆菌。
[0018] 本发明还提供了苯丙氨酸解氨酶或含有苯丙氨酸解氨酶的细胞在催化底物L-苯 丙氨酸为反式肉桂酸以及L-酪氨酸为对香豆酸反应中的应用。其中苯丙氨酸解氨酶的底 物包括L-苯丙氨酸和L-酪氨酸，形成的产物分别为反式肉桂酸和对香豆酸。
【附图说明】
[0019] 图I :0saPAL62基因的PCR分析结果，其中M是DNA分子量标准；1是0saPAL62基 因 PCR结果。
[0020] 图2 :重组质粒pET28a_0saPAL62示意图。
[0021] 图3 :0saPAL62重组蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中M为蛋白分子量标准；1为 0saPAL62 ;2为空载体对照。
[0022] 图4 :0saPAL62重组蛋白免疫印迹结果，其中1为0saPAL62, CK为空载体对照。
[0023] 图5 :咪唑洗脱纯化后0saPAL62蛋白SDS-PAGE分析银染结果，其中1为目的蛋白； M为蛋白分子量标准。
[0024] 图6 :0saPAL62重组酶催化L-苯丙氨酸HPLC-UV检测结果，其中1为底物L-苯丙 氨酸标准品；2为反式肉桂酸标准品；3为对照组(空载体）；4为实验组。
[0025] 图7 :0saPAL62重组酶催化L-酪氨酸HPLC-UV检测结果，其中1为对香豆酸标准 品；2为底物L-酪氨酸；3为对照组(空载体）；4为实验组。
[0026] 图8 :0saPAL62催化L-苯丙氨酸产物及反式肉桂酸标准品HPLC-MS结果，其中1 为反式肉桂酸标准品；2为PAL62-L-Phe-p。
[0027] 图 9 :化合物 PALeS-L-Phe-P1H NMR 图。
[0028] 图 10 :化合物 PAL62-L-Phe_p13C NMR 图。
[0029] 图 11 :化合物 PAL62-L-Phe_p HMQC 图。
[0030] 图 12 :化合物 PAL62-L-Phe_p HMBC 图。
[0031] 图 13 :化合物 PAL62-L-Tyr-p ESI-MS 图。
[0032] 图 14 :化合物 PALez-L-Tyr-P1H NMR 图。
[0033] 图 15 :化合物 PAL62-L-Tyr_p13C NMR 图。
[0034] 图 16 :化合物 PAL62-L-Tyr_p HMQC 图。
[0035] 图 17 :化合物 PAL62-L-Tyr_p HMBC 图。
[0036] 图18 :温度对0saPAL62催化L-苯丙氨酸活性的影响。
[0037] 图19 :pH对0saPAL62催化L-苯丙氨酸活性的影响。
[0038] 图20 :0saPAL62催化L-苯丙氨酸酶活曲线图。
[0039] 图 21 :0saPAL62 催化 L-苯丙氨酸 Lineweaver-Burk 双倒数图。
[0040] 图22 :温度对0saPAL62催化L-酪氨酸活性影响。
[0041] 图23 :pH对0saPAL62催化L-酪氨酸活性影响。
[0042] 图24 :0saPAL62催化L-酪氨酸酶活曲线。
[0043] 图 25 :0saPAL62 催化 L-酪氨酸 Lineweaver-Burk 双倒数图。
[0044] 图26 :0saPAL62同其余物种PAL氨基酸序列系统进化树分析图。
[0045] 图27 :0saPAL62催化L-苯丙氨酸产物PAL62-L-Phe_p结构。
[0046] 图 28 :0saPAL62 催化 L-酪氨酸产物 PAL62-L-Tyr_p 结构。
【具体实施方式】
[0047] 本发明通过如下实施例进行进一步的说明，这些实施例仅用于说明性的，而不是 以任何方式限制本发明权利要求的范围。
[0048] 实施例1虎眼万年青转录组测序及序列分析
[0049] 提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA后，以mRNA为模板，用六碱基随机引物（random hexamers)合成第一条cDNA链，然后加入缓冲液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合 成第二条cDNA链，在经过QiaQuick PCR试剂盒纯化并加 EB缓冲液洗脱之后做末端修复、 加 poly (A)并连接测序接头，然后用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择，最后进行PCR扩 增，建好的测序文库用Illumina HiSeqTM2000进行测序。
