寡核苷酸的制作方法

专利名称：寡核苷酸的制作方法
专利说明寡核苷酸 本发明涉及寡核苷酸，尤其涉及用作杂交探针的荧光标记的寡核苷酸。
已知多种检测特异DNA序列和对已知单核苷酸多态性评分的技术。这些检测方法中的几种使用了荧光探针的杂交方法，并有赖于能量在供体和受体部分之间的转移。
均相聚合酶链式反应(PCR)是耦合扩增和检测过程的方法。均相PCR优于传统方法的好处，例如凝胶电泳后的靶扩增，减少了测试时间、操作时间并降低了交叉污染的可能。利用实时PCR设备，例如LightCycler(罗氏公司)、ABI PRISM 7700和7900(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))、Smartcycler(Cepheid)、Rotogene(Corbett Research)、MX4000(Stratagene)、SynChron(Biogene)和iCycler(伯乐公司)，使用荧光探针在扩增期间(实时)或扩增之后(结束点)检测和鉴定扩增产物。基于探针技术的实例包括分子灯塔(Tyagi et al，1996)、5′-核酸外切酶分析(US5,691,146)、杂交探针(US 6,174,670)、蝎形引物(Whitcombe et al，1999)和ResonSense(Lee et al，2002)。荧光探针通常处于淬灭或非激发状态，直到针对靶序列的杂交导致了去淬灭，例如通过构象变化或探针降解，或者探针相互作用产生的激活。这些探针系统依赖于能量在供体(例如，荧光团)和受体(例如，淬灭剂或第二荧光团)部分之间的转移。荧光团所吸收的能量可被转移到淬灭剂或受体荧光团，并以热的形式释放或以不同波长的光的形式发射。荧光信号的淬灭以荧光共振能量转移(FRET)或非-FRET的机制发生。FRET淬灭需要供体和受体之间的光谱重叠，其中淬灭的效率与两部分之间的距离相关。非-FRET淬灭通过荧光团和淬灭剂之间的短程“接触”发生，并且需要部分之间的光谱重叠。
5′-核酸外切酶(TaqManTM)分析使用FRET淬灭来检测PCR扩增的靶DNA。TaqMan探针是寡核苷酸，其包括优选地位于5’和3’末端的荧光团和淬灭剂部分。由于有效的分子内淬灭，完整的探针中几乎不发射出荧光。然而，在PCR扩增期间，探针特异地与其靶序列杂交，Taq聚合酶的5′-3’核酸外切酶活性裂解荧光团和淬灭剂部分之间的探针。TaqMan探针的酶促裂解在空间上分隔开荧光团和淬灭剂组分，导致与靶扩增相关的荧光发射的显著升高。对TaqMan引物的细心设计能够辨别多态性靶，其中，只有完全匹配的探针被降解而产生荧光信号的升高。因为TaqMan探针在实时PCR扩增期间被消化，所以探针不能用于扩增后的序列分析。
Eclipse Probes是短的线性寡核苷酸，其在5’末端具有小沟结合物(MGB)和淬灭剂部分，在3’末端结合有荧光团。认为MGB阻止了Taq裂解探针的核酸外切酶活性。探针的随机缠绕使得荧光团和淬灭剂组分相互靠近，从而导致了荧光的淬灭。与靶序列的杂交导致探针伸展开，这样荧光团和淬灭剂部分在空间上被分隔开。
分子灯塔是单链的寡核苷酸探针，其在分离时是无荧光的，但一经与靶序列杂交就具有荧光。非杂交分子灯塔形成茎-环结构，具有与该分子一端共价连接的荧光团和与另一端相连的淬灭剂，这样灯塔的发卡结构将荧光团部分置于与淬灭剂接近的位置。当分子灯塔与靶序列杂交时，荧光团和淬灭剂部分在空间上被分离，这样荧光团不再被淬灭，分子灯塔发出荧光。可在实时和结束点分析中使用分子灯塔，从而进行序列检测和SNP鉴定。分子灯塔的二级结构赋予探针以高特异性，允许鉴定单个核苷酸不同的靶分子。然而，分子灯塔的分子间相互作用可能产生对分子内靶杂交的竞争，而且，因为分子灯塔是内探针，所以其必须与扩增子的相对链竞争与靶序列的结合。两种竞争形式的结合可降低分子灯塔对一些靶分子的杂交效率。
蝎形引物是具有茎-环尾巴的PCR引物，其包含荧光团和淬灭剂(Whitcombe et al，1999)。茎-环结构使得荧光团和淬灭剂组分很接近。蝎形的环组分包含探针序列，靶的检测通过高效的分子内机制进行。在PCR期间，蝎形引物延伸形成包括探针靶序列的产物。蝎形的尾巴折叠起来，使得探针与靶序列杂交。探针序列与扩增的靶分子的杂交相对茎-环结构而言是偏爱热动学的，仔细的探针设计可鉴定小到只有单核苷酸不同的靶分子。探针杂交引起茎-环结构分解，这样荧光团和淬灭剂组分在空间上被分隔，产生了荧光发射的大幅升高。通过PCR终止剂(例如HEG)将茎-环尾巴从PCR引物上分离，PCR终止剂阻止了DNA聚合酶复制蝎形引物的茎-环序列。双蝎形引物(Solinas et al，2001)使用2个标记的寡核苷酸，一个包括引物、荧光团和探针序列，另一个包括淬灭剂部分。另外，双蝎形引物的延伸使得探针序列折叠并杂交到扩增的靶分子上，从而分解荧光团和淬灭剂寡核苷酸并增加了发射的荧光信号的数量。
杂交探针是只用荧光团部分标记的寡核苷酸。每次杂交探针分析需要2个这样的寡核苷酸，一个用供体荧光团标记，另一个用受体荧光团标记。通常使用荧光素作为供体，Cy5、LC-RED 640和LC-RED 705作为受体。供体荧光团的激活产生了发射光谱，其与受体荧光团的吸收光谱重叠。设计杂交探针对以在靶分子内识别邻近的核苷酸序列。在分离状态下，受体寡核苷酸不被激活，不产生荧光信号。然而，在与多核苷酸靶序列杂交期间，供体和受体探针彼此接近，使得荧光共振能量从供体转移到受体。当两个探针与靶分子杂交时，只从受体荧光团发射荧光信号。当结合到PCR反应内时，每个扩增循环监测一次受体探针的荧光，从而有助于产物积累的实时测量，其中受体发射的荧光量与合成的靶分子量成比例。仔细设计探针和分析条件可通过实时PCR鉴定相近的靶分子。而且，可使用成对的杂交探针通过解链峰分析和Tm测定来鉴定等位基因。纯合样品可通过解链曲线分析中特异峰的产生而鉴定，杂合样品可通过单一熔痕内出现两个峰而鉴定。
ResonSense探针是单一标记的寡核苷酸，其结合到引物对所处位置之间的靶序列上。ResonSense探针在分离状态或缺少靶序列时，不会产生可检测的信号。反而，包括如SYBR金(SYBR Gold)的DNA插入剂来可激发ResonSense引物。DNA插入剂结合双螺旋DNA，当通过实时设备激发时，将能量转移到ResonSense探针的荧光团上(Lee et al，2002)。
上述探针技术使用FRET和淬灭剂标签来检测和区分多核苷酸序列。然而，可替代的Light-up探针(Svanvik et al，2000)系统不需要淬灭剂标签或供体和受体部分之间的FRET转移来检测和区分DNA序列。这些Light-up探针包括由肽核酸(PNA)组成的识别寡核苷酸的序列，以及单一荧光受体基团，其中报告物通常是不对称菁染料噻唑橙的衍生物并携带正电。Light-up探针的荧光染料组分结合到寡核苷酸分子的末端。当探针是单链时，发射出比杂交到互补核酸序列时明显更低水平的荧光。在单链探针中，荧光团游离，所激发的能力以运动或热的形式释放，这样探针不明显发出荧光。一旦杂交，带正电的荧光团插入到DNA的碱基之间，并由于电荷相互作用而被“锁定”在其位置上，这样激发的能量只能以光的形式释放。通过测量荧光发射的数量，可使用Light-up探针来检测核酸序列并区分只有一个位置不同的靶分子。
已经报道了其他几种不需要淬灭剂部分的结合来检测和鉴定靶序列的探针技术。已报道许多荧光团的发射通过其与核碱基的相互作用而改变(Siedel et al，1996，Knemeyer et al，2000，Lee et al，1994，Crockett&Wittwer2001，Nazerenko et al，2002)。也有报道荧光团与DNA的相互作用影响到荧光发射的波长。对荧光最大的影响来自鸟嘌呤，其是高效的电子供体。认为淬灭源于从鸟嘌呤核碱基到荧光染料的电子转移。有报道说淬灭的程度依赖引物和靶链中荧光团与鸟嘌呤的接近程度(Xu et al，1994，Hawkins et al，1997，Norlund et al，1989)。已有报道认为荧光标记探针内，发射级数和方向依赖于鸟嘌呤残基在探针和靶序列的位置。LUX探针(英杰公司Invitrogen)使用发卡结构来淬灭紧密连接到该发卡3’端的荧光团(Nazerenko et al，2002)。LUX引物的发卡结构经常使荧光团部分与G’s的一个区域很接近，从而淬灭荧光。当引物包含在双链PCR产物中时，发卡结构解聚从而导致荧光团去淬灭。据报道与标签邻近的鸟嘌呤残基的存在影响到LUX引物的功能。但与任何双链分子结合时，LUX引物产生荧光信号，从而检测非特异性扩增产物和引物二聚体。
GenePin引物(Atto-tec GmbH)或Smart探针(Knemeyer et al，2000，Heinlein et al，2003)是与分子灯塔相似的茎-环结构。环是探测组分，干用来在单链状态下淬灭荧光(WO 01/36668)。GenePin引物的荧光团结合到茎的多聚(C)组分上，并通过互补的多聚(G)茎组分来有效地淬灭荧光。一旦靶分子杂交，多聚(C)和多聚(G)组分分离，鸟嘌呤淬灭的作用被取消，荧光发射水平升高。
简单探针(Simple Probe)是单标记的寡核苷酸，其在与靶分子的杂交时表现出荧光发射的差异(US 6,635,427)。荧光团通常在末端结合，其中5’标记的探针也优选地包括3’磷酸。简单探针中荧光变化的级数和方向依赖于荧光团结合位置邻侧的探针DNA序列以及杂交时与荧光团相互反应的靶DNA序列。据报道，一旦杂交，当荧光团接近靶链上的脱氧鸟苷时，简单探针的荧光淬灭(Crockett&Wittwer 2001)。相反，有报道说，当结合或邻近G残基的末端荧光团与互补靶序列杂交时，荧光增强(US 6,635,427)。在特定的实施例中，其中荧光团替代了内部碱基(“虚拟核苷酸”)，一旦与靶杂交，当荧光团分别与多态性靶等位基因的A和G核苷酸相对时，简单探针的荧光同时被增强和淬灭。在探针/靶杂交时，杂合样品不显示出荧光的显著升高或降低。
杂交灯塔(也称为HyBeacons

)是内标记的寡核苷酸，其当与靶序列杂交时发射出比单链状态时更大量的荧光(WO 01/73118)。HyBeacons不需要用于产生荧光信号的淬灭剂部分，并且不依赖于探针的二级结构、酶促裂解或对另一荧光团的FRET。在没有淬灭剂标签时，所报道的DNA淬灭特性负责杂交造成的荧光发射的改变。与以上描述的其他单标记的探针技术不同，荧光的方向变化不受探针和靶链的核苷酸序列影响。
本说明书中的在先发表文件的列表或讨论不应被认为是承认本文件是本领域现状的部分或是公知常识。
现在发明人惊奇的发现具有多个内荧光团的寡核苷酸在结合到靶多核苷酸序列时，与其他等价的单标记形式相比，发射未预料到的强荧光信号，其中的多个内荧光团优选地彼此具有确定的间隔。
本发明第一方面提供了基本不具有二级结构并由核苷酸残基形成的单链寡核苷酸，其中2个或更多内部核苷酸用荧光团标记且没有相结合的淬灭剂。
如以下所详细讨论的那样，本发明的寡核苷酸尤其可用作杂交探针。本发明的寡核苷酸如在WO 01/73118中描述的HyBeacons

一样，不依赖于寡核苷酸的二级结构，酶的活性或连接到寡核苷酸上的淬灭部分，从而可有效地作为易于检测的杂交探针。这些寡核苷酸及其靶序列(如下讨论)之间的相互作用产生了荧光发射的显著改变，从而提供了可靠的靶检测。探针稳定性的多样性使得能够鉴定小到单个核苷酸差异的靶分子，其是通过对以下更详细的描述双链解链温度的测量。
US 6,635,427预计因为荧光团邻近C残基而且靶链在荧光团区域有大量的G残基，所以连接到寡核苷酸上的荧光团在探针/靶分子杂交时被淬灭，与其提出的序列依赖数据相反，本发明的寡核苷酸在与完全互补和(部分)错配(即部分互补)的靶序列杂交时，无论探针和靶序列如何，表现出增强水平的荧光。
数据说明本发明的寡核苷酸的荧光团与单链寡核苷酸本身相互作用，而不与在杂交时形成的杂交体中的双链DNA相互作用。因此，尽管探针的序列可以影响荧光变化的级数，但探针不会因杂交而被淬灭。甚至当本发明寡核苷酸的荧光团标记的碱基因杂交而接近富含G的靶区域时，也观察到如本文中所示的去淬灭和阳性解链峰(-dF/dT得正值)，尤其对于其中直接荧光团标记的核苷酸残基被2个或更多个未标记核苷酸残基隔开的寡核苷酸探针更是如此。本发明的寡核苷酸的序列独立性与Nazerenko et al，(2002b)所报道的相反，其中，内荧光素dT发射因杂交而被增强或淬灭，而且依赖于探针中荧光团的位置和鸟嘌呤与荧光团的接近程度。据报道，标签中的4个核苷酸中至少需要有1个鸟嘌呤才能使杂交时荧光增强。
与WO 01/73118的HyBeacons

一样，无论探针和靶序列如何，本发明描述的多标记寡核苷酸都得到增高水平的荧光增强，并不需要在特定位置的鸟嘌呤来协助与靶杂交时的荧光增强。尽管未被任何理论所束缚，但认为当为单链形式时(例如，包埋在单链疏水口袋中)，结合到本发明寡核苷酸的荧光团与探针(寡核苷酸)DNA相互作用，从而导致荧光淬灭(例如通过导致碰撞淬灭的碱基堆积)。然而，认为当探针与靶杂交时，荧光团不与双链DNA相互作用，这样结合到本发明寡核苷酸上的荧光团突出入溶液并显示出提高的发射水平，而这样的升高不依赖靶序列。由Marks et al(2005)描述的分子和计算机建模与此要点相关，其通过引用并入本文。
对于“基本不具有二级结构的单链寡核苷酸”，我们包括的意思是寡核苷酸不具有如下的序列，即其中有彼此反向互补的实质性部分从而使得分子内碱基配对。对于“实质性部分”，我们是指4个或更多个连续核苷酸残基。尤其是，不与设计成包含反向互补的实质性区域，诸如分子灯塔、蝎形、LUC和Smart探针的在先技术中的寡核苷酸探针相似，本发明的探针通常设计成避免这样的反向互补。本发明的寡核苷酸探针只使用靶的反向互补，而不包括产生二级结构的其他序列。
使用核酸折叠软件，如Mfold(Zucker(2003))来预测寡核苷酸的可能二级结构。二级结构的稳定性经常通过其自由能(OG)来表示，即破坏二级结构所需要的能量，其中大的负OG值显示出稳定的结构。本发明的探针通常具有正或小的负OG值，优选地大于-2kcal/mol并且更优选地大于-1kcal/mol。依赖于二级结构的探针技术，例如蝎形，通常表现出更大的负OG值。Thelwell et al(2000)描述的蝎形探针具有的OG值在-7.7kcal/mol-12.2kcal/mol范围内。
当寡核苷酸的某一区域与另一区域杂交而例如形成环(如在常规分子灯塔中一样)时，产生了二级结构，而这降低了寡核苷酸与其靶杂交的效率。在本发明的寡核苷酸中，寡核苷酸的区域实质上不倾向于与其他区域杂交，而这可以使用如上述的Mfold软件来估计。
荧光基团(荧光团)结合到本发明寡核苷酸的内部碱基上，而非5’或3’末端，并认为当是单链而不是双链形式(即因为与靶的杂交)时，更大程度地被淬灭，因为认为DNA碱基在不形成碱基对时，能够堆积在荧光团上。在单链状态时，荧光团被夹在2个DNA碱基之间而形成稳定的疏水结构。当核苷酸参与碱基配对形成双链时，此结构被打开。
具有末端标记，碱基堆积仍只发生在杂交时的荧光团的一侧。当本发明的寡核苷酸杂交时，荧光团不会定位在DNA碱基之间，但能不受限制的从碱基向外延伸。如果荧光团在双链中比在单链状态中接近更多鸟嘌呤，那么如简单探针(Simple Probes)等末端标记的探针因双链的形成而淬灭。然而，如果末端标签结合到探针的高鸟嘌呤富集区域，应该会因双链的形成而被增强(US 6,635,427)。根据鸟嘌呤在探针和靶链中的位置和富集度的荧光淬灭和增强的序列依赖性未在本发明的寡核苷酸中观察到。
所有的DNA碱基都能够在一定程度上淬灭荧光，其中G的此项能力最强。为避免疑虑，术语“结合的淬灭剂”不包括形成寡核苷酸的部分的DNA碱基。本发明的寡核苷酸上的荧光团会与单链探针的碱基相互作用，从而使荧光被淬灭。因为预计荧光团在靶杂交时投射入溶液，并不与双链DNA相互作用，所以靶的序列不影响荧光变化的方向，即靶上的鸟嘌呤不因杂交而淬灭荧光。因此，本发明的寡核苷酸当与靶序列杂交时，表现出提高水平的荧光。Gs可调节荧光强度，但杂交时全部显著地去淬灭。无论鸟嘌呤在探针和靶链中的位置和富集度，内部连接到本发明寡核苷酸的荧光团发射的荧光通常因双链的形成而被增强。
尽管通常遵循简单的间隔约束条件以避免导致如

图11所示的降低的峰高或负峰的有害相互作用，但本发明的双和多标记的寡核苷酸当与互补核酸序列杂交时，尽管缺少淬灭剂组分，与单链(非杂交)构象相比，明显发射出更大量的荧光。
信噪比是包括本发明寡核苷酸的双链杂交体的信号强度与单链探针的信号强度的比值，且优选地尽量大，例如是2或更高。尽管缺少相连的淬灭剂部分，但本发明寡核苷酸的信噪比显著地、有益地大于1。认为当探针与靶分子杂交时，比在单链状态时，荧光团部分发射出显著更多的荧光信号，这是源于与DNA序列的一些形式的相互作用。本发明的双或多标记的寡核苷酸探针具有比同一序列的单标记寡核苷酸的期望值更高的比率。
当荧光团标记的残基被置于全序列环境下时，在靶杂交时发生荧光增强。将荧光团标记的残基置于与G’s邻近会导致双链状态下高水平荧光增强。然而，当荧光团标记的残基位于高C富集区时，也发生由于靶杂交产生的荧光增强。在本发明的一个具体实施方式
中，靶链的残基不负责杂交中淬灭或增强探针荧光。荧光团与寡核苷酸相互作用的性质在自由和杂交寡核苷酸之间不同，因此本发明的寡核苷酸当是双链形式时比单链形式表现出更高水平的荧光发射，这说明没有针对功能的明显序列限制，尽管序列可影响荧光增强的级数。
通常，寡核苷酸具有2或3或4或5或6或7或8或9或10个用荧光团标记的内部残基。该数量依赖于寡核苷酸的长度。通常多到内部残基的大约三分之一用荧光团标记，但可更少些。
本发明寡核苷酸的长度优选地使其适于与互补多核苷酸靶杂交，以提供稳定的杂交体，而杂交体的解链温度依赖于靶的精确序列。包含少于15个核苷酸残基的寡核苷酸在许多情况下不能形成足够稳定度杂交体，尤其是当2个杂交序列不完全互补的时候，虽然它们也可在一些情况下使用。长于大约30个核苷酸残基的寡核苷酸可形成解链温度对可能出现的单核苷酸错配更敏感的杂交体，虽然它们也可用在一些情况下。
通常，寡核苷酸的长度是10-50个核苷酸残基，优选的长度是15-30个核苷酸残基。这样寡核苷酸长度通常是从10或11或12或13或14或15个核苷酸残基至(并包括)25或26或27或28或29或30个。这样，本发明包括以上所述范围内的任何大小的寡核苷酸。
大小范围在15-30个核苷酸的寡核苷酸可具有多至大约10个其内部核苷酸残基用荧光团标记，但通常此大小范围内的寡核苷酸具有2或3或4或5个其内部残基用荧光团标记。
优选地，用荧光团标记的核苷酸残基中至少2个(或该情况下的只有的2个)被至少2个非标记的核苷酸残基分隔。通常有2或3或4或5或6个未标记的核苷酸残基来分隔标记的核苷酸残基。特别优选地，2个未标记的残基分隔标记的残基。另外特别优选地，所有的标记核苷酸探针被至少2个未标记核苷酸残基分隔。优选地，分隔荧光团从而避免荧光团间的直接“接触”淬灭。接触淬灭产生于荧光团间的物理接触，且通常使用物理分隔来避免接触淬灭(即荧光团标记的碱基间至少有2个核苷酸残基)。
核苷酸残基经常衍生自天然的核苷A、C、G、T和U。然而，可在本发明寡核苷酸的一个或多个位置使用核苷酸类似物，这样的核苷酸类似物例如在碱基部分和/或糖部分和/或磷酸键被修饰。碱基修饰，例如丙炔基dU(dT类似物)和2-氨基dA(dA类似物)，一般改变了杂交特性并使得具有少于15个核苷酸残基的寡核苷酸的应用更有吸引力。对于含丙炔基dU的寡核苷酸，它们的长度大约为10个残基，并依赖于所需的与靶序列的解链温度。
