专利名称：连续培养产醇细菌的装置和培养该细菌的方法
技术领域：
本发明涉及连续培养产醇细菌(包括运动发酵单胞菌(Z;womo"ay moW/^)等厌氧细菌和赋予了醇发酵机能的大肠杆菌，不包括酵母)的装置和 方法。更具体地，本发明涉及一种技术，该技术用于在向发酵罐连续或分 批地提供基质进料液时，以作为发酵罐废气的二氧化碳的流量变化为指标， 来预测发酵罐内的基质消耗，由此控制基质液进料速度和发酵液取出速度， 从而使发酵罐中的基质浓度为 一定的低浓度。
背景技术：
发酵工业利用微生物发酵，以进行微生物产生的各种氨基酸、有机酸、 乙醇、丙酮和丁醇、核酸相关物质的发酵或者微生物菌体本身的生产。在 碳水化合物作为主要基质的这些发酵工业生产中，通过分批操作进行发酵 操作。因此，除发酵本身外，必须反复进行培养基的制备、装置准备(灭菌)、 种子发酵、发酵之后的洗涤和清洁等操作，以至于发酵罐的净操作时间短 并且操作效率低下。为了解决此问题，在酵母乙醇发酵中，引入了级联操作(cascade operation),其中由数个发酵罐串联进行发酵生产。但是，这并不是最终的 解决方案。此外，在分批操作中，为了监测发酵过程，必须人工进行频繁 的糖浓度分析等，因而人员保证和工厂运转管理成了负担。在所有的发酵操作中，都必须避免由于发酵液中的高基质浓度引起的 抑制效应，以有效地利用基质，并且保持残留糖浓度尽可能低，使基质损 失最小。此外，为了使从停止发酵后的液体中分离产物更加容易，也为了 尽可能降低废水处理的成本负担，必须使细菌未消耗的基质尽可能少地流 向生物分离工程。通过以下方法将建立起稳定连续的操作在连续的基质进料和发酵液 取出下，保持基质浓度低并且几乎恒定，导致机械操作效率的很大提高。 在该操作模式中，可以减少糖浓度的分析作业，从而节约人力，并且削减劳动力成本和夜间工作。本发明人在文献l(特开2003-274934号公报)中提出了厌氧细菌例如运 动发酵单胞菌的连续乙醇发酵方法。该方法使用以下原理实现了连续发酵 伴随着菌体代谢的发酵液的pH变化量表示基质消耗量和乙醇产量。在该方法中，为了修正发酵液的酸-碱平衡，计算碱(例如氨、氢氧化钠 或其它石咸)添加量的累积，并且通过取出与石威添加量体积相对应的发酵液， 使发酵罐中的发酵液量保持恒定，以形成连续发酵。但是，当将该方法应 用于糖蜜等含有许多不明杂质的廉价工业原料时，pH变化量未必与基质消 耗相对应，因此有些情况下采用该方法进行连续发酵是困难的。 [文献1]特开2003-274934号/>报发明内容从以上来看，本发明的目的是提供基质损失少的产醇细菌连续发酵装 置及其相关技术，在使用运动发酵单胞菌等厌氧细菌的乙醇连续发酵中， 即使是在糖蜜、食品工业废物、食品工厂废液等廉价但含有许多杂质的基 质中，其仍能够正确地预测糖消耗量和残留糖浓度，将发酵液的基质浓度 保持在一定的低水平。本发明人正在研究开发克服上述问题的技术，并且注意到可以通过精 确测定从厌氧性细菌的连续乙醇发酵中排出的二氧化碳来精确确定基质消 耗，所述连续乙醇发酵使用糖蜜作为工业用原材料。我们完成了下述的连 续培养方法当发酵罐中的基质将用光至枯竭时，检测到二氧化碳流量降 低，以此为指标，控制基质进料和发酵液取出，从而该系统达到长时间稳 定的连续发酵，同时在发酵液中保持一定的低的基质浓度。本发明的第一方面提供产醇细菌的连续培养方法，包括将基质液进 料到培养产醇细菌的发酵罐中，同时从所述发酵罐中取出 一定体积的发酵液，所取出的发酵液的体积根据进料到发酵罐的基质液的体积确定；和当 从所述发酵罐释放的二氧化碳流量值低于预定范围时，就触发将基质液进 料到所述发酵罐中。