[0050] 测序得到的原始图像数据经base calling转化为序列数据，即raw data或raw reads。对raw reads进行数据过滤，去掉带接头的，重复的，测序质量很低的reads,得到 clean reads。使用短reads组装软件Trinity将具有一定长度overlap的clean reads连 成更长的片段，即Contig。然后，将clean reads比对回Contig，通过paired-end reads能 确定来自同一转录本的不同Contig以及这些Contig之间的距离，Trinity将这些Contig 连在一起，得到两端不能再延长的序列，这些序列称之为Unigene。通过blastx将Unigene 序列比对到蛋白数据库nr、Swiss_Prot、KEGG和COG (evalue〈0. 00001)，并通过blastn将 Unigene比对到核酸数据库nt (evalue〈0. 00001)，得到跟给定Unigene具有最高序列相似 性的蛋白，从而得到该Unigene的蛋白功能注释信息。
[0051] 通过功能注释，从虎眼万年青转录组序列中发现两个长度分别为317bp的 Unigene26880 (SEQIDN0·3)和长度为2150bp的Unigene25029 (SEQIDN0·4)。通过对 这两段Unigene进行Blast X比对，发现这两段Unigene都和苯丙氨酸解氨酶具有很高的相 似性。而且推测这两个Unigene属于同一个苯丙氨酸解氨酶编码0RF，其中Unigene26880 含有ORF的5'端序列，而Unigene25029含有ORF的3'端序列。根据Unigene26880序列， 设计一对特异的 5'端正向引物：FPAL5 (5'-CAATCAGCCGTTTACGAGACC-3，）（SEQ ID N0.5) 和 FPAL6 (5'-ATGGAATCCCTCCACGCCAAC-3，）（SEQ ID N0.6)。根据 Unigene25029 的序列， 设计一对特异的3'反向引物：RPAL1(5'-CCGAAGTACTGAATGAAAATC-3'）（SEQIDN0·7)和 RPAL2 (5'-CTAGCAAATGGGCAGGGGAG-3'）（SEQ ID N0.8)。
[0052] 实施例2 0saPAL62基因克隆
[0053] 取IOOmg虎眼万年青无菌鳞莖于液氮中速冻，研钵研成细粉状，按RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN)使用说明，提取虎眼万年青无菌鳞茎总RNA。使用RT-PCR Kit (ReverTra-Plus-，Τ0Υ0Β0)将虎眼万年青无菌鳞莖总RNA反转录成cDNA。反转录体系和 程序如下：在2(^1^体系中加入总1?隱1以8,8似86?代6!1204 4 1^，01丨8((11')2(|14 1^，651： 保温5min后，立刻置于冰上冷却，然后在上述管中再依次加入5XRT buffer4yL，RNase Inhibitor (IOU/μι) 1 μ L，dNTP Mixture (IOmM)和 ReverTra Acel μ L，3CTC 保温 lOmin， 42°C温育60min，85°C变性5min，冰上5min，完成cDNA的合成。cDNA置于-20°C备用。
[0054] 以虎眼万年青无菌鳞茎cDNA为模板，通过巢式PCR的方法扩增目的片段。
[0055] 第一轮 PCR，50y L 体系中含 10XPCR buffer 5μ L，2mM dNTPs 5μ L，25mM MgSO4 3 μ L，10 μ M 的弓 I 物 FPAL5 和 RPALl 各 I. 5 μ L，KOD-Plus-Neo 1 μ L, cDNA 2 μ L, ddH20 31 μ L。PCR程序：94°C预变性5min ;98 °C变性30s，53 °C复性45s，每一个循环递减I °C，68 °C 延伸12〇8，共15循环；981：变性3〇8,381：复性458,681：延伸12〇8，共15循环；681：延伸 7min，4°C 保温。第二轮 PCR，50y L 体系中含 10XPCR buffer 5yL，2mM dNTPs 5yL，25mM MgSO4 3 μ L，10 μ M 的引物 FPAL6 和