另外，可使用包括或仅包括肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、2’-O-甲基RNA、亚磷酰胺DNA、硫代磷酸酯DNA、甲基磷酸酯DNA或磷酸三酯DNA的寡核苷酸以与靶序列形成化学或酶学更稳定的相互作用。
优选地在本发明的寡核苷酸中使用同样的荧光团。可使用任何能结合核苷酸残基的荧光团，只要其不阻止寡核苷酸与其靶序列杂交。
合适的荧光团包括基于荧光素的荧光团，例如FAM(6-羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素；基于罗丹明的荧光团，例如ROX(6-羧基-X-罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；Cy染料家族，尤其是Cy3和Cy5，以上所有都可购自Glen Research，22825 Davis Drive，Sterling，VA 20164，USA。
可使用的其他荧光素例如具有不同发射光谱的荧光素，如NED和JOE。可使用其他荧光团，例如在如下表9-15中详述的Alexa、Atto、Dyomics、Dyomics Megastokes和Thilyte染料家族中的荧光团。
在本发明的优选具体实施方式
中，分别使用C6 FAM dU(购自University of Southampton，UK)或荧光素dT(购自Glen Research，Sterling，VA)在内部尿嘧啶/胸腺嘧啶碱基处标记寡核苷酸(在本文中，dT和dU的结构是相同的，因此这两个术语可交换使用)。可将FMOC保护的亚磷酰胺包含在寡核苷酸内部的T位置，并作为多种荧光染料结合的位点，这些荧光染料包括但不局限于FAM、TET、HEX、ROX、TAMRA、Cy3和Cy5，所有这些都可购自Glen Research。寡核苷酸合成后，可从2’-保护的尿苷上去除FMOC基团，如适当保护的6-羧基荧光素亚磷酰胺的荧光团亚磷酰胺可偶联到游离的2’-羟基基团。在另一具体实施方式
中，在内部的A、C或G位置标记寡核苷酸，而标记的核苷酸或在固相寡核苷酸合成期间作为亚磷酰胺而被纳入，或在寡核苷酸合成后使用保护的亚磷酰胺(例如8-胺烷基-dA，7-胺烷基7-deaza-dA，N(4)-胺烷基dC和5-胺烷基-dC)与荧光团结合。
尽管通常在本发明的寡核苷酸上使用相同的荧光团，但在同一个寡核苷酸上使用不同荧光团是有益的。例如在实施例中更详细讨论的，在同一个寡核苷酸中同时出现ROX和FAM是有益的。特别优选的是寡核苷酸包含2个荧光团，其中一个是ROX而另一个是FAM。当寡核苷酸用于多重应用(multiplexing)时，在同一个寡核苷酸中使用2个或多个不同的荧光团是特别有益的。
优选地，荧光团不插入双链DNA。优选地，荧光团不是噻唑橙(TO)。
可预期本发明双标记的寡核苷酸可显示出2倍于单标记探针的荧光信号和背景噪音，从而维持了信噪比(即可预期有累加效应)。然而，令人惊奇的是，双标记探针的信噪比比相同序列的单标记探针所观察到的信噪比更高。在其他本发明的多标记寡核苷酸中也观察到相似的、未预料到的信噪比升高。
另外，如在实施例中更详细描述的，已证明双、三、四和更多的多标记探针能产生比相同核苷酸序列的单独的单标记探针的积累效果(如果效果是简单相加的话)显著更高的解链峰。
通常，本发明的寡核苷酸具有与靶核苷酸序列互补的序列。这样，该寡核苷酸能够在适当的条件下与靶多核苷酸序列杂交。这样，除非文中另有说明，“互补”包括寡核苷酸能够与靶多核苷酸序列杂交的意思。寡核苷酸可与靶多核苷酸序列完全互补(即寡核苷酸之间的碱基配对完全匹配)，或者寡核苷酸与靶多核苷酸序列部分互补(即寡核苷酸和靶多核苷酸序列之间有1个或多个错配，但寡核苷酸仍然能够杂交)。通常，当寡核苷酸与靶多核苷酸是部分互补时，其中少于5个错配，优选的是1或2或3或4个错配，更优选的是1个错配。方便地说，寡核苷酸具有与其靶的互补链至少70％序列相似性，更优选的是至少80％或至少85％或至少90％或至少95％。例如，对于20个残基的寡核苷酸，可有6或4或3或2或1个与靶的错配。
通常，靶多核苷酸序列选自以下构成的组包括其中任何基因或其等位基因的人基因组、包括其中任何基因或其等位基因的小鼠基因组以及包括其中任何基因或其等位基因的任何传染病原的基因组。优选地，寡核苷酸是与以下人类基因或其等位基因中任何一种互补的序列 N-乙酰转移酶2 X14672 因子V Leiden AY364535 因子IIAF493953 MTHFR NM_005957 镰刀细胞贫血症AY356351 羊PrP基因(NM_001009481)也是分析的优选基因。
同样优选地，寡核苷酸具有与以下传染病原的基因组或其中任一基因或其等位基因互补的序列 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)X07547 腺病毒AJ293905 流感A AY130766 肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)X52474 MRSA AJ810121 如在实施例中进一步描述的那样，寡核苷酸可以是与基因的等位基因互补的序列。例如，其可以与基因的突变等位基因互补，而该基因在人类中可以与特定的遗传疾病(例如囊肿性纤维化)相关，或其可与野生型等位基因互补。优选地，与基因的另一等位基因相比，给定等位基因中不同的核苷酸序列的互补序列朝向寡核苷酸的中部(例如在核苷酸残基的中间至三分之一的范围内)。这可用于对给定的寡核苷酸(其可与两种等位基因都杂交但具有不同的Tm)的解链温度的良好鉴别。
在优选的具体实施方式
中，本发明的寡核苷酸优选地具有与已知的多核苷酸靶的等位基因完全互补的序列，其中的多核苷酸靶具有已知的多态性，例如点突变或单碱基插入或缺失(SNP)。多态性的位点优选地，但不是必须的，位于寡核苷酸探针内的中央。另外，寡核苷酸可与已知的非多态性多核苷酸序列互补，并简单地用于检测靶，例如用于快速病原体检测。而且，寡核苷酸可用于研究未知的及未表征的多态性的潜在多态性靶。设想通过不同寡核苷酸杂交和解链峰Tm的差异，而定位未知多态性位置和/或特性的方式的可能性。当本发明的寡核苷酸被用来与多核苷酸靶杂交时，以上所有的特性有助于形成稳定的杂交体，而该杂交体具有最佳的解链温度以及在完全匹配的链和具有一个或多个错配位置的链之间在解链温度(ΔTm)方面具有实质性差异。
如以下详细讨论的，尤其当本发明的寡核苷酸在核酸扩增反应中用作靶多核苷酸序列的产物的探针时，寡核苷酸是在3’核苷酸残基不包含3’羟基基团的寡核苷酸。优选地，寡核苷酸是不能作为DNA聚合酶的引物，并不能被DNA连接酶连接的寡核苷酸。方便地说，3’核苷酸残基是3’脱氧残基。而且方便地说，3’核苷酸残基可具有3’磷酸，或其他能阻止链延伸的3’基团。
本发明另一方面提供了固定在固体支持物上的本发明的寡核苷酸。固体支持物可以是任何合适的固体支持物。文献中已经详细描述了固定寡核苷酸的技术和连接体，其使用的支持物的形式可使寡核苷酸在溶液中与互补靶杂交。
本发明另一方面提供了本发明寡核苷酸的阵列。阵列包括固定在固体支持物上的寡核苷酸的2个或更多个单独可寻址的位点。通常，阵列包含10，或至少100，或至少1000个这样的位点。通常，阵列包括具有不同序列的寡核苷酸，通常每一个不同的位点与具有不同序列的寡核苷酸相关。在优选的具体实施方式
中，阵列是使用支持物，以间隔位置固定的寡核苷酸探针的阵列，其中不同的寡核苷酸探针是本发明的不同寡核苷酸。而且，本发明的寡核苷酸可用于分析固定在支持物上或内的DNA靶，而不同的靶以阵列类型的格式放置在间隔的位置上。
固定寡核苷酸和使用寡核苷酸阵列的方法是本领域已知的。
本发明另一方面提供了在包含多核苷酸序列的样品中研究靶多核苷酸序列的方法，该方法包括将样品与能够杂交靶多核苷酸序列的本发明的寡核苷酸接触，并测定是否杂交。
样品可以是任何合适的样品，并可以是已知包含靶多核苷酸序列的样品，或者是未知其包含靶多核苷酸序列的样品，而且本项研究的目的是研究该样品是否包含靶多核苷酸序列。
因为寡核苷酸是荧光标记的，并且当寡核苷酸与靶结合时，荧光会升高，所以荧光的升高可方便地用于测定寡核苷酸和靶多核苷酸序列之间是否发生了杂交。
应了解到，在给定条件下，寡核苷酸能够在特定的温度与其靶杂交。如以下详细讨论的那样，希望改变杂交的温度，并在不同温度下检测荧光，从而研究靶多核苷酸序列。这样，在本发明优选的具体实施方式
中，在预设的温度，或靶多核苷酸序列和所述寡核苷酸之间形成杂交体的解链温度附近的范围内实施该方法。Tm通常使用解链曲线分析来确定，其中50％的探针与靶序列杂交而50％解链并游离在溶液中。
寡核苷酸可与靶多核苷酸序列完全互补，并且在给定杂交条件下，寡核苷酸具有特征性Tm。另外，寡核苷酸可不与靶多核苷酸序列完全互补，但仍然能与其杂交(部分互补)，并且该寡核苷酸具有特征性(但几乎一定是不同的)Tm。
本发明的方法尤其适用于基因多态性的分析，因此在具体实施方式
中，待研究的靶多核苷酸序列是基因的一个或多个等位基因。在此方法中使用的寡核苷酸方便地是能够与基因的1个以上的等位基因杂交的寡核苷酸，并通常在给定杂交条件下，不同的等位基因具有不同的Tm。
此方法可用于检测靶序列存在与否，例如在未知是否含有靶序列的样品中使用。此方法也可用于鉴定靶序列或用于定量样品中靶多核苷酸的量。通常，为此使用在寡核苷酸与靶多核苷酸结合时的荧光升高。
当样品包含扩增产生的多核苷酸序列时，是特别方便的，因为生物材料的起始原料(例如是唾液、口腔刮擦物、小量的干燥血液等等)经常只包含少量的、可能包含靶多核苷酸的核酸。
合适地，多核苷酸序列可通过任何一种或多种聚合酶链式反应(PCR，其包括不对称PCR扩增)，反向转录PCR(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链替代扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)或依赖核酸序列的扩增(NASBA)。
在优选的具体实施方式
中，样品中多核苷酸序列的扩增在存在寡核苷酸时进行，其中的寡核苷酸能与靶多核苷酸序列杂交。在此具体实施方式
中，特别优选的是寡核苷酸的3’核苷酸残基不包含3’羟基。特别优选的是反应中出现的本发明的寡核苷酸不能被DNA多聚酶进行链延伸，并不能被DNA连接酶连接。在此具体实施方式
中，也优选的是在样品中的多核苷酸序列扩增期间观察荧光。
在扩增前，无需从生物原料中提取核酸，因为扩增的程序能够进行这样的提取。这样，例如，样品中的多核苷酸序列可通过扩增从生物原料中产生，例如从唾液中产生，同时不需要之前的核酸提取。
本发明提供了研究具有已知多态性的多核苷酸靶的方法，该方法包括提供包含荧光团标记的核苷酸残基的寡核苷酸探针。多核苷酸靶与寡核苷酸探针温育从而形成杂交体，其中寡核苷酸探针在杂交体形式时比单链形式时表现出更高水平的荧光。在预设的温度下观测，或在一定温度范围内监测寡核苷酸探针所发射的荧光水平。
方便的是，如果在研究中使用单寡核苷酸探针，其中寡核苷酸可在不同Tm下与2个不同的等位基因杂交，可使用位于2个Tm中间的温度，或在一定温度范围内实施该项分析(即，通过解链分析)。
应了解到，此方法可包括2个或更多个发明的寡核苷酸探针，其与不同的靶序列(例如同一个基因的不同等位基因)杂交。方便地说，当被杂交到(或杂交到)其各自的靶多核苷酸序列时，使用具有不同荧光特性的荧光团，或者2个或更多具有不同解链特征(例如Tm)的寡核苷酸来区分这些靶序列。
通常，当使用一定的温度范围时，该范围包括寡核苷酸和其多核苷酸靶之间形成杂交体的Tm。方便地说，温度范围与Tm相比是±10℃，通常是±5℃。
方便地说，如果研究中包括2个不同的寡核苷酸探针，那么就在一定的温度范围内实施分析(即通过解链分析)。
实施本发明的方法尤其有用，如此以来可以观测荧光信号对应温度的变化速率。
通常，本发明的寡核苷酸是与其靶多核苷酸序列形成杂交体的寡核苷酸，其中杂交体具有的Tm是20℃-90℃，优选的是40℃-70℃。
在本发明的寡核苷酸探针用于检测完全互补靶序列和部分互补靶序列的情况下，如果靶浓度超过探针浓度，则发生对完全互补序列的优先杂交，因为错配序列不太稳定。在极端情况下，优先杂交只检测靶的完全互补形式。从而，可提高探针的浓度来有助于错配靶的杂交并改善峰高的平衡。
在本发明此方面的具体实施方式
中，本发明的一个或多个寡核苷酸包括在PCR分析中，并当与互补靶序列杂交时比其在单链状态下发射出更大量的荧光。扩增后，通过解链曲线分析来确定靶序列的存在和特性(French etal，2001，French et al，2002)。杂交的探针的稳定性和解链温度依赖于探针与靶序列之间的同源性程度。提高反应温度高于本发明寡核苷酸的Tm导致探针/靶双链体解聚，以及荧光发射量的降低。基于解链峰Tm，可以检测和区分少至单个寡核苷酸不同的序列。可在少至16分钟内完成50个循环的扩增和解链分析。使用本发明寡核苷酸来进行同源性序列分析的一个优点来自其通过单寡核苷酸探针而可靠鉴定纯合和杂合样品的能力。
多核苷酸靶可以是DNA、RNA或cDNA，并以单链形式使用，或者探测DNA双链体而形成三链体。在具体实施方式
中，多核苷酸具有已知的多态性，优选地是单核苷酸多态性(SNP)。靶在杂交条件下与本发明的寡核苷酸探针杂交。杂交体必须产生比单链寡核苷酸探针更强的荧光信号。除此之外，杂交体的解链稳定依赖于多核苷酸靶和寡核苷酸探针之间是否完全互补或者在SNP位置或邻近是否有单或甚至是双错配。该方法包括在预设的接近杂交体的解链稳定的温度，或者在一定的温度范围内观测由寡核苷酸探针发射的荧光信号的水平。虽然其他方法也可用，但在此描述了2种替代方法 a)缓慢升高包含杂交体的溶液的温度，同时连续观测荧光信号，从而构建出荧光信号强度关于温度的负导数(-dF/dT)与温度的图形。杂交体的解链温度(Tm)以峰的形式出现，并提供了关于多核苷酸靶的序列的信息。可使用通过本发明的寡核苷酸的解链分析中产生的Tm来区分多态性靶。相似地，可通过从高温度缓慢冷却溶液并确定退火温度来进行此分析。
b)杂交体的溶液保存在预设温度下，并观测荧光水平。一般地，预设的温度选择在完全匹配的杂交体的解链温度和具有1个或2个错配的杂交体的解链温度中间。所观察到的荧光信号的水平提供了杂交体是否解聚的指示，从而提供了关于多核苷酸靶的序列的信息。多态性靶以末端和实时形式来区分。
方便地说，多核苷酸靶可以是PCR扩增引物，该扩增引物通过使用合适的引物而形成从而扩增基因组DNA的所需部分。以同源性方式实施扩增和靶研究是方便的，例如在扩增循环过程之前、期间或之后向单反应容器中添加寡核苷酸探针。直接从样品，例如唾液，且无在先的DNA、RNA或cDNA提取的情况下实施靶扩增和序列研究也是方便的。优选地，寡核苷酸探针在其3’-末端进行修饰从而阻止在PCR扩增期间的链延伸。在另一方面，可使用不对称PCR进行靶扩增从而产生大量的单链靶。通过提高靶浓度，能够避免完全互补靶序列超过错配靶的优先探针杂交。使用本发明寡核苷酸的分析所需要的靶扩增也可使用替代的技术实施，例如连接链式反应(LCR)、转录介导的扩增(TMA)和依赖核酸序列的扩增(NASBA)。通常，在非对称分析中使用高于150mM的探针浓度。
方便地是，提供2种或更多种本发明的寡核苷酸，在研究中每种完全互补于SNP的每一个等位基因。当本发明的每一种寡核苷酸携带不同的荧光团时，方便地是将探针在溶液中混合而用于纯合和杂合靶的分析。以同样的方法，只要每种寡核苷酸用光谱可区分的荧光团来标记，就可在溶液中一起使用互补于几种不同SNP的多种等位基因的本发明的寡核苷酸的混合物，而用于多元分析。也可使用单一类型的报告染料(荧光团)、2种或更多种表现出不同匹配和错配Tm的本发明的寡核苷酸来实施这样的多元分析，这样可基于解链温度而同时检测和鉴定多个靶和等位基因。
可如下实施本发明的方法，其中的寡核苷酸能够与靶多核苷酸序列杂交，包含多核苷酸靶序列的样品单独或者与寡核苷酸一起都固定在支持物上或内。
靶多核苷酸序列选自以下构成的组包括其中任何基因或其等位基因的人基因组、包括其中任何基因或其等位基因的小鼠基因组以及包括其中任何基因或其等位基因的任何传染病原的基因组。优选的靶序列如上文所描述。
本发明另一方面提供了制造本发明寡核苷酸的方法，该方法包括选择靶多核苷酸序列，并合成寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列具有与靶多核苷酸互补的序列并且具有在本发明第一方面提出的特性。通常，寡核苷酸是能够与靶序列杂交的序列。寡核苷酸是与靶序列完全互补的序列，或者其是如上所述的错配的序列。
优选地，如上所更详细地描述，靶多核苷酸序列选自以下构成的组包括其中任何基因或其等位基因的人基因组、包括其中任何基因或其等位基因的小鼠基因组以及包括其中任何基因或其等位基因的任何传染病原的基因组。
通过此方法产生的本发明的寡核苷酸可置于阵列上，这样本发明也包括通过将2个或多个本发明的寡核苷酸置于固体支持物上而生产寡核苷酸阵列的方法。通常，放置(或结合)的寡核苷酸所处的位点均一地分布在支持物上。
本文所引用的所有文献包括在说明书中。
通过引用以下非限制性的实施例和图，将更详细地描述本发明。
图1.显示了在本发明的寡核苷酸中使用的C6 FAM dU和Glen荧光素dT标签的化学结构。
图2.显示了使用单标记的寡核苷酸(HYBA1928C)直接分析唾液样品的5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrafolate reductase，MTHFR)A1928C的多态性。荧光对温度的负导数(y轴的-dF/dT)对应样品温度(x轴)绘图从而产生解链峰。寡核苷酸得到的解链峰所具有的Tm在有A和C时分别是大约51.5℃和61℃。杂合样品产生51.5℃和61℃两个解链峰。
图3.显示了从单标记(FVG1)和双标记(FVG11)因子V寡核苷酸来源的解链峰。附加的荧光团导致解链峰高升高了4-5倍，并降低了探针的Tm大约5℃。
图4.A)使用沙眼衣原体(LGV-II，strain 434，ATCC VR-920B，AdvancedBiotechnologies，Maryland，U.S.)和处理的临床刮擦样品的纯化的DNA得到的HYBCH2探针解链峰。Tm为大约60℃的单一解链峰在有衣原体靶DNA存在的情况下产生。B)使用HYBCH6衣原体探针得到的实时PCR和解链峰数据。三标记的衣原体探针得到的解链峰大约是单标记HYBCH2寡核苷酸级数的6倍。
图5.显示了使用纯化的淋病奈瑟菌DNA获得的HYBNG(本发明的双标记寡核苷酸)的解链峰。产生了Tm为大约59℃的单一解链峰。
图6.A)从一系列纯化的人基因组DNA获得的解链峰，其中使用双标记FVG11探针来对样品的因子V Leiden多态性进行分类。纯合野生型样品产生了Tm为大约55℃的单一解链峰。杂合样品通常获得匹配和错配的，并分别具有大约55℃和45℃的Tm。纯合“突变”样品只获得45℃的解链峰。隐性对照反应不产生任何解链峰。B)使用LightCycler软件，基于解链峰的数量和Tm来对样品的因子V Leiden多态性进行分类。