根据该方案，在基质基本用光至枯竭的培养阶段，进行基质液进料和 发酵液取出，从而使得基本上不产生因未被细菌利用而引起的基质损失。 如下文所述的实施例中所示，当发酵使用糖蜜等富含杂质的工业生产原料时，该系统能够长时间稳定地进行连续发酵，同时将发酵罐的基质浓度保 持在一定的低水平。此外，基质液进料至发酵罐的工作时间和单位时间内基质液进料到发 酵罐的进料速度希望保持恒定。因此，对于一次的基质液进料量，希望预先计算进料前数小时发酵液 中的基质消耗，由其估计上述进料时间和进料速度，以使基于此添加的基 质全部都被微生物消耗，在发酵罐内基本无残留。所述的预定范围优选根据二氧化碳流量的阈值确定。根据本发明，因为被消耗而引起的基质损失非常小，并且使用糖蜜等 含有丰富不确定杂质的廉价工业原料时，连续发酵也能够持续长时间，同 时将发酵罐内的基质浓度保持在一定的低水平。
[图1]图1是根据本发明的一种实施方式的连续发酵装置的示意流程图；[图2]图2是根据本发明实施方式的进料控制处理的流程图；[图3]图3是显示本发明实施方式中菌体浓度、残余糖量、二氧化碳流量值和基质液进料状态的变化的图表；[图4]图4是显示本发明实施方式中浊度、乙醇积累量、二氧化碳流量值和残余糖量的变化的图表；[图5]图5是显示对比例1的培养结果的图表；[图6]图6是显示本发明的实施例5的培养结果的图表；和[图7]图7是显示本发明的实施例6的培养结果的图表。[符号的说明]1 发酵罐 2搅拌器3 消泡器4 流量计 5控制器 6 接口7 CPU8 ROM9 法度计10 pH计11基质液罐12基质液进料泵13中和剂罐14中和剂进料泵15循环泵16错流过滤单元17切换阀18取出泵19取出液罐具体实施方式
下面结合
本发明优选的实施方式。在详细说明具体构成之前， 本实施方式的要点概括如下。该实施方式涉及能够应用于厌氧的产醇微生物例如运动发酵单胞菌的 发酵装置，其可以使用各种可同化发酵资源作为基质液。通过首先将基质 液以预设的进料速度和一定的时间首次加到发酵罐中来开始连续发酵，所 述预设的进料速度是在发酵初期求得的。预设的进料速度通过菌体浓度和 糖消耗速度之间的关系确定，所述菌体浓度和糖消耗速度之间的关系是通 过在指定的微生物菌抹、培养基组成和培养条件下进行分批发酵的发酵试 验测定的。接下来的基质液的添加通过由质流传感器检测二氧化碳释放的 降低而进行，所述二氧化碳释放的降低由发酵罐内基质枯竭而引起。从而 使得发酵罐的基质浓度总是保持在低水平范围内。以下通过参考图1描述本发明实施方式的连续发酵装置。发酵罐1培 养厌氧细菌例如运动发酵单胞菌。在该发酵装置中，发酵罐的总体积小， 为3升，并且因为它不是压力容器所以难以控制该容器的内压，故未实施 内压控制。但是，优选使用压力容器发酵罐，并且可引入发酵罐的内压控 制。将发酵罐1的温度调节为指定值，并且通过设置在发酵罐1中的搅拌器2来引入温和搅拌以一定速度搅拌发酵罐1的内容物。
发酵罐1的排出管通过消泡器连接至流量计4。流量计4可选自质流传 感器、废气流量计和压力计，它检测发酵罐1释放的二氧化碳流量值。将 通过流量计4检测到的二氧化碳流量值输入到控制器5的接口 6。当然，可 以检测响应二氧化碳流量值的任何物理量。
