Il-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于临床医学技术领域，尤其涉及一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊 断和预后评价的方法。
【背景技术】
[0002] 胰腺癌是预后最差的消化道恶性肿瘤之一，在我国居恶性肿瘤死亡原因的第六 位，确诊后平均生存时间4-6个月。在中国，胰腺癌患者的5年生存率为1 % -3 %，仅 10%-15%的患者能够进行根治术，手术根治是治愈胰腺癌患者的最重要的手段，但在根治 治疗的胰腺癌患者中，其预后依然比较差。导致胰腺癌不良预后的主要原因是血液和淋巴 结肿瘤细胞的早期播散、腹腔肿瘤细胞的播散以至发生远处的器官的转移，且疾病的进展 凶险。由于胰腺癌的发生受到环境因素、多基因多阶段等复制因素影响，目前对胰腺癌的早 期诊断和预后评估等方面还存在很多挑战。缺少有效的实时动态检测胰腺癌疾病早期进展 和预后评估的工具。
[0003] 影像学目前对胰腺癌的早期诊断、治疗的监测和预后的评估具有重要的作用，但 影像在检测肿瘤的灵敏度方面具有局限性，只能检测到直径大于0. 3cm的肿瘤病灶，在治 疗的监测过程中，当影像检测到胰腺癌发生远处器官的转移，患者往往失去治愈的机会， 预后比较差。血清肿瘤标记物也是目前常用的诊断和监测治疗的标记物，目前胰腺癌最 常用的血清标记物是唾液酸Lewis抗原CA19-9,主要作为辅助诊断和治疗监测的标记 物，CA19-9在某些疾病中升高，如良性阻塞性黄疸和胰腺炎患者中，甚至在腹水的患者血 清中也升高，另外在5%-10%的人群中Lewis抗原阴性，CA19-9值不会升高。细针穿刺 (fine-needle aspiration，FNA)细胞学诊断能够提供细胞诊断的金标准，但此方法具有创 伤性，容易引起胰液渗漏等并发症。
[0004] 目前对胰腺癌的诊断临床多应用影像方法，血清肿瘤标记物等，最终通过细胞病 理或者组织病理学确诊胰腺癌。胰腺癌预后的评估最经典的方式是病理?m，即病理分期 中肿瘤病理类型、肿瘤大小、肿瘤侵润转移情况影响着患者预后。但由于胃癌患者个体差异 大，肿瘤细胞也存在异质性。仅仅通过?m分期难以满足临床需要。胰腺癌的早期诊断及 预后评估等方面还存在很多缺陷和不足。
[0005] IL-11属于IL-6细胞因子家族，具有抗炎作用，并且影响癌细胞的生长、侵袭和转 移。通过血浆/血清中IL-6水平的异常变化将有助于对胰腺癌早期诊断和预后评估。为 胰腺癌的早期诊断及预后评价提供新型的生物标记物。
【发明内容】
[0006] 本发明实施例的目的在于提供一种血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断 和预后评价的方法，旨在解决现有的胰腺癌诊断和预后评估的方法存在的由于胃癌患者个 体差异大，肿瘤细胞也存在异质性，仅仅通过TNM分期难以满足临床需要的问题。
[0007] 本发明实施例是这样实现的，一种IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评 价的方法，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法利用ELISA方法检测 血浆或血清中IL-11的表达；IL-11属于IL-6因子家族；
[0008] 具体包括以下步骤：
[0009] 步骤一，采用血浆/血清样本，用EDTA抗凝/无抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，室 温静置5分钟后，4000rmp/min，离心5分钟，获取上清备用；样本通常24小时内完成检测， 对于可能复查的标本；标本离心后，放置_80°C冰箱长期保存备用；所有的试剂和样本在使 用之前放置在室温18°C _25°C ;所有的样本复空；
[0010] 步骤二，用p!19. 6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，对血浆/血清样本1 : 2稀 释；
[0011] 步骤三，用PH9. 6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，溶解IL-11蛋白质标准品粉 末，充分震汤混勾后；制备成4ng/ml的标准品；取100ul的4ng/ml的标准品，加入400ul的 稀释液，配制成800pg/ml的标准品，在6管分别加入400ul的稀释液，800pg/ml的标准品 中移出 200ul，进行倍比稀释，分别得到 266. 7pg/ml、88. 89pg/ml、29. 6pg/ml、9. 88pg/ml、 3. 29pg/ml、0pg/ml ;
[0012] 步骤四，加入lOOul的标准品于IL-11抗体包被的96孔板中，血浆/血清/细胞 上清/其他体液样本1 : 2稀释，用专用薄膜覆盖孔后，室温孵育2. 5小时或者4°C过夜，并 轻微震荡；
[0013] 步骤五，用pH9. 6的50mM碳酸盐缓冲液作为稀释液，将山羊抗人IL-11抗体稀释 为2 y g/ml ;在聚苯乙烯的96孔酶标板的微孔中加入50 y 1包被液，用保鲜膜封好，在4°C 冰箱中放置过夜；次日，用350 y 1 150mM的PBST缓冲液浸泡式洗板，3minX 3次；