图7.显示了计算探针信噪比的方法。在Tm±10℃范围内，测量分别为解聚和杂交探针状态的荧光读数。以杂交信号除以解聚信号来计算信噪比。
图8.A)与单标记FVG1探针相比，双标记FVG11探针显示出大约2倍的背景荧光量(大于70℃)。然而，B)双标记因子V探针得到的解链峰是单标记探针产生的峰值的大约5-6倍。这表明与FVG1相比，FVG11的信噪比要好～3倍，而设想的结果是2倍的荧光团会产生2倍的背景和2倍的信号，因此信噪比不变。杂交中，FVG1和FVG11分别显示出33％和82％的荧光升高。
图9.显示了使用纯化的基因组样品对单(FVG1)和双标记(FVG11)因子V探针的比较。使用10℃至数据和背景矫正LightCycler功能的多项式之间的平均光滑来分析解链峰。阴性对照反应(NC)不产生FVG1或FVG11的解链峰。1ng/μl纯合“野生型”DNA得到单和双标记探针的Tm分别是59℃和54.6℃的单解链峰。杂合(HET)基因组样品得到匹配的和错配的解链峰。双标记解链峰的高度比单标记探针产生的解链峰高大约3-4倍。
图10.显示了相同序列的3’、5’和内部标记的探针间的比较。5’标记的探针在靶杂交时表现出荧光淬灭，并产生-dF/dT线的颠倒的峰。3’标记的探针在杂交时，既不显示出荧光增强也不淬灭。内部标记的寡核苷酸在靶杂交时，显示出荧光增强，并产生-dF/dT线的正峰。单和双标记的探针都不依赖于靶序列，并在杂交时，一直表现出增强水平的荧光。
图11.A)HYBCH(1)、HYBCH(2)、HYBCH(3)和HYBCH(4)衣原体探针的比较。与单和双标记探针相比，用3个和4个FAM染料标记的探针发射出相当低水平的荧光，这是因为标记很邻近。三标记探针(3)在双链解聚时，表现出提高水平的发射。B)从4种衣原体探针得来的解链峰。三标记探针得到小而颠倒的解链峰，Tm高于双标记变异体。用4个FAM染料标记的探针得到小的正解链峰，Tm大约与双标记探针产生的Tm相等。C)比较双标记HYBCH(1)、单标记HYBCH(2)以及三标记HYBCH(4)和HYBCH(6)寡核苷酸。
图12.显示了从单标记(1)、双标记(2)和三标记(3)因子V寡核苷酸探针得到的解链峰。
图13.显示了包含A)FAM dA和B)FAM dC的单标记(1)和双标记(2)的本发明的寡核苷酸。
图14.A)使用HYBCH2探针用于检测沙眼衣原体的对称和不对称PCR的比较。B)对称PCR和非对称扩增的单标记探针(1)与非对称扩增和单标记探针(2)以及使用双标记探针变异体的非对称PCR(3)的比较。使用非对称PCR和双标记HYBCH探针使衣原体解链峰的峰高提高了7倍多。
图15.150nM的FVG11与75nM的FVG和75nM的FVG寡核苷酸靶杂交(1)。300nM的探针与150nM的FVG和150nM的FVA杂交(2)。150nM的探针还与500nM的FVG和500nM的FVA杂交。在高靶浓度下，探针与完全互补的靶序列的优先杂交完全阻止了错配靶变异体的检测(3)。
图16.A)在60个循环的非对称靶扩增后，当使用150nM的FVG11探针时，匹配和错配的因子V的解链峰的峰高失衡。将探针浓度升高到500nM改善了解链峰峰高的平衡。B)使用150nM、300nM和500nM的FVG11探针，进行50、60和70个循环的对称和非对称靶扩增后，测量FVG11解链峰的峰高。
图17.显示了使用PolyT(1)、HYBINF(2)、HYBCH2(3)和HyBAdC(4)寡核苷酸探针对靶序列的多重检测。多重检测基于解链峰Tm和对所有探针使用的FAM。
图18.显示了使用了三标记HYBCH6探针获得的解链峰，用以检测从纯化的衣原体DNA和模拟质粒分别扩增来的匹配和错配靶序列。探针显示出的Tm分别是衣原体DNA为大约60.3℃，模拟靶为大约51.8℃。没有靶时不产生峰。
图19.显示了使用双标记FVG11探针，并用人基因组DNA的稀释液来产生实时标准曲线。系列稀释包括100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、0.1ng/μl和0.01ng/μl的基因组DNA。
图20.显示了用A.TAMRA，B.ROX、C.Cy5、D.ROX和FAM标记的双标记FVG11衍生探针的解链曲线，而且曲率说明了杂交状态导致的荧光的变化。
实施例所涉及的材料和方法 寡核苷酸探针设计和合成 本发明的寡核苷酸探针通常设计为大约18-25个核苷酸的长度，或当与完全互补靶序列杂交时，具有大约为55-60℃的Tm。使用C6 FAMdU(University of Southampton，UK)或荧光素dT(Glen Research，Sterling，VA)将荧光团结合到探针序列的内部残基上。就C6 FAM dU来说，6-羧基荧光素(FAM)通过本领域已知的DNA合成方法结合到尿嘧啶碱基的5位置。在固相寡核苷酸合成期间，荧光团可以亚磷酰胺的形式被纳入探针内(Brown et al，2001，Brown et al，2003)。可在合成后，使用来自Glen Research的单体，如8-胺烷基-dA和5-氨基烷基-dC来进行其他荧光修饰。本发明的寡核苷酸可具有3’磷酸组分或其他阻断剂在探针被纳入至实时PCR分析时，阻止Taq介导的延伸。
通过溶解等分量的寡核苷酸探针在特定体积的水中，以及在260nm处测量UV吸收来确定合成所得探针的量。从寡核苷酸的UV吸收及其在260nm处的消光系数来计算探针的浓度。从寡核苷酸所包含的未修饰和荧光标记核苷的单独消光系数的总和来计算寡核苷酸的消光系数。
多态性位点方便地定位于靠近寡核苷酸的中央从而最大化ATm。通常选择多态性位点处的核苷酸，这样当探针与错配靶杂交时，发生高度不稳定的相互作用。优先使用表现出C/A、C/T和C/C错配的探针，而避免使用G/T、G/A和G/G错配的探针。如以上所讨论的，寡核苷酸探针可与其靶的互补序列具有70％或80％或85％或90％或95％的序列同源性。
聚合酶链式反应 PCR体积通常是20μl，其中包括2μl的样品、1xPCR缓冲液、0.5μM引物、1个单位的Taq聚合酶(安发玛西亚生物技术公司Amersham PharmaciaBiotech)，3mM总MgCl2、5ng/μl的BSA(罗氏诊断产品有限公司RocheDiagnostics)、1mM的dNTPs(安发玛西亚生物技术公司.AmershamPharmacia Biotech)和150nM的探针。在使用寡核苷酸的分析中所使用的缓冲液是10x PCR缓冲液(TaKaRa，含1.5mM MgCl2)、用于直接尿液分析的10x HEPES#7(100mM HEPES pH8.3，250mM KCl)和用于直接唾液分析的10x HEPES#8(100mM HEPES pH8.3，500mM KCl)以及纯化/处理过的样品。使用LightCycler instrument(罗氏诊断产品有限公司Roche Diagnostics)进行靶的均相扩增和检测。使用3阶段热方案实施实时PCR检测和靶定量，其中在起始变性反应步骤(95℃ 1min)后，使用50个循环的变性(95℃ 5s)、引物退火(55℃ 10s)和产物扩增(72℃ 10s)来扩增靶。每次循环都获取荧光，在3阶段分析中，荧光获取是在每次引物退火步骤结束时。另外，可使用2阶段热方案对靶进行快速扩增，其中在起始变性步骤(95℃ 1min)后，使用50个循环的变性(95℃ 5s)和退火/延伸组合阶段(65℃ 10s)来扩增靶。在2阶段扩增中不获取荧光。
靶检测和鉴定 在3阶段和2阶段扩增后，反应迅速被变性(95℃ 0s)和冷却(35℃ 30s)，然后进行解链曲线分析(以0.2℃/s的转换速率35-95℃)，其中联系获取荧光。使用LightCycler软件(3.5版)，根据温度(y轴上的-dF/dT)对温度(x轴)测绘荧光的负导数来构建解链峰。使用寡核苷酸探针峰的解链温度(Tm)可靠地检测和鉴定靶。
实施例1示例性单标记寡核苷酸探针 以下是用于靶序列的检测和多态性靶的鉴定的探针的实例。提供了用于扩增相应靶的引物序列。此实例包含用于与本发明双标记和多标记探针比较的单标记寡核苷酸探针。
通过解链分析，使用寡核苷酸探针如2303002(5′GAGAGGAATCFGGTACCTGGACC(SEQ ID NO1))进行NAT2*5A(C481T)多态性的分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的碱基代表多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如195993(5′CCTCTAGAATTAATTTCTGGG(SEQ ID NO2))和195991(5′CTGCTCTCTCCTGATTTGGTCC(SEQ ID NO3))扩增包含NAT2*5ASNP的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补的*4和错配的(C:A)*5A等位基因(表1)。设计2303002探针用来与NAT2基因(Genbank序号X14672)具有以下任一种序列的部分杂交 NAT2*45′GGTCCAGGTACCAGATTCCTCTC(SEQ ID NO4) NAT2*5A 5′GGTCCAAGTACCAGATTCCTCTC(SEQ ID NO5) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如DdeFL1*4(5′GAAGTGCFGAAAAATATATTTAAG(SEQ ID NO6))进行NAT2*5C(A803G)多态性的分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的碱基代表多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如DdeF2(5′CCTATAGAAAATTCAATTATAAAG(SEQ ID NO7))和DdeR(5′CACGAGATTTCTCCCCAAGG(SEQ ID NO8))扩增包含NAT2*5C SNP的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补的*4和错配的(A:C)*5C等位基因(表1)。设计DdeFL1*4探针用来与NAT2基因(Genbank序号X14672)具有以下任一种序列的部分杂交 NAT2*45′CTTAAATATATTTTTCAGCACTTC(SEQ ID NO9) NAT2*5C 5′CTTAAATATATTTCTCAGCACTTC(SEQ ID NO10) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如BamFL1*7(5′CCTGGTGAFGAATCCCTTAC(SEQ ID NO11))进行NAT2*7(G857A)多态性的分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的碱基代表多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如BamF2(5′CCTATAGAAAATTCAATTATAAAG (SEQ ID NO12))和BamR(5′CACGAGATTTCTCCCCAAGG(SEQ ID NO13))扩增包含NAT2*7SNP的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补的*7和错配的(A:C)*4等位基因(见表1)。设计DdeFL1*7探针用来与NAT2基因(Genbank序号X14672)具有以下任一种序列的部分杂交 NAT2*45′GTAAGGGATTCATCACCAGG(SEQ ID NO14) NAT2*75′GTAAGGGATCCATCACCAGG(SEQ ID NO15) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBNAT3S(5′CTTTAAAATACAFTTTTTATTATTA(SEQ ID NO16))进行2个NAT1*10SNP的分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸代表多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补、错配和双错配的等位基因(见表1)。已使用在多态性位点具有全部可能的碱基组合的互补寡核苷酸证明此探针的功能。设计HYBNAT3S探针用来与NAT1基因(Genbank序号AY376850)具有以下任一种序列的部分杂交 NATRAA TAATAATAAAAAATGTATTTTAAAGATGGC (SEQ IDNO17) NATRTA TAATAATAATAAATGTATTTTAAAGATGGC (SEQ IDNO18) NATRTC TAATAATAATAAATGTCTTTTAAAGATGGC (SEQ IDNO19) NATRAC TAATAATAAAAAATGTCTTTTAAAGATGGC (SEQ IDNO20) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如FVG1(5′CTGTAFTCCTCGCCTGTCC (SEQ ID NO21))进行因子V Leiden(G1691A)多态性的分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸代表多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如FVF1.3(5′GGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATC(SEQ ID NO22))和FVR3.5(5′GCCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAACATG(SEQ IDNO23))扩增包含因子V SNP的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补的“野生型”和错配的(C:A)“突变”等位基因(见表1)。设计FVG1探针用来与因子V基因(Genbank序号AY364535)具有以下任一种序列的部分杂交 FVG5′GGACAGGCGAGGAATACAG(SEQ ID NO24) FVA5′GGACAGGCAAGGAATACAG(SEQ ID NO25) 通过解链分析，使用单标记寡核苷酸探针如SCT1(5′GTGCACCTGACFCCTGTGG(SEQ ID NO26))进行镰刀细胞贫血症HbS和HbC多态性的同步分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸代表多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如SCF1(5′AGGGCAGAGCCATCTATTGCT (SEQ ID NO27))和SCR2(5′CATCCACGTTCACCTTGCC(SEQ ID NO28))扩增包含镰刀细胞多态性的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补(GT:CA)的HbS、错配(GT:CT)的野生型和双错配(GT:TT)的HbC等位基因(表1)。设计SCT1探针用来与β珠蛋白基因(Genbank序号AY356351)具有以下任一种序列的部分杂交 HbS 5′CCACAGGAGTCAGGTGCAC(SEQ ID NO29) HbWT 5′CCTCAGGAGTCAGGTGCAC(SEQ ID NO30) HbC 5′CCTTAGGAGTCAGGTGCAC(SEQ ID NO31) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBCH2(5′CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO32))进行沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)隐蔽性质粒的检测，其中F是荧光标记的核苷酸。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如CHF3-1(5′GGGTTCGTTGTAGAGCCATGTCCTATCTTG(SEQ ID NO33))和CHR4-1(5′CGCAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAA(SEQ ID NO34))扩增隐蔽性质粒的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定衣原体隐蔽性质粒和错配的(C:A)阳性扩增对照(如下)(见表1)。设计HYBCH2探针用来与隐蔽性质粒(Genbank序号X07547)具有以下任一种序列的部分杂交 HYBCHRC 5′CTTGGTATACATTTGCAGGCTTG(SEQ ID NO35) Mimic 5′CTTGGTATACATTTACAGGCTTG(SEQ ID NO36) 使用单标记寡核苷酸探针对诸如CYP2D6*3、CYP2D6*4、CYP2C19m1、CYP2C19m2、CYP2C9*2和CYP2C9*3 SNP的靶的进一步分析记载于WO01/73118 A2中。
表1在3mM的MgCl2，对完全互补和错配靶的寡核苷酸探针Tm。从互补的寡核苷酸和PCR扩增的靶序列得到解链峰和Tm。包括探针和靶的序列鉴定序号。