控制器5控制图1中所示的整个连续培养装置。该控制器5的接口 6 接收浊度计9(优选激光法度计(laser turbidimeter))的浊度值和pH计10的pH 值，所述浊度计测定发酵罐1中的浊度，所述pH计测定发酵罐1中的pH 值。CPU7是控制器5的主要单元，它执行存储在ROM8中用于操作控制的 计算机程序。计算机程序包括进料控制程序，其根据图2中所示的流程图 运行。此外，CPU7通过合适的接口 6将控制信号输出到基质液进料泵12、 中和剂进料泵14、循环泵15、切换阀17和取出泵18,形成连续发酵的全 部操作控制。
基质液罐11存储下文中所述的实施例中提及的基质液。当基质进料命 令从接口 6传送至基质液进料泵12时，基质液从基质液罐11以预设的速 度和时间进料至发酵罐l。结果，增加了发酵罐1中的残余糖量。
中和剂罐13存储中和剂例如氨等。通过发酵罐1中发酵的进行，伴随 着孩史生物的生长，发酵罐中的pH下降。在该实施方式中，CPU7向中和剂 进料泵14输出中和剂进料信号来控制发酵罐1中的pH值，从而使pH总是 保持在4.5至6.0左右的一定值(因条件而异)。
循环泵15连接至发酵罐1,其根据接口 6的循环指示信号将发酵罐1 的发酵液取出压送至错流过滤单元16。错流过滤单元16将一部分取出的发 酵液送回至发酵罐l，并将滤液引入到切换阀17—端的输入端口。此外， 切换阀17的其它的输入端口连接至发酵罐1的发酵液。
根据接口 6的切换信号，切换阀17的一个/其它输入端口与输出端口相 连。根据来自接口 6的取出信号，取出泵18将来自切换阀17的输出端口 的滤液/发酵液压送至取出液罐19。由此，将含有乙醇的发酵液取出至取出 液罐19中。可用离心分离器代替错流过滤单元16。
参考图2,说明通过控制器5进行的基质液进料控制的各过程。在该过 程中，重要的是，当从发酵罐1释放的二氧化碳流量值降低至低于预设的 下限值时，控制器5向基质液进料泵12 (进料单元)输出基质进料信号，将基质液进料到发酵罐1。
循环泵15、错流过滤单元16、切换阀17和取出泵18相当于用于从发 酵罐1取出发酵液的取出单元，并且控制器5控制该取出单元，从而使得 取出发酵液的量与基质液进料泵12将基质进料到发酵罐1的进料量相等。 CPU7参考浊度计9的浊度，并且当发酵罐l的发酵液菌体浓度偏低时，由 错流过滤单元16取出滤液(切换阀17如图1中所示工作)，而当菌体浓度偏 高时，从发酵罐l取出发酵液(切换阀工作状态与图l相反)，使得发酵罐1 中发酵液菌体浓度保持一定。
参考图2和图3进行说明。首先，如图2中的步骤1所示，制备菌种、 基质液，并将其加入发酵罐1。在步骤2中，等待时间T0、 二氧化碳流量 阈值Th、进料时间Tl和进料速度R1是预设的。这些预设值是根据条件设 定的，必要时可适当进行修正。在图3中1 = 10时，发酵开始。
进料速度R1的值根据预先求得的菌体浓度和糖消耗速度之间关系式来 设定，以使发酵液的基质浓度保持在枯竭之前的低水平，所述进料速度R1 值存储在ROM8中。
在发酵的开始阶段，培养基中菌体浓度低(图3 (a》而基质丰富(图3 (b))。 其后，作为产醇细菌的特征，即使基质还有剩余，增殖也会停止。因而， 为了增加菌体浓度，循环培养液，取出滤液再补充相当的培养基，进行浓 缩培养，提高菌体浓度。当菌体浓度达到预设值时，启动浊度控制，接进 入连续发酵。
随着微生物的积极生长，菌体浓度增加，并且发酵罐1中剩余的糖浓 度降低。此外，发酵的过程增加二氧化碳流量值(图3(c))。此时，CPU7监 视是否已过等待时间T0(步骤3),在等待时间过去之前不进行基质液进料。