[0014] 步骤六，每孔加入300 y 1的2% BSA，室温封闭4h;用350 y 1 PBST缓冲液浸泡式 洗板，lminX3次；
[0015] 步骤七，丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ul PBST缓冲液，每次均 需从孔中彻底清除液体；在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干 净的吸水纸上排干；共洗涤4次；
[0016] 步骤八，在每孔中加入lOOul生物素标记的IL-11抗体，室温孵育1小时，并轻微 震动；丢弃液体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ulPBST缓冲液，每次均需从孔中 彻底清除液体；在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水 纸上排干；共洗涤4次；
[0017] 步骤九，加入lOOul链亲和素溶液于每孔中，室温孵育45分钟并轻微震荡；丢弃液 体，用排枪或者自动加样设备每孔加入300ulPBST缓冲液，每次均需从孔中彻底清除液体； 在最后一次洗涤时，完全去孔中残存的液体，并倒置96孔板，在干净的吸水纸上排干；共洗 涤4次；
[0018] 步骤十，加入lOOul的TMB底物试剂于每孔中，室温避光震荡孵育30分钟；加入 50ul2M1^04溶液终止反应；在酶标仪Model 680酶标仪中读取450nm吸光值；
[0019] 步骤十一，结果的判读：首先确定3个阴性对照孔的读数，取平均值作为本底读 数；对于每一例血浆/血清/细胞培养液/其他体液样品或IL-11标准品，先计算3个平行 孔的孔间变异系数CV，对于CV值小于10%的样品，取3次重复的平均值作为样品的0D值； CV值大于10%的样品，去除一个异常值后，重新计算孔间变异，孔间变异=两孔0D值之差 /两孔0D值之和，变异值< 12%，样品为有效病例，并取两孔平均值作为样品的0D值，否 贝1J，舍弃该例样品，利用梯度稀释的IL-11标准品绘制标准曲线，从而计算出每一例有效病 例的血浆/血清/细胞培养液/其他体液的IL-11浓度。
[0020] 进一步，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法的IL-11属于 IL-6因子家族，影响炎症因子趋化作用、癌细胞的运动和侵袭作用。
[0021] 进一步，该IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方法检测的标准和 方法：
[0022] 辅助诊断胰腺癌：血清中CA19-9未检测明显升高的患者，用EDTA抗凝/无抗凝采 血管抽取2-3mL静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；
[0023] 预后的评估作用：对于临床病理学明确诊断的胰腺癌患者，通过检测血浆中 IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情况，用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL静脉血，在 24h内完成IL-11血浆检测，患者在未经过任何治疗措施前用EDTA抗凝采血管抽取2-3mL 静脉血，在24h内完成血浆/血清的IL-11检测；在胰腺癌患者在手术后、化疗后、放疗后 3-7天检测血浆/血清中IL-11的表达水平，或者在手术后、同步放化疗后检测血浆/血清 中IL-11的表达水平，最后，根据血浆/血清的IL-11的表达水平评价胰腺癌患者的预后情 况。
[0024] 本发明提供的血浆/血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评价的方 法，测定血浆中IL-11的水平将对胰腺癌的早期诊断及预后的评价具有参考价值，有利于 胰腺癌的早期诊断和预后评估。本发明的方法灵敏度高，方法简单，血浆标本获得简单无 仓|J，可重复性强。
【附图说明】
[0025] 图1是本发明实施例提供的血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后评 价的方法流程图；
[0026] 图2是本发明实施例提供的血浆/血清的IL-11表达水平诊断胰腺癌的灵敏度和 特异度示意图；
[0027] 图3是本发明实施例提供的血浆/血清IL-11与胰腺癌患者预后的关系。当血浆 /血清水平大于50pg/mL，患者具有较好的预后示意图。
【具体实施方式】
[0028] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明 进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于 限定本发明。
[0029] 下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。
[0030] 如图1所示，本发明实施例的血浆中IL-11作为生物标记物在胰腺癌诊断和预后 评价的方法包括以下步骤：
[0031] S1