实施例2示例性的本发明的双标记寡核苷酸探针 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如FVG11(5′CTGTAFTCCTCGCCFGTCC(SEQ ID NO60))进行因子V Leiden(G1691A)多态性的分析，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸为多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如FVF1.3(5′GGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATC(SEQ ID NO22))和FVR3.5(5′GCCCCATTATTTAGCCAGGAGACCTAACATG(SEQ ID NO23))扩增包含因子V SNP的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补的“野生型”和错配的(C:A)“突变”等位基因(见表1)。设计FVG1探针用来与因子V基因(Genbank序号AY364535)具有以下任一种序列的部分杂交 FVG5′GGACAGGCGAGGAATACAG(SEQ ID NO24) FVA5′GGACAGGCAAGGAATACAG(SEQ ID NO25) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBCH(5′CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO61))进行沙眼衣原体隐蔽性质粒的检测，其中F是荧光标记的核苷酸。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如CHF3-1(5′GGGTTCGTTGTAGAGCCATGTCCTATCTTG(SEQ ID NO33))和CHR4-1(5′CGCAGCTGCTGTAATCACCCAGTCGATAAA(SEQ ID NO34))扩增隐蔽性质粒的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定衣原体隐蔽性质粒和错配的(C:A)阳性扩增对照(见表1)。设计HYBCH2探针用来与隐蔽性质粒(Genbank序号X07547)具有以下任一种序列的部分杂交 HYBCHRC 5′CTTGGTATACATTTGCAGGCTTG(SEQ ID NO35) Mimic 5′CTTGGTATACATTTACAGGCTTG(SEQ ID NO36) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBNG(5′TCTGCFTCCGCFACGGCTTC(SEQ ID NO58))进行淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质粒的检测，其中F是荧光标记的核苷酸。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如NGF1(5′ACTTTGGCGATATTGCTCGG(SEQ ID NO74))和NGR1(5′TACCGAGAACGAACGCGACA(SEQ ID NO75))扩增隐蔽性质粒的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定淋球菌隐蔽性质粒(见表1)。设计HYBNG探针用来与隐蔽性质粒(Genbank序号M10316)具有以下序列的部分杂交 HYBNGRC 5′GAAGCCGTAGCGGAAGCAGA(SEQ ID NO59) 通过解链分析，使用本发明的寡核苷酸如HyBAdC(5′GACGTGGFCCGTGFGCACCAGCCT(SEQ ID NO68))和HyBAdD(5′GACGTGGFCAGAGFGCACCAGCCT(SEQ ID NO71))进行腺病毒C和腺病毒D毒株中的六邻体蛋白基因的检测，其中F是荧光标记的核苷酸。使用3’磷酸阻断从这些探针开始的PCR延伸。使用从VirOligo数据库得到的引物如ADRJC 1(5′GACATGACTTTCGAGGTCGATCCCATGGA(SEQID NO76))(Elnifro et al，2000)和PB00432(5′GCCGAGAAGGGCGTGCGCAGGTA(SEQ ID NO77))扩增六邻体蛋白的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定腺病毒株(见表1)。HyBAdC探针与腺病毒C序列完全互补，并在与腺病毒D序列杂交时，表现出C:T和T:T错配。HyBAdD探针与腺病毒D序列完全互补，并在与腺病毒C序列杂交时，表现出A:G和A:A错配。使用HyBAdC探针(表1)获得探针解链温度的更大变化。设计腺病毒探针用来与六邻体蛋白基因(Genbank序号AJ293905)具有以下任一种序列的部分杂交 HyBAdCRC 5′AGGCTGGTGCACACGGACCACGTC(SEQ ID NO69) HyBAdDRC 5′AGGCTGGTGCACTCTGACCACGTC(SEQ ID NO70) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBINF(5′GGGAFCCAAAFAACATGGACAGAGCT(SEQ ID NO66))进行流感A基质基因的检测，其中F是荧光标记的核苷酸。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如INFA-1(5′GGACTGCAGCGTAGACGCTT(SEQID NO78))和FLU-4(5′ATTTCTTTGGCCCCATGGAATGT(SEQ ID NO79))扩增基质靶序列。因为流感是RNA病毒，所以在靶扩增前需要反转录(RT)步骤。可使用罗氏一步式LightCycler RT-PCR试剂盒在一个反应容器内进行cDNA产生、PCR扩增和靶检测。基于探针Tm可靠地检测和鉴定流感A(表1)。设计HYBINF探针用来与基质基因(Genbank序号AY130766)具有以下序列的部分杂交 INFRC 5′AGCTCTGTCCATGTTATTTGGATCCC(SEQ ID NO67) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如SP1(5′GGGGTCTFCCACTFGGAGAAAGCTATC(SEQ ID NO64))进行肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)的肺炎链球菌溶血素基因的检测，其中F是荧光标记的核苷酸。也研究了链球菌探针的单标记形式(5′GGGGTCTFCCACTTGGAGAAAGCTATC(SEQ ID NO80))。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如SPF2(5′CTTGCGGTTGATCGTGCTCCGATGAC(SEQ ID NO81))和SPR2(5′CATTATTGACCTGACCATAATCTTGATGCC(SEQ ID NO82))扩增肺炎链球菌溶血素的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定肺炎链球菌(表1)。设计SP1探针用来与肺炎链球菌溶血素基因(Genbank序号X52474)具有以下序列的部分杂交 SP1RC 5′GATAGCTTTCTCCAAGTGGAAGACCCC(SEQ ID NO65)通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBFII(5′GCATFGAGGCTCGCFGAGAGTC(SEQ ID NO115))进行因子II(G20210A)SNP的检测，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸为多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如FIIF2(5′CTGGGCTCCTGGAACCAATC(SEQ ID NO118))和FIIR1(5′GCTGCCCATGAATAGCACTGG(SEQ ID NO119))扩增因子II的靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补和错配(C:A)的等位基因(见表1)。设计HYBFII探针用来与因子II基因(Genbank序号AF493953)具有以下任一种序列的部分杂交 FIIRC5′GACTCTCAGCGAGCCTCAATGC(SEQ ID NO116) FIIMM5′GACTCTCAGCAAGCCTCAATGC(SEQ ID NO117) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBA1928C(5′GACCAGFGAAGCAAGFGTCTTTG(SEQ ID NO112))进行MTHFR(A1928C)SNP的检测，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸为多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如1928F(5′CCCAAGGAGGAGCTGCTGAA(SEQ ID NO120))和1928R(5′CCATTCCGGTTTGGTTCTCC(SEQ ID NO121))扩增A1928C靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补和错配(C:T)的等位基因(见表1)。设计HYBA1928C探针用来与5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrafolate reductase)基因(Genbank序号NM_005957)具有以下任一种序列的部分杂交 FIIRC5′CAAAGACACTTGCTTCACTGGTC(SEQ ID NO113) FIIMM5′CAAAGACACTTTCTTCACTGGTC(SEQ ID NO114) 通过解链分析，使用寡核苷酸探针如HYBMTH(5′GTCFGCGGGAGCCGAFTTCATC(SEQ ID NO112))进行MTHFR(C677T)SNP的检测，其中F是荧光标记的核苷酸，下划线的核苷酸为多态性位点。使用3’磷酸阻断从该探针开始的PCR延伸。使用引物如MTHF2(5′CTGACCTGAAGCACTTGAAGGAG(SEQ ID NO122))和MTHR2(5′GCGGAAGAATGTGTCAGCCTCAAAG(SEQ ID NO123))扩增C677T靶序列。基于探针Tm可靠地检测和鉴定完全互补和错配(C:A)的等位基因(见表1)。设计HYBMTH探针用来与5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶基因(Genbank序号NM_005957)具有以下任一种序列的部分杂交 FIIRC5′CAAAGACACTTGCTTCACTGGTC(SEQ ID NO110) FIIMM5′CAAAGACACTTTCTTCACTGGTC(SEQ ID NO129) 实施例3直接分析唾液样品 使用如上所述的MTHFR(A1928C)引物和探针，不需要DNA纯化对一系列唾液样品进行分析。在水中包含大约50％唾液的漱口液直接应用于本分析。在水中的口腔刮擦物也可直接分析。HYBA1928C探针在对A和C等位基因纯合的样品中分别产生Tm大约为51.5℃和61℃的单解链峰(图2)。对A和C等位基因杂合的唾液样品通过产生51.5℃和61℃两个峰而被清晰地鉴定。不需要DNA纯化，也可以从血液直接完成寡核苷酸靶的检测和鉴定。
实施例4使用双和三标记探针的快速靶检测 可使用引物CHF3-1(SEQ ID NO33)和CHR4-1(SEQ ID NO34)扩增衣原体隐蔽性质粒靶。分析使用3阶段的LightCycler方案，其组成为起始变性(95℃ 1min)，随后是50个循环的PCR，PCR包括变性(95℃ 5s)、引物退火(55℃ 10s)和产物延伸(72℃ 10s)。通过加入HYBCH(SEQ ID NO61)或HYBCH6(SEQ ID NO104)探针，以及包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的变化速度缓慢加热到95℃的解链曲线分析来检测和表征所扩增的靶。在存在衣原体DNA时，HYBCH和HYBCH6探针产生了Tm分别为56℃和60.5℃的清晰的解链峰。使用本发明的寡核苷酸的分析在纯化的DNA、纯尿、处理过的(Becton Dickinson，Oxford，U.K.)尿以及棉签和直接从棉签吸取的液体样品中检测到衣原体的存在(图4)。
可使用引物NGF1(SEQ ID NO74)和NGR1(SEQ ID NO75)扩增淋球菌质粒靶。分析使用3阶段的LightCycler方案，其组成为起始变性(95℃ 1min)，随后是50个循环的PCR，PCR包括变性(95℃ 5s)、引物退火(55℃ 10s)和产物延伸(72℃ 10s)。通过加入HYBNG探针(SEQ ID NO58)，以及包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的变化速度缓慢加热到95℃的解链曲线分析来检测和表征所扩增的靶。在存在淋球菌DNA时，HYBNG探针产生了Tm大约为59℃的清晰的解链峰(图5)。
实施例5.单标记和双标记探针的比较 使用引物FVF1.3(SEQ ID NO22)和FVR3.5(SEQ ID NO23)，并且不需要DNA纯化，从唾液样品直接扩增因子V靶。分析使用2阶段的LightCycler方案，其组成为起始变性(95℃ 1min)，随后是50个循环的PCR，PCR包括变性(95℃ 1s)和退火/延伸组合阶段(65℃ 5s)。通过加入FVG1(SEQ ID NO21)或FVG11(SEQ ID NO60)寡核苷酸探针，以及包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的变化速度缓慢加热到95℃的解链曲线分析来检测和表征所扩增的靶。因子V分析可在短到16分钟的时间内完成。当分别使用FVG1和FVG11探针时，纯合野生型样品得到Tm大约为59℃和55℃的单一解链峰。当分别使用FVG1和FVG11探针时，纯合突变样品产生Tm大约为49.5℃和45℃的单一解链峰。当使用单标记FVG1探针时，杂合因子V样品得到59℃和49.5℃两个解链峰，当使用双标记FVG11探针时，产生55℃和45℃两个解链峰(图6)。该分析可有效地用于纯化的DNA、刮擦样品和漱口液。使用FVG1和FVG11探针，根据因子V的多态性对超过450个基因组样品进行可靠的定型。
当为单链时，双标记探针与单标记探针相比表现出更高水平的背景信号。然而，双标记FVG11探针得到的解链峰大约是单标记FVG1探针产生的解链峰大小的4倍，而这明显高于如果附加荧光团的作用只是简单相加时所期望的结果。当与单标记FVG1探针相比时，FVG11中附加的荧光团降低了探针的Tm约4.5℃(图3)。在单标记的HYBCH2(SEQ ID NO32)和双标记HYBCH(SEQ ID NO61)衣原体探针中也观察到相似的Tm降低(图11)。
实施例6探针的信噪比 在单链和双链状态下测量本发明的寡核苷酸的荧光发射量，从而研究探针序列、荧光团位置和双/三标记的影响。通常在TaKaRa缓冲液中将150nM探针与150nM完全互补的寡核苷酸杂交，从而确定本发明的寡核苷酸的信噪比。使用LightCycler解链曲线方案来进行荧光测量，其包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的变化速度缓慢加热到95℃。从探针Tm±10℃的温度所对应的解链曲线获得荧光值，分别作为解聚和杂交状态(图7)。超过此定义的温度范围内进行荧光测量，试图去除温度对发射量的一些影响。杂交和解聚荧光值提供了信噪比的测量，以及探针杂交对发射的影响的指示(表2)，其中信噪比以杂交信号除以解聚信号来计算。发现探针的信噪比可高度再现，并表现出低操作间和仪器间的差异。
当与完全互补的靶序列(SEQ ID NO24)杂交时，单标记FVG1探针(SEQID NO21)具有大约为59℃的Tm，并在49℃和69℃分别表现出8和6的荧光水平(任意LightCycler荧光单位)。双标记FVG11探针(SEQ ID NO60)当与完全互补的靶序列杂交时，具有大约为55℃的Tm，并在45℃和65℃分别表现出21.8和12的荧光水平。单和双标记因子V探针的信噪比分别计算为1.33和1.82。
与等价的单标记探针相比，双标记探针表现出更高水平的背景荧光噪音。然而，尽管背景噪音升高，但双标记探针始终获得明显更高的信噪比和解链峰峰高。使用寡核苷酸靶，单标记探针获得的发射升高在20％至92％之间。然而，已证明双标记探针的荧光升高在71％至199％之间。150nM的FVG11探针与互补寡核苷酸FVG(SEQ ID NO24)的杂交导致了比150nM的FVG1探针的杂交高大约2倍的背景荧光(在90℃)(图8)。然而，LightCycler软件的背景矫正功能证明双标记峰比具有寡核苷酸靶的等价单标记探针峰高大约5倍(图3和8)。从杂合因子V载体DNA样品得到的背景矫正数据说明双标记探针得到2个解链峰，每一个大约是靶扩增分析中单标记探针产生的峰的峰高的3倍(图9)。
邻侧为鸟嘌呤核苷酸的荧光团 考虑到鸟嘌呤碱基是荧光的有效淬灭剂，可预期当探针处在解聚状态时，邻侧为G的荧光团可有效地被淬灭，而当探针杂交时，荧光发射可显著升高。所有包含邻近G(5’、3’或两个位置)的内部荧光团的探针显示出在靶杂交时的信号增强(表2)。C9*2C(SEQ ID NO55)、136A(SEQ IDNO83)和HYBA1928C(SEQ ID NO112)寡核苷酸探针是在2个G核苷酸中间具有荧光标记的探针的优秀实例。C9*2C的信噪比可与2D64C*探针(SEQID NO51)相比，后者的荧光团只邻近1个G但通常高富含G。富含A/T的DdeFL1*4探针(SEQ ID NO6)也表现出相似的信噪比，并具有邻近荧光团的单个G核苷酸。在邻近G残基放置荧光团尽管不是必须的，但更可能产生高的峰高和信噪比。在探针内的合适位置缺少G残基不是问题，因为当荧光团被置于全序列环境下时，探针获得有效的杂交信号。尽管该实例显示了单标记寡核苷酸，以及本发明的寡核苷酸，但其证明不依赖靶序列而非荧光团间的相互作用，产生了靶杂交时不依赖于序列的荧光增强。
邻侧为胞嘧啶核苷酸的荧光团 如果靶序列中的鸟嘌呤具有引起荧光淬灭的能力，可预期邻侧为C残基的荧光团的发射可在靶杂交时降低。然而，所有具有邻近C残基的荧光团的寡核苷酸探针，例如HYBNG(SEQ ID NO58)、171R(SEQ ID NO85)、C19mlA(SEQ ID NO39)、SCT1(SEQ ID NO26)和SP2(SEQ ID NO80)都在探针杂交时，显示出荧光增强。即使是高富含C的寡核苷酸探针，如HEPB(SEQ ID NO45)和FVG2(5′GTATFCCTCGCCTGTCCAG(SEQ ID NO87))当与靶杂交时，比单链状态发射更高水平的荧光。犹如在分子建模中预测的那样，探针杂交时的荧光增强似乎不受鸟嘌呤核苷酸在靶序列中的存在的影响，这说明荧光团不与双链DNA相互作用。
邻侧为腺嘌呤和胸腺嘧啶核苷酸的荧光团 具有A和T残基之间的荧光团的寡核苷酸探针也在靶杂交时，表现出荧光发射的增强。NAT2*6(SEQ ID NO88)、HYBNAT3S(SEQ ID NO16)和FVG1(SEQ ID NO21)探针是荧光标记碱基与A和T核苷酸邻近的探针的良好实例。与单链状态相比，尽管在探针和靶序列上完全缺少G核苷酸，但人工构建的PolyT探针(5′TTTTTTTTTTTFTTTTTTTTTTT(SEQ IDNO37))当与靶序列杂交时，显示出升高水平的荧光发射。这些寡核苷酸包含单个荧光团，从而不是本发明的寡核苷酸。然而，它们显示出探针荧光性质的序列独立性。
荧光团结合的信号强度和序列环境 表2中的数据证明了探针功能性不依赖于鸟嘌呤残基在探针或靶序列中的存在。然而，可能存在高信噪比和G存在于探针紧邻荧光团位置之间的可能相关性。对单标记探针，许多高信噪比来自邻侧为鸟嘌呤碱基的探针。然而，最大的单标记信噪比来自具有邻侧为A和C核苷酸的荧光团的寡核苷酸(SEQ ID NO85)。