如图3(C)中所示，当在t时刻的首次基质液进料完成后又过去等待时间 T0时，CPU7在步骤4中检查二氧化碳流量值是否低于其阈值Th。例如， 在时间t = t0+T0， 二氧化碳流量值高于阈值Th,则此时CPU7确认在步骤 8中不应结束操作，然后返回步骤4的操作，再次重复上述检查。
在时间t:tl，发酵罐1中的基质几乎用光，二氧化碳流量值急剧降低 至低于阈值Th。这触发操作从步骤4切换至步骤5。因此，CPU7通过接口 6将基质液进料信号输出到基质液进料泵12，并且基质液进料泵12开始进 行从基质液罐11至发酵罐1的进料，进料速度为Rl(步骤5),并且进料持续预设时间Tl(步骤6)。结果，如图3(b)中所示，发酵罐1中的残余糖量从 几乎为0的水平增加。即，在时间t = tl时重复基质液进料，就可以以接近 限制(制限)基质浓度的低基质浓度持续运转。
使用葡萄糖作为基质的乙醇发酵的二氧化碳产生和发酵之间的关系通 常可表示为如下化学定量关系。
C6H1206-> 2C2H5OH + 2C02(1)
从该方程式看出，l摩尔葡萄糖产生2摩尔二氧化碳和2摩尔乙醇，因 而当乙醇生成由于糖类耗尽而停止时，就不再产生二氧化碳。因此，以二 氧化碳释放量的降低为指标可以高可信性地检测基质耗尽。
在该连续发酵装置中，通过浊度计9将菌体浓度保持恒定，但是，实 际进行进料，有些情况下，基质消耗变得比输入到控制器中的预定值高或 低。因此，优选对基质液进料的设定时间(夕^ $ y夕、')进行微调。
然后，自时刻tl经过预设时间Tl后，CPU7指示基质液进料泵12停 止基质液进料(步骤7),该基质液进料泵12停止基质进料。然后如图3(b) 中所示，残余糖量再次降低，在时刻t2 二氧化碳流量值也降低至低于阈值 Th。
以后，在时刻t2， t3, t4…,重复相同的操作(步骤3 8)。
由此，在第二次之后(在时刻tl之后)，当流量计4检测到从发酵罐1
内基质耗尽时释放的二氧化碳量急剧降低并且达到阔值Th时，开始进料基质液。
如上所述，通过不断地检查由微生物产生的二氧化碳，可以连续进料 基质液以避免糖类等基质耗尽，容易地将发酵罐中的基质浓度限制在5 g/L 以下的低水平。在使用含有丰富杂质的糖蜜作为工业原材料的发酵中，依 赖于pH的控制方法不能有效地用于连续发酵。但是，本发明能够克服该问 题，并且该方法能够应用于比现有技术更为广泛的材料费用低廉的发酵中。
实施例
下面详细描述本发明的实施例，当然本发明不限于这些实施例。 (实施例1)
按规定浓度制备YM broth (Difco laboratories, Detroit)培养基，然后将 10 ml培养基分加到试管中，并且将其在115。C高压灭菌10 min。接种运动发酵单胞菌NRRLB-14023， 30。C静置发酵18h，以此作为种子菌。
对于主发酵，将巴西产糖蜜用自来水稀释5.3倍，并且将其在120。C高 压灭菌10min。将2升培养基倒入已灭菌的小型发酵罐(总体积3升)中， 然后接种根据上述方法培养的100ml种子发酵液，并且在30。C开始发酵， 同时以100rpm搅拌。随着菌体增殖发酵液pH降低，因此使用pH计在线 监测pH值，并使用1N氨水将pH保持在5.5。
在发酵开始15h之后，细胞增殖达到顶峰，因此进行发酵液的循环浓 缩，增加菌体浓度。使发酵液流过安装在发酵罐外部的错流过滤单元(Pall JapanLtd., 0.45 mp, 0.11112滤筒)，取出滤液，并且补充与开始发酵时相同 的培养基，以在保持发酵罐液量一定的同时，提高菌体浓度。