含邻侧为A、C和T碱基的荧光团的探针比含有直接邻近荧光团标记碱基的G核苷酸的探针获得更高的信号。而且，所有的单、双和多标记寡核苷酸探针，无论内荧光团邻侧的序列如何，在靶杂交时都表现出增强水平的荧光发射。因此，尽管可通过将荧光团标记的核苷酸置于鸟嘌呤残基附近而获得更高的解链峰，但不需要G残基在探针序列的特定位置就可获得高的解链峰。尽管这些寡核苷酸包含单个荧光团，但它们证明序列独立，且有助于特定序列的最佳间隔。
靶序列的独立性 LightCycler解链曲线分析有力地表明靶的序列很少或不影响寡核苷酸探针的功能。如果在杂交时，寡核苷酸探针的荧光团突出到溶液内，以致它们不会与双链DNA相互作用，那么荧光团可置于探针的高富含C区域内而不被靶的G核苷酸所淬灭。至今设计的所有单和双标记寡核苷酸探针，无论探针序列和邻侧荧光团标记的碱基的核苷酸如何，在杂交时相对单链状态显示出增强水平的荧光。
表2-150nM寡核苷酸探针与完全互补寡核苷酸杂交获得的信噪比。提供了探针和靶的序列标识号。信噪比从最低到最高排序。使用单LightCycler仪器(LC2)产生所有的解链曲线。


UV-可见光吸收和荧光光谱的测量(Marks et al(2005))证明有大约4nm的蓝移和寡核苷酸探针与互补靶序列杂交强度的升高。游离FAMCAP染料的荧光特性更类似于探针/靶双链的特性。将FAMCAP引入DNA探针构建体导致λmax的激发和发射的红移。红移表明荧光团与ssDNA之间的可能相互作用，其包括染料和DNA碱基之间的π-π堆积相互作用。Marks等的结果也说明荧光团不通过插入或凹槽结合与双链DNA相互作用，因为这些相互作用可引起杂交时的强烈红移。因此，荧光团和单链探针DNA的碱基之间存在相互作用，而引起荧光淬灭。荧光团和探针DNA之间的这种相互作用在靶杂交时被去除，从而染料突出入溶液，荧光增强。此荧光增强的机制不发生在末端标记的探针上，因为碱基堆积只发生在荧光团的一侧。数据显示寡核苷酸探针的荧光升高是去除淬灭造成的，而不是荧光增强造成的。该探针功能性模型也支持我们如下观点探针信号不依赖于靶序列，从而荧光团甚至位于富含C的区域内，仍在靶杂交时表现出增强水平的荧光。
实施例7峰高 也测量单、双和三标记探针的峰高来研究探针序列、荧光团位置和多荧光团的影响。对于探针比较，峰高的测量与信噪比相比，因为操作间和仪器间的差异而可靠性略低。然而，可使用单LightCycler实验中产生的解链峰来可靠地比较探针序列。通常在TaKaRa缓冲液中，将150nM探针与150nM完全互补的寡核苷酸杂交。使用LightCycler解链曲线方案来进行荧光测量，其包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的变化速度缓慢加热到95℃。只使用LightCycler软件3.5版得到的解链峰数据包括在表3中。LightCycler软件的3.01版需要用户手动设定荧光增益。然而，3.5版的软件自动确定相对与显示高水平发射的样品的荧光水平。
当-dF/dT针对x轴上的温度绘制在y轴上时，无论探针和靶序列以及寡核苷酸内部的G位置如何，所有本发明的寡核苷酸都表现出正的解链峰。因子V探针序列上，位于A和T碱基(FVG1)之间以及C和G碱基(FVG1ALT)之间的单荧光团的放置获得大约相等高度的解链峰。双标记的因子V探针(FVG11)获得的解链峰的高度大约是2个单标记探针FVG1和FVG1ALT所产生的解链峰的4倍(表3)。单标记峰高的总和比双标记探针表现出的峰高低。而且，在单个反应容器内使用75nM或150nM的两种单标记探针产生的解链峰也比双标记寡核苷酸探针所产生的解链峰低。荧光团标记碱基间的相互作用引起增强的信噪比和解链峰高度，使得双标记探针比2个单标记探针的总和要高。进一步增强的信号来源于三标记探针(如下)。探针中荧光团的位置和分隔程度影响到靶杂交和解聚时的荧光变化级数。与未标记的寡核苷酸相比，单标记探针具有降低的Tm；与等价的单标记探针相比，双标记探针一直表现出降低的Tm(表1)。因为认为荧光团在靶杂交时突出入溶液，从而不与双链DNA相互作用，所以认为荧光团稳定了单链探针类型，而使双链不稳定。认为多标记探针稳定单链探针结构，多于等价的单标记寡核苷酸探针。因为稳定和有效淬灭的单链结构，双和多标记探针经常比预计的表现出低水平的荧光噪音(表5)。与等价的单标记寡核苷酸相比，双和多标记探针所具有的降低的背景和升高的信号产生了更高的峰高和信噪比。
实施例8内部和末端标记探针的比较 使用引物FVF1(5′GACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAG SEQ IDNO92))和FVR3(5′CCATTATTTAGCCAGGAGAC(SEQ ID NO93))扩增因子V靶序列。分析使用3阶段的LightCycle方案，其组成为起始变性(95℃1min)，随后是50个循环的PCR，PCR包括变性(95℃ 0s)、引物退火(55℃10s)和产物延伸(72℃ 10s)。通过加入FV3(5′CTGTATTCCTCGCCTGTCCF(SEQ ID NO94))或FV5(5′FCTGTATTCCTCGCCTGTCC(SEQ ID NO95))末端标记的探针，以及包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.1℃/s的变化速度缓慢加热到95℃的解链曲线分析来检测和表征所扩增的靶。3’标记的FV3探针是完全无功能的，在解链曲线分析中得不到任何峰。对探针发射光谱的测量证实了有效的寡核苷酸合成和荧光团结合。具有5’-FAM结合的FV5探针在靶杂交时表现出荧光发射降低。FV5探针在-dF/dT绘图中产生了倒置的解链峰(图10)，从而可以鉴定纯合和杂合样品。从5’标记探针得到的倒置解链峰具有与从单标记FVG1因子V探针得到的峰高相似的级数(图10)。
5′CTGTATTCCTCGCCTGTCC3′ (因子V探针序列；SEQ ID No140) 3′ATGGACATAAGGAGCGGACAGGTCC5′(靶序列；SEQ ID No141) 5’标记探针将荧光团置于与G残基邻近的位置，即在杂交时相对于靶序列的0和+1位置，这解释了在荧光发射中所观察到的降低。3’标记探针也将荧光团置于与G残基邻近的0和-1位置，但在杂交时荧光既不被增强也不被淬灭。
表3150nM寡核苷酸探针与完全互补寡核苷酸杂交而获得的解链峰峰高。提供了探针和靶的序列标识号。峰高从最低到最高排列。当荧光对温度的负导数(-dF/dT)针对温度分别绘制在y和x轴上时，所有的峰都是正的。使用单LightCycler仪器(LC2)产生所有的解链峰以避免仪器间的多变性。


结合到本发明寡核苷酸的内部残基上的荧光团在单链状态时被淬灭，杂交释放了该淬灭的一部分。当DNA碱基不形成碱基对时，DNA碱基可堆积在荧光团上，从而发生单链探针的淬灭。在单链形式时，荧光团被夹在2个DNA碱基之间，形成相当稳定的疏水结构。因为碱基必须参与碱基配对，所以在双链构型中该结构会被破坏。尽管鸟嘌呤可能比其他碱基作用更大，但该现象不能单单被称为“鸟嘌呤淬灭”。
因为碱基堆积只能发生在荧光团的一侧，所以末端标记的位置不同。在单链(和双链)状态下，荧光团未夹在DNA碱基之间，而只是堆积在碱基上。如果在靶链中，荧光团邻近鸟嘌呤碱基，则会发生杂交时的淬灭。相反地，如果荧光团结合到探针的末端G残基上，则会发生杂交时的荧光增强。寡核苷酸探针的内部标记受探针和靶序列影响相当小，并且无论双链中鸟嘌呤的位置如何，总是表现出杂交时的荧光升高。末端标记的探针受靶序列中的寡核苷酸的影响，并在靶杂交时表现出升高的或降低的荧光水平。因为不依赖于靶序列而非荧光团间的相互作用，所以本发明的双标记寡核苷酸表现出杂交时升高的荧光水平。
实施例9多标记探针中的信号强度和荧光团间隔 可预期将附加的荧光团包含入寡核苷酸探针序列会在杂交(信号)和单链(噪音)状态时，增强探针发射，从而维持了信噪比。或者，因为FAM染料在邻近时，事实上彼此淬灭，所以使用多个荧光团标记探针可引起信噪比降低。然而，通过在寡核苷酸探针序列中包含2个或更多个FAM染料，可以显著地改善探针信噪比和解链峰峰高。所有以上描述的探针使用C6FAM dU或Glen荧光素dT来取代胸腺嘧啶核苷酸，并且这些探针中的荧光团通过至少3个核苷酸分隔。本发明寡核苷酸中附加荧光团的包含(例如3或4个FAM标记)可进一步增强信噪比和解链峰峰高。然而，荧光团标记碱基应被最少数量的核苷酸分隔从而避免由于非放射性能量传递造成的荧光团之间的直接淬灭。此非FRET淬灭可通过染料间的短程“接触”而发生，并且不需要激发和发射光谱的重叠。FRET淬灭也可因激发和发生光谱之间的重叠而发生在FAM标记之间。设计本发明寡核苷酸探针时，优选的间隔是3-6个。然而，其荧光团被至少2个未标记核苷酸分隔的所有探针表现出靶杂交时的荧光显著升高。没有测试大于11个核苷酸的间隔，但其依赖于它们在双链中的相对角度位置而可以获得有效的信号(见表7)。
在TaKaRa缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的HYBCHRC(SEQ ID NO35)反向纯合寡核苷酸与150nM单标记(HYBCH2)、双标记(HYBCH)、三标记(HYBCH3)和四标记(HYBCH4)衣原体探针杂交。
HYBCH2 5′CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO32) HYBCH 5′CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO61) HYBCH3 5′CAAGCCFGCAAAFGFATACCAAG(SEQ ID NO96) HYBCH4 5′CAAGCCFGCAAAFGFAFACCAAG(SEQ ID NO97) 使用包括变性(95℃ 5s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的缓慢加热到95℃的LightCycler方案来产生解链峰。与单标记探针相比，双标记的HYBCH寡核苷酸探针显示出提高的信噪比和解链峰峰高，以及如上所述的降低的Tm。HYBCH的荧光团标记碱基被5个核苷酸所分隔。三标记HYBCH3探针在靶杂交时，被轻微淬灭，并在-dF/dT线中表现出小的负/倒置的峰(图11)。与单标记探针相比，HYBCH3的Tm被降低，但比双标记寡核苷酸探针的Tm高。四标记HYBCH4探针在-dF/dT线中表现出小的正峰，并且Tm与HYBCH相似。HYBCH3和HYBCH4探针都包含只被单个核苷酸分隔的荧光团标记的碱基，并在杂交和解聚状态时显示出显著降低的荧光水平(图11)。荧光数据表明邻近的FAM染料在单链状态时，彼此淬灭。HYBCH3探针在与互补靶序列杂交时，淬灭程度更高，说明当荧光团突出入溶液时，它们比在单链构型时更接近。
设计另外的三标记衣原体探针，其在荧光团标记的碱基之间具有更高水平的分隔。在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的HYBCH6RC(SEQ ID NO103)反向纯合寡核苷酸与150nM的单标记(HYBCH2)、双标记(HYBCH)和三标记(HYBCH5和HYBCH6)探针杂交。使用包括变性(95℃ 5s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s缓慢加热到95℃的LightCycler方案来产生解链峰。
HYBCH2 5′CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO32) HYBCH 5′CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO61) HYBCH5 5′CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG(SEQ ID NO102) HYBCH6 5′GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG (SEQ IDNO104) 三标记的HYBCH5探针表现出与HYBCH双标记探针的Tm相似的Tm(表1)。添加大于2个荧光标记不会提供进一步的单链结构稳定性。三标记的HYBCH6探针比之前提到的衣原体探针长5个核苷酸，并显示出与单标记HYCH2探针相似的Tm。两个三标记探针都得到分别是单标记HYBCH2和双标记HYBCh探针6.5和3.25倍的解链峰(图4和11C)。
为研究每一个荧光团对总信号强度的贡献，将三标记HYBCH5探针与3个可能的单标记衣原体探针以及3个双标记的寡核苷酸探针进行比较。三标记寡核苷酸探针中的每一个修饰位置都在单和双标记探针中有体现。这些探针也与四标记的寡核苷酸探针(SEQ ID NO126)相比。如以上所描述的，在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的HYBCH6RC(SEQ ID NO103)反向纯合寡核苷酸与150nM的探针杂交。
HYBCH2 5′CAAGCCTGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO32) HYBCH7 5′CAAGCCFGCAAATGTATACCAAG(SEQ ID NO105) HYBCH8 5′CAAGCCTGCAAATGTAFACCAAG(SEQ ID NO106) HYBCH 5′CAAGCCFGCAAAFGTATACCAAG(SEQ ID NO61) HYBCH9 5′CAAGCCTGCAAAFGTAFACCAAG(SEQ ID NO107) HYBCH10 5′CAAGCCFGCAAATGTAFACCAAG(SEQ ID NO108) HYBCH5 5′CAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG(SEQ ID NO102) HYBCH11 5′GTAAFCAAGCCFGCAAAFGTAFACCAAG(SEQ IDNO126) 在2个LightCycler仪器(LC1和LC2)中产生的解链峰的峰高显示出比计算的信噪比更高水平的变化(表4)。然而，使用2个LightCycler仪器，三标记探针的峰高是最有效双标记探针峰高的大约2倍，并且是最有效单标记寡核苷酸探针的4倍以上(表4)。三标记探针的解链峰峰高比3个单标记寡核苷酸探针的总和高，也比任何双标记探针加任何等价的单标记寡核苷酸探针的总和高。四标记寡核苷酸探针也得到高质量的解链数据，显示出的峰高比三标记探针高大约25％(表4)。
表4使用2个LightCycler仪器(LC1和LC2)，从单、双和三标记衣原体探针产生的峰高和信噪比。每一个解链峰和曲线进行2次分析，显示平均值。

也研究了35℃，存在和不存在靶时，单、双和三标记衣原体探针与在杂交和单链状态时的荧光发射水平的比较。在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的HYBCH6RC(SEQ ID NO103)反向纯合寡核苷酸与150nM的探针杂交。样品在LightCycler毛细管(95℃ 5s)变性，再伴随连续的荧光获取冷却到35℃。在存在和不存在靶时，分析探针2次，在表5中详细显示了杂交和单链状态的平均发射数值。不存在靶时，三标记寡核苷酸探针比任何单和双标记探针发射更少的荧光。然而，存在靶时，三标记探针发射的荧光水平与双标记HYBCH10探针发射的荧光水平相似。三标记探针表现出双和单链状态间的最大差异，从而得到最大的解链峰。例如在单链探针结构中的淬灭的荧光团间相互作用可能负责双和三标记寡核苷酸探针的升高的峰高和信噪比。在单链(随机螺旋)中，荧光团可互相接触并堆积，从而产生了碰撞淬灭，而由于荧光团在被至少2个核苷酸分隔时，被紧密的B-DNA结构分隔开，所以可能不存在于双链中。如果它们很接近，胸腺嘧啶碱基的5-位置的柔性接头会使荧光团彼此接近。
表5在35℃，存在和不存在互补寡核苷酸时，发射(LightCycler矫正荧光单位)的水平。也包括杂交和单链状态之间的差异。

实施例10单、双和三标记寡核苷酸的进一步比较 将3个单标记因子V寡核苷酸探针与同一个序列的双和三标记探针比较。在双和三标记寡核苷酸探针中出现的所有荧光团都在单标记探针中有代表。在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的FVG(SEQ ID NO24)反向纯合寡核苷酸与150nM的寡核苷酸探针杂交。使用包括变性(95℃ 5s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s缓慢加热到95℃的LightCycler方案来产生解链峰。单、双和三标记探针的峰高和信噪比列于表6中。
FVG1 5′CTGTAFTCCTCGCCTGTCC (SEQ ID NO21) FVG1ALT 5′CTGTATTCCTCGCCFGTCC (SEQ ID NO101) FVG1ALT2 5′CTGTATTCCFCGCCTGTCC (SEQ ID NO128) FVG115′CTGTAFTCCTCGCCFGTCC (SEQ ID NO60) FVG111 5′CTGTAFTCCFCGCCFGTCC (SEQ ID NO127) 双标记FVG11探针得到解链峰比在序列内的相同位置具有荧光团的单标记寡核苷酸探针高大约3-4倍。这样，双标记解链峰比单标记峰的总和高。而且，三标记寡核苷酸探针产生的解链峰比单标记寡核苷酸探针至少高7倍，比双标记探针至少高2.6倍(图12)。三标记探针的解链峰比单标记寡核苷酸得到的峰的总和明显高。在衣原体寡核苷酸中，向探针中添加多个荧光团引起高度大于单标记寡核苷酸探针所预期的解链峰。从衣原体和因子V探针得到的数据说明包含2个或3个荧光团标记的碱基不一定使寡核苷酸探针解链峰的峰高成为双倍或三倍。
表6在单个LightCycler实验(LC2)中，单、双和三标记因子V探针产生的峰高和信噪比。每一个解链峰和曲线分析2次，显示平均值。

实施例11荧光团间的最小间隔 合成一系列寡核苷酸探针以确定双标记寡核苷酸探针中荧光团标记的碱基之间需要的最小间隔。探针在荧光团标记的碱基间具有0至9个核苷酸。在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的MODRC(5′CCCCCCTTTTTTTTTTTTTCCCCCC(SEQ ID NO139))反向纯合寡核苷酸与150nM的寡核苷酸探针杂交。使用包括变性(95℃ 5s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的缓慢加热到95℃的LightCycler方案来产生解链峰。解链峰的信噪比和峰高见表7。在标记碱基之间具有0和1个核酸的探针显示出显著降低的荧光水平，这是因为荧光团的邻近造成的接触淬灭。两种探针都表现出负的(倒置)解链峰，其中当与靶序列杂交时，荧光水平相对单链状态降低了。所有具有2至9个分隔荧光团标记的碱基的探针表现出负的解链峰，以及靶杂交时的荧光增强。具有被7和8个核苷酸分隔的荧光团的探针表现出荧光水平的轻微降低，以及与2-6和9间隔的探针相比更小的解链峰。在双链DNA的相同表面具有多个荧光团的探针可遭遇一定水平的接触淬灭，从而显示出降低的峰高和信噪比。这些角度位置的影响可以是序列特异的，因为在FVG11(SEQ ID NO60)、HYBMRSA(SEQ ID NO99)和HYBA1928C(SEQ ID NO112)探针中使用了8个核苷酸间隔，产生了高的解链峰和信噪比。寡核苷酸探针至少需要2个分隔荧光团标记碱基的核苷酸，以得到在靶杂交时相对自由探针更高水平的荧光发射。
表7在单个LightCycler实验(LC2)中产生的解链峰以确定荧光团标记的碱基之间需要的最小间隔。每一个解链峰分析2次，显示平均值。

至今所设计的所有双、三和四标记寡核苷酸探针，其具有2至11个核苷酸间隔的荧光团标记的碱基，都显示出在与互补靶序列杂交时显著的荧光增强。只发现具有0或1个核苷酸间隔的荧光团标记碱基的探针在靶杂交时，表现出低水平的荧光淬灭。还未鉴定荧光团标记核苷酸的最大间隔。
实施例12荧光团结合至dA和dC 使用氨基-dA和氨基-dC单体(Glen Research，Sterling，VA)合成FAM dA和FAM dC寡核苷酸探针，并使用FAM进行合成后标记。合成包含FAM dC和FAM dA的单和双标记探针并与单和双标记的C6 FAM dU寡核苷酸探针比较(表8)。在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将150nM的适当的反向纯合寡核苷酸(FVG或GLENARC)与150nM的寡核苷酸探针杂交。使用包括变性(95℃ 5s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s缓慢加热到95℃的LightCycler方案来产生解链峰。
FVG 5′GGACAGGCGAGGAATACAG(SEQ ID NO24) GLENARC 5′CTGTATACCTTGCCTGTCC(SEQ ID NO91) FAM dC和FAM dA探针在靶杂交时，都表现出相对单链状态的增强水平的荧光(图13)。FAM dC杂交时产生的荧光发射增强支持以下模型，即寡核苷酸探针的荧光团不与靶链的DNA相互作用，因为预期与靶中的G的相互作用引起荧光淬灭。对于C6 FAM dU和荧光素dT，双标记的FAMdC和FAM dA探针得到的解链峰都比等价单标记寡核苷酸探针的峰高2倍以上。
双标记C6 FAM dU和荧光素dT探针表现出的Tm比相同序列的单标记探针低大约4-5℃。用FAM dC和FAM dA标记的探针分别表现出1℃和8.3℃的Tm差异(表8)。
表8从包含C6 FAM dU、FAM dC和FAM dA标记的寡核苷酸探针得到的峰高和信噪比。


对于A、T、C和U，荧光团在合成前、中或后与核苷酸结合都无关紧要。在保持“天然”碱基的同时结合这些核苷酸是可能的。将荧光团直接结合到G上产生了碱基类似物。
实施例13增强解链峰峰高的非对称PCR 分析使用本发明的寡核苷酸，在其PCR阶段后，探针与扩增产物竞争与靶序列的杂交。这种竞争降低了探针/靶相互作用的可能性，限制了解链峰的峰高。如果靶杂交根据有利于探针而变化，则可以提高解链峰的峰高。可通过增加探针的浓度或降低PCR竞争链的丰度来完成。
已经发现寡核苷酸探针的最佳浓度是150nM。将探针浓度升高到大于200nM时并没有发现会提高信噪比。事实上，升高的探针浓度不利于衣原体解链线(melt trace)，在80℃时产生第二峰，其随探针浓度升高。在升高的探针浓度下，也发现峰的质量降低，这是因为不能与靶序列杂交的单链探针产生了附加的背景荧光。
通过使用非对称扩增方法可以降低竞争性DNA链相对靶序列的丰度。优选衣原体正向和反向引物的浓度以使解链峰峰高最大化。使用引物CHF3-1(SEQ ID NO33)和CHR4-1(SEQ ID NO34)扩增衣原体隐蔽质粒靶。分析使用3阶段的LightCycle方案，其组成为起始变性(95℃ 1min)，随后是50个循环的PCR，PCR包括变性(95℃ 5s)、引物退火(55℃ 10s)和产物延伸(72℃ 10s)。通过加入HYBCH探针(SEQ ID NO61)，以及包括变性(95℃0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的变化速度缓慢加热到95℃的解链曲线分析来检测和表征所扩增的靶。存在衣原体DNA时，HYBCH探针产生Tm大约为56℃的清晰解链峰(图14)。发现将正向引物(0.05μM)相对反向引物(0.05μM)进行10倍稀释，与标准等摩尔分析相比，可提高衣原体峰的峰高3-5倍(图14)。在纯化的基因组DNA和处理过的临床样品中观察到这样升高的峰高。非对称PCR与三标记的标记探针(HYBCH6)的组合产生的解链峰是使用单标记寡核苷酸探针的对称分析产生的解链峰的大约20倍。
实施例14非对称PCR、探针浓度和峰高 非对称PCR在衣原体、淋病、因子II、A1928℃和C677T中得到相比对称扩增来说升高的峰高。然而，非对称扩增在NAT2*5C测试中未能增强峰高。因为非对称PCR产生了单链靶，所以探针不需要与互补PCR链竞争杂交，解链峰有可能具有与寡核苷酸得到的解链峰相似的级数。如果非对称扩增得到的解链峰已经与寡核苷酸峰(例如NAT2*5C分析)具有相似的级数，那么非对称扩增没有任何益处。似乎只有与寡核苷酸相比显示出降低的峰高的那些探针在将分析转换为非对称测试时，表现出增强的峰高。如果分析使用长的靶扩增子或产生了引物二聚体，那么非对称PCR是有益的。
因子V探针(FVG1和FVG11)是更复杂的情况。在对称分析中产生的解链峰具有合理的峰高，可以可靠地鉴定样品，但与从寡核苷酸靶得到的峰相比，该解链峰被降低了。发现使用杂合样品的50个循环的非对称扩增不影响匹配或错配峰相对对称分析的峰高。然而，发现60和70个循环的非对称扩增升高了匹配解链峰而降低/不影响错配峰的峰高(图14)。在70个循环以后，探针被靶所饱和，这样对完全互补等位基因的优先杂交导致了峰高的不平衡。完全互补探针/靶双链的稳定性升高产生了此种优先的杂交并升高了相对于错配双链的峰高。
将FVG11探针(SEQ ID NO60)与完全互补的(FVG(SEQ ID NO24))和错配的(FVA(SEQ ID NO25))寡核苷酸杂交以研究靶浓度对解链峰峰高的影响。使用包括变性(95℃ 0s)、冷却(35℃ 30s)和以0.2℃/s的转化速率缓慢加热到95℃的热方案的LightCycler设备中进行解链分析。以等摩尔浓度使用匹配和错配靶。150nM探针与150nM的靶杂交获得相同峰高的匹配和错配解链峰(图15)。300nM探针与300nM靶杂交也获得相当峰高的匹配和错配峰。然而，150nM探针与1μM靶杂交只获得匹配的解链峰(图15)。完全互补的靶隔离了探针，竞争性的杂交阻止对错配靶的有效杂交。因子VSNP显著影响探针/靶双链的稳定性，这样在高靶浓度时，探针优先结合到完全互补序列上。此观察也解释了如在镰刀细胞和NAT1*10分析中的完全互补和双错配靶之间的峰高不平衡。
为查明探针的更高浓度是否在靶浓度提高时，重建了匹配和错配峰的峰高间的平衡，使用150nM、300nM和500nM的FVG11探针和杂合因子V基因组DNA样品进行了对称和非对称分析。进行了50、60和70个循环的2阶段扩增。在50个循环后，匹配和错配峰的峰高是平衡的，对称和非对称反应之间没有显著差异(图16)。150nM探针的反应获得最高品质的数据。使用150nM探针，在60和70个非对称循环后产生的匹配和错配解链峰的峰高如图14显示的那样是不相等的。在更高的探针浓度下，错配解链峰的峰高被显著提高。在60个非对称循环后，150nM的FVG11获得分别为0.83和0.35的匹配和错配解链峰(2.3倍的差异)。而500nM探针获得分别为0.63和0.50的匹配和错配解链峰(1.13倍的差异)。在150nM和500nM探针的反应中，杂合峰的组合峰高分别为1.19和1.13，这与在杂合寡核苷酸靶中观察到的相似(图3)。升高的探针浓度平衡了在非对称扩增产物中产生的匹配和错配解链峰的峰高。寡核苷酸和PCR数据证实了探针对匹配和错配靶分子的竞争性杂交。在高靶浓度下，这种竞争性杂交和错配双链降低的稳定性导致多靶解链谱中峰的减少或丧失。在特定的非对称分析中，需要高于150nM的探针浓度。
实施例15通过解链温度的多重分析 在单个LightCycler毛细管中同时将4个寡核苷酸探针与其互补寡核苷酸靶杂交以显示解链峰分析的多能性。在多种浓度下使用探针和靶来使从单标记和双标记探针得到的峰高相等。分别在1.2μM、233nM、183nM和27nM使用polyT、HYBINF、HYBCH2和HYBAdC探针和靶寡核苷酸。在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，使用包括变性(95℃ 5s)、冷却(35℃ 30s)和以0.4℃/s缓慢加热到95℃的LightCycler方案来产生解链峰。polyT、HYBINF、HYBCH2和HYBAdC探针产生了Tm分别大约为49℃、54℃、62℃和68℃的清晰解链峰(图17)。使用允许同时分析2个双等位基因SNP的寡核苷酸探针，基于Tm检测和鉴定出至少4个靶序列。使用光谱不同的荧光染料可进一步增强多能性。
实施例16阳性扩增对照 可使用本发明的寡核苷酸来确定临床样品中是否有感染病原体。特定解链峰的产生显示了样品中特定感染物的存在。然而，完全缺少解链峰不能可靠地预示缺少病原体。如尿等临床样品可包含高水平的PCR抑制剂，其阻止在阳性样品中的病原体检测。需要扩增对照来区分不存在病原体导致的阴性反应和由于PCR抑制而不能产生解链峰而导致的阴性反应。
使用142个碱基的寡核苷酸(SEQ ID NO98)来构建衣原体扩增对照(模拟)。使用长的寡核苷酸作为用于克隆目的的PCR模板，其在探针区域包含C对T的取代以使模拟物与衣原体靶存在Tm差异。使用CHF3-1(SEQ IDNO33)和CHR4-1(SEQ ID NO34)引物进行从长的寡核苷酸的扩增。使用PCR cloningplus试剂盒(Qiagen Ltd，Crawley，UK)将扩增产物连接到pDrive载体上，并转化到Qiagen EZ感受态细胞中。通过使用本发明寡核苷酸探针的衣原体分析，直接鉴定出包含模拟序列的菌落。使用QIAprep SpinMiniprep试剂盒(Qiagen Ltd，Crawley，UK)并遵循操作手册推荐的程序从转化的培养物中纯化质粒。本发明的衣原体寡核苷酸与模拟靶序列的杂交产生了C:A错配，其降低了探针Tm约8℃(图18)。
实施例17使用本发明的寡核苷酸探针的DNA定量 使用引物FVF1.3(SEQ ID NO22)和FVR3.5(SEQ ID NO23)从一系列DNA标准品中扩增因子V靶。DNA标准品包含100ng/μl、10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl和10pg/μl的人基因组DNA。分析使用3阶段的LightCycle方案，其组成为起始变性(95℃ 1min)，随后是50个循环的PCR，PCR包括变性(95℃ 0s)、退火(50℃ 10s)和延伸(72℃ 10s)阶段。通过加入FVG1(SEQ IDNO21)或FVG11(SEQ ID NO60)以及在PCR退火阶段的荧光获取来检测和表征扩增靶。测量荧光发射升高到阈值水平(CT)之上的循环数从而可以对DNA靶进行定量(图19)。在实时PCR分析中得到的CT值与靶序列的起始拷贝数成正比，并可用于构建标准曲线，“未知”样品可以此定量。发现唾液样品通常包含大约1ng/ul的人基因组DNA。
实施例18使用荧光团而不是荧光素的分析 合成4个因子V寡核苷酸探针，每一个在2个内部位置用荧光团标记。这些探针是 FVG11TAM 5 CTGTAXTCCTCGCCXGTCC(SEQ ID NO140)，其中X是用TAMRA标记的dT残基。
FVG11ROX 5 CTGTAXTCCTCGCCXGTCC(SEQ ID NO141)，其中X是用ROX标记的dT残基。
FVG11Cy5 5 CTGTAXTCCTCGCCXGTCC(SEQ ID NO142)，其中X是用Cy5标记的dT残基。
FVG11Mix 5 CTGTAFTCCTCGCCXGTCC(SEQ ID NO143)，其中F是用FAM标记的dT残基，X是用ROX标记的dT残基。
在96孔光学平板中，在TaKaRa PCR缓冲液和总共3mM的MgCl2中，将探针与其互补寡核苷酸靶(SEQ ID NO24)杂交，并使用ABI 7700热循环仪产生解链曲线。解链方案包括变性(95℃ 30s)、冷却(35℃ 30s)和解链谱，解链谱包括从35℃到95℃的阶梯递增，其递增幅度为1℃并在每一温度停留15s。以150nM的浓度使用探针和互补物。从ABI 7700热循环仪输出原始数据，并使用微软的Excel电子表格程序处理。图20A、20B、20C和20D显示了这些探针从其互补物的解链曲线，并在所有实例中都见到曲线的拐点，说明尽管光学系统对于Cy5的检测不是最佳的，但荧光的降低作为探针从其靶上解聚的直接结果，而相比之下荧光的线性降低作为温度的功能。此数据证实了之前的数据和结论该现象是荧光团的一般性质，不局限于荧光素和其他基于荧光素的衍生物。
结论 具有单或多个荧光团标记的内部碱基的寡核苷酸探针与单链状态相比，在杂交时都表现出升高水平的荧光发射。因为无论寡核苷酸探针和靶序列如何，探针荧光在杂交时总是升高，所以认为荧光团在单链状态时，与探针DNA相互作用，导致淬灭，但在双链状态时，不与探针或靶序列相互作用，从而荧光团去淬灭并且荧光升高。认为杂交的探针所发射的升高水平的荧光来自荧光团突出入溶液，远离了DNA的淬灭影响。
从单标记寡核苷酸探针与相同序列的双和三标记探针的比较中得到的意外发现是在包括附加荧光团时，荧光没有简单的成为双倍或三倍。双和三标记探针表现出的解链峰比每一个单标记寡核苷酸探针所预期的都高，说明荧光团间存在相互作用。寡核苷酸探针中的荧光团优选地被至少2个核苷酸分隔，从而阻止接触淬灭并确保靶检测时有效地产生信号。
表9用于寡核苷酸标记的的通用荧光染料 表10Alexa染料(英杰公司Invitrogen) 表11ATTO染料(ATTO-TEC GmbH) 表12Dyomics染料(Dyomics GmbH) 表13 Dyomics Megastokes染料(Dyomics GmbH)。都可在488nm处被激发。
表14Hilyte染料(Cam bridge Bioscience) 表15低激发波长(UV)荧光团
参考文献
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<213>ORGANISM疟原虫junxanuclease
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<211>LENGTH16
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE52
CTCCCCCAGG ACGCCC
<210>SEQ ID NO 53
<211>LENGTH16
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE53
CTCCCCCAAG ACGCCC
<210>SEQ ID NO 54
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(13)...(13)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE54
CATTGAGGAC TGFGTTCAAG
<210>SEQ ID NO 55
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE55
CTTGAACACA GTCCTCAATG
<210>SEQ ID NO 56
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE56
CTTGAACACG GTCCTCAATG
<210>SEQ ID NO 57
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(13)...(13)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE57
CATTGAGGAC CGFGTTCAAG
<210>SEQ ID NO 58
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM淋病奈瑟菌
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(6)...(6)，(12)...(12)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE58
TCTGCFTCCG CFACGGCTTC
<210>SEQ ID NO 59
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM淋病奈瑟菌
<400>SEQUENCE59
GAAGCCGTAG CGGAAGCAGA
<210>SEQ ID NO 60
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(6)...(6)，(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE60
CTGTAFTCCT CGCCFGTCC
<210>SEQ ID NO 61
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)，(13)...(13)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE61
CAAGCC FGCA AAFGTATACC AAG
<210>SEQ ID NO 62
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM流行性感冒
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE62
ATGGGAAFGG GGAFCCAAAT AA
<210>SEQ ID NO 63
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM流行性感冒
<400>SEQUENCE63
TTATTTGGAT CCCCATTCCC AT
<210>SEQ ID NO 64
<211>LENGTH27
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM肺炎链球菌
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE64
GGGGTCTFCC ACTFGGAGAA AGCTATC
<210>SEQ ID NO 65
<211>LENGTH27
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM肺炎链球菌
<400>SEQUENCE65
GATAGCTTTC TCCAAGTGGA AGACCCC
<210>SEQ ID NO 66
<211>LENGTH26
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM流行性感冒
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(5)...(5)，(11)...(11)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE66
GGGAFCCAAA FAACATGGAC AGAGCT
<210>SEQ ID NO 67
<211>LENGTH26
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM流行性感冒
<400>SEQUENCE67
AGCTCTGTCC ATGTTATTTG GATCCC
<210>SEQ ID NO 68
<211>LENGTH24
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM腺病毒C
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE68
GACGTGGFCC GTGFGCACCA GCCT
<210>SEQ ID NO 69
<211>LENGTH24
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM腺病毒C
<400>SEQUENCE69
AGGCTGGTGC ACACGGACCA CGTC
<210>SEQ ID NO 70
<211>LENGTH24
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM腺病毒D
<400>SEQUENCE70
AGGCTGGTGC ACTCTGACCA CGTC
<210>SEQ ID NO 71
<211>LENGTH24
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM腺病毒D
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE71
GACGTGGFCA GAGFGCACCA GCCT
<210>SEQ ID NO 72
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION合成后用FAM标记Glen氨基dC
<400>SEQUENCE72
CTGTATTFCT CGCFTGTCC
<210>SEQ ID NO 73
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(13)...(13)
<223>OTHER INFORMATION合成后用FAM标记Glen氨基dA
<400>SEQUENCE73
GGACAGGCAA GGFATACAG
<210>SEQ ID NO 74
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM淋病奈瑟菌
<400>SEQUENCE74
ACTTTGGCGA TATTGCTCGG
<210>SEQ ID NO 75
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM淋病奈瑟菌
<400>SEQUENCE75
TACCGAGAAC GAACGCGACA
<210>SEQ ID NO 76
<211>LENGTH29
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM腺病毒
<400>SEQUENCE76
GACATGACTT TCGAGGTCGA TCCCATGGA
<210>SEQ ID NO 77
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM腺病毒
<400>SEQUENCE77
GCCGAGAAGG GCGTGCGCAG GTA
<210>SEQ ID NO 78
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM流行性感冒
<400>SEQUENCE78
GGACTGCAGC GTAGACGCTT
<210>SEQ ID NO 79
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM流行性感冒
<400>SEQUENCE79
ATTTCTTTGG CCCCATGGAA TGT
<210>SEQ ID NO 80
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM肺炎链球菌
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE80
GGGGTCTFCC ACTTGGAGAA AG
<210>SEQ ID NO 81
<211>LENGTH26
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM肺炎链球菌
<400>SEQUENCE81
CTTGCGGTTG ATCGTGCTCC GATGAC
<210>SEQ ID NO 82
<211>LENGTH30
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM肺炎链球菌
<400>SEQUENCE82
CATTATTGAC CTGACCATAA TCTTGATGCC
<210>SEQ ID NO 83
<211>LENGTH18
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM家绵羊
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)
<223>OTHER INFORMATIONC6FAM dU
<400>SEQUENCE83
GGGAAGFGCC ATGAGCAG
<210>SEQ ID NO 84
<211>LENGTH18
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM家绵羊
<400>SEQUENCE84
CTGCTCATGG CACTTCCC
<210>SEQ ID NO 85
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM家绵羊
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)
<223>OTHER INFORMATIONC6 FAM dU
<400>SEQUENCE85
CAGTGGAFCG GTATAGTAAC
<210>SEQ ID NO 86
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM家绵羊
<400>SEQUENCE86
GTTACTATAC CGATCCACTG
<210>SEQ ID NO 87
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(5)...(5)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE87
GTATFCCTCG CCTGTCCAG
<210>SEQ ID NO 88
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6 FAM dU
<400>SEQUENCE88
CTTCAAFTGT TTGAGGTTCA AG
<210>SEQ ID NO 89
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE89
CTTGAACCTC AAACAATTGA AG
<210>SEQ ID NO 90
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(5)...(5)，(13)...(13)
<223>OTHER INFORMATION合成后用FAM标记Glen氨基dA
<400>SEQUENCE90
GGACFGGCAA GGFATACAG
<210>SEQ ID NO 91
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE91
CTGTATACCT TGCCTGTCC
<210>SEQ ID NO 92
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE92
GACTACTTCT AATCTGTAAG AGCAG
<210>SEQ ID NO 93
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE93
CCATTATTTA GCCAGGAGAC
<210>SEQ ID NO 94
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY混杂特性
<222>LOCATION(20)...(20)
<223>OTHER INFORMATION5′FAM dye
<400>SEQUENCE94
CTGTATTCCT CGCCTGTCCF
<210>SEQ ID NO 95
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY混杂特性
<222>LOCATION(1)...(1)
<223>OTHER INFORMATION3′FAM dye
<400>SEQUENCE95
FCTGTATTCC TCGCCTGTCC
<210>SEQ ID NO 96
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)，(13)...(13)，(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE96
CAAGCCFGCA AAFGFATACC AAG
<210>SEQ ID NO 97
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)，(13)...(13)，(15)...(15)，(17)...(17)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE97
CAAGCCFGCA AAFGFAFACC AAG
<210>SEQ ID NO 98
<211>LENGTH142
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人工序列
<400>SEQUENCE98
AATTCCGCAG CTGCTGTAAT CACCCAGTCG ATAAATGTGT AAGCATACTT TGATGCATTT GGTTTATTTC
TTGGTATACA TTTACAGGCT TGATTATTCT ATTTGATCTA CCAAGATAGG ACATGGCTCT ACAACGAACC CG
<210>SEQ ID NO 99
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM金黄色葡萄球菌(MRSA)
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(6)...(6)，(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE99
CGTAGFTACT GCGTFGTAAG ACGTC
<210>SEQ ID NO 100
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM金黄色葡萄球菌(MRSA)
<400>SEQUENCE100
GACGTCTTAC AACGCAGTAA CTACG
<210>SEQ ID NO 101
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE101
CTGTATTCCT CGCCFGTCC
<210>SEQ ID NO 102
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)，(13)...(13)，(17)...(17)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE102
CAAGCCFGCA AAFGTAFACC AAG
<210>SEQ ID NO 103
<211>LENGTH28
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<400>SEQUENCE103
CTTGGTATAC ATTTGCAGGC TTGATTAC
<210>SEQ ID NO 104
<211>LENGTH28
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(5)...(5)，(12)...(12)，(18)...(18)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE104
GTAAFCAAGC CFGCAAAFGT ATACCAAG
<210>SEQ ID NO 105
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE105
CAAGCCFGCA AATGTATACC AAG
<210>SEQ ID NO 106
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(17)...(17)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE106
CAAGCCTGCA AATGTAFACC AAG
<210>SEQ ID NO 107
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(13)...(13)，(17)...(17)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE107
CAAGCCTGCA AAFGTAFACC AAG
<210>SEQ ID NO 108
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)，(17)...(17)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE108
CAAGCCFGCA AATGTAFACC AAG
<210>SEQ ID NO 109
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(4)...(4)，(16)...(16)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE109
GTCFGCGGGA GCCGAFTTCA TC
<210>SEQ ID NO 110
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE110
GATGAAATCG GCTCCCGCAG AC
<210>SEQ ID NO 111
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE111
GATGAAATCG ACTCCCGCAG AC
<210>SEQ ID NO 112
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(7)...(7)，(16)...(16)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE112
GACCAGFGAA GCAAGFGTCT TTG
<210>SEQ ID NO 113
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE113
CAAAGACACT TGCTTCACTG GTC
<210>SEQ ID NO 114
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE114
CAAAGACACT TTCTTCACTG GTC
<210>SEQ ID NO 115
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>EEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(5)...(5)，(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE115
GCATFGAGGC TCGCFGAGAG TC
<210>SEQ ID NO 116
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE116
GACTCTCAGC GAGCCTCAAT GC
<210>SEQ ID NO 117
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE117
GACTCTCAGC AAGCCTCAAT GC
<210>SEQ ID NO 118
<211>LENGTH22
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE118
CTGGGCTC CTGGAACCAA TC
<210>SEQ ID NO 119
<211>LENGTH21
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE119
GCTGCCCATG AATAGCACTG G
<210>SEQ ID NO 120
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE120
CCCAAGGAGG AGCTGCTGAA
<210>SEQ ID NO 121
<211>LENGTH20
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE121
CCATTCCGGT TTGGTTCTCC
<210>SEQ ID NO 122
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE122
CTGACCTGAA GCACTTGAAG GAG
<210>SEQ ID NO 123
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<400>SEQUENCE123
GCGGAAGAAT GTGTCAGCCT CAAAG
<210>SEQ ID NO 124
<211>LENGTH23
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(11)...(11)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸C6FAM dU
<400>SEQUENCE124
GAGAGGAATC FGGTACTTGG ACC
<210>SEQ ID NO 125
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)....(8)
<223>OTHER INFORMATION合成后用FAM标记Glen氨基dC
<400>SEQUENCE125
CTGTATTFCT CGCCTGTCC
<210>SEQ ID NO 126
<211>LENGTH28
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM沙眼衣原体
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(5)...(5)，(12)...(12)，(18)...(18)，(22)...(22)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE126
GTAAFCAAGC CFGCAAAFGT AFACCAAG
<210>SEQ ID NO 127
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(6)...(6)，(10)...(10)，(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE127
CTGTAFTCCF CGCCFGTCC
<210>SEQ ID NO 128
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(10)...(10)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE128
CTGTATTCCF CGCCTGTCC
<210>SEQ ID NO 129
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(12)...(12)，(13)...(13)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE129
GGGGGGTTTT TFFTTTTTTG GGGGG
<210>SEQ ID NO 130
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(12)...(12)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE130
GGGGGGTTTT TFTFTTTTTG GGGGG
<210>SEQ ID NO 131
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(11)...(11)，(14)...(14)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE131
GGGGGGTTTT FTTFTTTTTG GGGGG
<210>SEQ ID NO 132
<211>LENGTH25
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(11)...(11)，(15)...(15)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE132
GGGGGGTTTT FTTTFTTTTG GGGGG
<210>SEQ ID NO 133
<211>LENGTH25
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<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
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<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
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GGGGGGTTTF TTTTFTTTTG GGGGG
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<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(10)...(10)，(16)...(16)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
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GGGGGGTTTF TTTTTFTTTG GGGGG
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<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(9)...(9)，(16)...(16)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE135
GGGGGGTTFT TTTTTFTTTG GGGGG
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<213>ORGANISM人工序列
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(9)...(9)，(17)...(17)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
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GGGGGGTTFT TTTTTTFTTG GGGGG
<210>SEQ ID NO 137
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<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
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GGGGGGTFTT TTTTTTFTTG GGGGG
<210>SEQ ID NO 138
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<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(8)...(8)，(18)...(18)
<223>OTHER INFORMATION荧光标记的核苷酸Glen荧光素dT
<400>SEQUENCE138
GGGGGGTFTT TTTTTTTFTG GGGGG
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CCCCCCTTTT TTTTTTTTTC CCCCC
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CCTGGACAGG CGAGGAATAC AGGTA
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GGACAFGCAA GFTATACAG
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<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
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<223OTHER INFORMATION荧光基团标记核苷酸MeNPOCOH dT+TAMRA
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CTGTAXTCCTCGCCXGTCC
<210>SEQ ID NO 141
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<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
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<223OTHERINFORMATION荧光基团标记核苷酸MeNPOCOH dT+ROX
<400>SEQUENCE 141
CTGTAXTCCT CGCCXGTCC
<210>SEQ ID NO 142
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(6)(6)，(15)(15)
<223OTHER INFORMATION荧光基团标记核苷酸MeNPOCOH dT+Cy5
<400>SEQUENCE 142
CTGTAXTCCT CGCCXGTCC
<210>SEQ ID NO 143
<211>LENGTH19
<212>TYPEDNA
<213>ORGANISM人
<220>FEATURE
<221>NAME/KEY修饰的碱基
<222>LOCATION(6)(6)，(15)(15)
<223OTHERINFORMATION荧光素dT(F)，MeNPOCOH dT+Cy5(X)
<400>SEQUENCE 143
CTGTAFTCCT CGCCXGTCC
权利要求
1. 一种单链寡核苷酸，基本不具有二级结构并由核苷酸残基形成，其中2个或更多个内部核苷酸残基用荧光团标记并没有结合的淬灭剂。
2. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中多至大约三分之一的内部残基用荧光团标记。
3. 根据权利要求1或2所述寡核苷酸，其中至少2个用荧光团标记的核苷酸残基被至少2个未标记的核苷酸残基分隔。
4. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其中所有用荧光团标记的核苷酸残基被至少2个未标记的核苷酸残基分隔。
5. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其包含至少1个G残基，其中至少1个荧光团标记的核苷酸残基与至少1个G残基相邻。
6. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其中3’核苷酸残基不包含3’羟基。
7. 根据权利要求6所述的寡核苷酸，其中3’核苷酸残基包含3’磷酸或本身是3’脱氧残基。
8. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其包含10至50个核苷酸残基。
9. 根据权利要求8所述的寡核苷酸，其包含15至30个核苷酸残基。
10. 根据权利要求8所述的寡核苷酸，其包含2至10个荧光团标记的内部核苷酸残基。
11. 根据权利要求9所述的寡核苷酸，其包含2至5个荧光团标记的内部残基。
12. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其中每一个荧光团是相同的荧光团。
13. 根据权利要求1至11任一项所述的寡核苷酸，其包含2个或更多个不同的荧光团。
14. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其中荧光团选自如下构成的组如6-羧基荧光素(FAM)、四氯荧光素(TET)、六氯荧光素(HEX)的基于荧光素的染料；如6-羧基-X-罗丹明(ROX)、6-羧基四甲基罗丹明(TAMRA)的基于罗丹明的染料；如Cy3或Cy5的Cy家族染料；如NED或JOE的其他荧光团，以及Alexa染料、Atto染料、Dyomic染料、Dymoicmegastoke染料和Thilyte染料。
15. 根据权利要求13所述的寡核苷酸，其包含2个不同的荧光团，1个是FAM，另一个是ROX。
16. 根据权利要求1-14任一项所述的寡核苷酸，其中荧光团不插入双标准DNA。
17. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸序列互补的序列。
18. 根据权利要求17所述的寡核苷酸，其中靶多核苷酸序列选自如下构成的组包括其中任何基因或其等位基因的人基因组、包括其中任何基因或其等位基因的小鼠基因组，以及包括其中任何基因或其等位基因的任何传染病原的基因组。
19. 根据权利要求18所述的寡核苷酸，其具有与以下人类基因或其等位基因中任何一种互补的序列
N-乙酰基转移酶2 X14672
因子V Leiden AY364535
因子IIAF493953
MTHFR NM_005957
镰刀细胞贫血症AY356351；
和羊PrP基因(NM_001009481)。
20. 根据权利要求18所述的寡核苷酸，其具有与以下传染病原的基因组或其中任何基因或其等位基因互补的序列
沙眼衣原体X07547
腺病毒AJ293905
流感A AY130766
肺炎链球菌X52474
MRSA AJ810121。
21. 根据权利要求18-20任一项所述的寡核苷酸，其具有与基因的一个等位基因完全互补的序列。
22. 根据权利要求17-20任一项所述的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸序列至少70％的序列同源性。
23. 根据权利要求23所述的寡核苷酸，其具有与靶多核苷酸序列至少80％的序列同源性。
24. 根据权利要求21所述的寡核苷酸，其中基因的给定等位基因与另一个等位基因相比的核苷酸序列差异的互补序列位于该寡核苷酸的中间。
25. 根据以上任一项权利要求所述的寡核苷酸，其固定在支持物之上或之内。
26. 寡核苷酸以间隔的位置固定在支持物之上或之内的阵列，其中至少一个寡核苷酸是权利要求1-24任一项所述的寡核苷酸。
27. 根据权利要求26所述的寡核苷酸阵列，其中每一个寡核苷酸都是权利要求1-24任一项所述的寡核苷酸。
28. 在包含多核苷酸序列的样品中研究靶多核苷酸序列的方法，该方法包括将样品与权利要求1-25任一项所述的能与靶多核苷酸序列杂交的寡核苷酸接触，并确定杂交是否发生。
29. 根据权利要求28所述的方法，其中通过检测荧光是否增加来确定寡核苷酸和靶多核苷酸序列之间是否发生杂交。
30. 根据权利要求28或29所述的方法，其中该方法在预定温度附近或在包括靶多核苷酸序列和所述寡核苷酸之间形成杂交的解链点的温度范围内进行。
31. 根据权利要求28-30任一项所述的方法，其中该寡核苷酸与该靶多核苷酸完全互补。
32. 根据权利要求28-30任一项所述的方法，其中该寡核苷酸与该靶多核苷酸不完全互补。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中该寡核苷酸与该靶多核苷酸序列至少具有70％的序列同源性。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中该寡核苷酸与该靶多核苷酸序列至少具有80％的序列同源性。
35. 根据权利要求28-33任一项所述的方法，其中所研究的靶多核苷酸序列是基因的1个或多个等位基因。
36. 根据权利要求35所述的方法，其中该寡核苷酸能够与该基因的1个以上的等位基因杂交。
37. 根据权利要求28-34任一项所述的方法，其中所述方法用于检测、鉴定或定量样品中靶多核苷酸序列的存在或数量。
38. 根据权利要求28-35任一项所述的方法，其中该样品包含通过扩增产生的多核苷酸序列。
39. 根据权利要求38所述的方法，其中该多核苷酸序列通过以下方法中的一种或多种产生聚合酶链式反应(PCR)、反转录PCR(RT-PCR)、连接酶链式反应(LCR)、链替代扩增(SDA)、转录介导的扩增(TMA)、滚环扩增(RCA)或依赖核酸序列的扩增(NASBA)。
40. 根据权利要求38或39所述的方法，其中样品中多核苷酸序列的扩增在存在能与靶多核苷酸序列杂交的寡核苷酸的情况下进行。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中该寡核苷酸的3’核苷酸残基不包含3’羟基。
42. 根据权利要求40或41所述的方法，其中在样品中的多核苷酸序列扩增期间观察荧光。
43. 根据权利要求38-42任一项所述的方法，其中样品中的多核苷酸序列通过扩增从生物原料中产生，并不需要在先的核酸提取。
44. 根据权利要求39所述的方法，其中PCR是非对称扩增。
45. 根据权利要求30-44任一项所述的方法，其中能与靶多核苷酸序列杂交的寡核苷酸、包含多核苷酸靶序列的样品或两者固定在支持物之上或之内。
46. 根据权利要求30-45任一项所述的方法，其中靶多核苷酸序列选自如下构成的组包括其中任何基因或其等位基因的人基因组、包括其中任何基因或其等位基因的小鼠基因组，以及包括其中任何基因或其等位基因的任何传染病原的基因组。
47. 权利要求17-24任一项所述的寡核苷酸的制备方法，该方法包括选择靶多核苷酸序列，合成寡核苷酸序列，该寡核苷酸序列具有与该靶多核苷酸互补的序列以及权利要求1-25任一项所述的性质。
48. 根据权利要求47所述的方法，其中该靶多核苷酸序列选自如下构成的组包括其中任何基因或其等位基因的人基因组、包括其中任何基因或其等位基因的小鼠基因组，以及包括其中任何基因或其等位基因的任何传染病原的基因组。
49. 任何新的单链寡核苷酸，其中2个或多个内部核苷酸残基如在本文中描述的，特别是参考说明书中的表格和序列表，用荧光团标记，并没有结合的淬灭剂。
50. 如在本文中描述的研究靶多核苷酸序列的任何新方法。
全文摘要
基本不具有二级结构并由核苷酸残基组成的单链寡核苷酸，其中2个或多个内部核苷酸残基用荧光团标记并无相连的淬灭剂。通常，至少2个荧光团标记的核苷酸残基被至少2个未标记的核苷酸残基分隔开。该寡核苷酸可用于靶多核苷酸序列的研究。
文档编号C12Q1/68GK101268200SQ200680034566
公开日2008年9月17日 申请日期2006年7月20日 优先权日2005年7月20日
发明者戴维·戈登·麦克道尔, 戴维·约翰·弗伦奇 申请人:Lgc有限公司