通过该方法，在发酵开始约24h时，菌体浓度达到4g/L。然后，如图 4中所示，在255 h连续发酵的所有阶段，通过激光浊度计(ASRLtd.， Model LA-301)控制菌体浓度在4.0±0.2 g/L。当菌体浓度恒定之后，用葡萄糖/蔗糖 分析仪分析发酵液中的剩余基质浓度，葡萄糖和蔗糖的浓度总计为10g/L。 使用糖蜜制备基质液，所述糖蜜与发酵开始时的巴西产糖蜜相同，用自来 水将其稀释5.7倍，然后在120。C高压灭菌10 min,以950 g/h的速度进料4 h。
在进料4h之后，停止进料，然后微生物很快消耗掉发酵液中的少量剩 余基质，并且进料停止约15 min之后，观察到二氧化碳释放的急剧降低。 当二氧化碳释放量达到设定值0.08L/min时，认为基质已经耗尽，并且再次 进行基质液的进料。实际上，当二氧化碳释放降低至下限时，分析仪测得 的残余糖浓度几乎为0 g/L。该操作是通过控制程序自动进行的。
由此，通过如下方法进行连续发酵使用控制程序以1,000 g/h的进料 速度进料4 h，然后暂停进料直到二氧化碳释放急剧降低，并且当二氧化碳 流量值达到阈值时再进行进料。基于由进料停止到二氧化碳释放急剧下降 的时间，能够推测进料中的发酵液残余糖浓度。当该时间较长时，判断残 余糖浓度高，稍减进料速度；反之，稍增进料速度。以上述方式进行微调。
但是，可以根据发酵方式或基质种类等发酵条件、微生物菌林的性能 等，调节基质液进料的设定值。在该实施例中，每次进料的进料时间都为4 h,但是，如前述，所述进料时间不必限于此，只要在菌体活性未发生大变 化的时间内，可以尽可能地延长进料时间以避免损失时间。在图4中，通过浊度控制状态(上)、质量流量计检测到的二氧化碳释放 (下)、发酵罐中的乙醇浓度以及残余糖浓度来显示发酵过程。通过上述的控
制程序，稳定的发酵持续了 255 h。在此期间，进料中的发酵液残余糖浓度 维持在葡萄糖和蔗糖合计为约10.0±5g/L。此外，发酵液中的平均乙醇浓度 为约68 g/L。经过230 h的净连续发酵时间，收获含有68 g/L乙醇的220升 发酵液。
(实施例2)
用作种子的菌体、培养基、发酵方法、发酵条件以及用于主发酵的装 置与实施例1中所用的相同。
通过向玉米淀粉糖化液中加入CSL (玉米浆)来制备主发酵培养基和基质液。
将玉米淀粉悬浮于自来水中形成200 g/L的浆液，然后在搅拌下将pH 调节至6.0，然后加入0.5 |il/g淀粉的Termamyl 120L(Novo),并将该浆液在 90。C的水浴上液化处理1小时。然后冷却反应的液体，将pH调节至4.5, 并加入0.6 jil/g淀粉的Dextrozyme(Novo),并且将其在60°C的恒温箱中糖化 处理24h。获得葡萄糖浓度为178g/L的糖化液。
用水稀释该糖化液，使葡萄糖浓度为130 g/L，并加入5g/L的用离心 机除去了固体成分的CSL(SaneiTokaK.K.)。调节pH，并高压灭菌，将其作 为培养基、基质液。
用于发酵的步骤和控制程序与实施例1中所述相同。
进料速度为950g/h, —次进料的进料时间与实施例1同为4h,以及二 氧化石友释放的阈值为0.08 L/min，这也与实施例1相同。
发酵稳定地持续长时间，经过200h的连续运转，得到了 180升发酵液， 其中含乙醇58g/L。
(实施例3)
用作种子的菌体、培养基、发酵方法、发酵条件以及用于主发酵的装 置与实施例1中所用的相同。
向木薯淀粉糖化液中添加糖蜜，以此作为主发酵培养基和基质液。 将木薯淀粉(Thailand)以200 g/L的浓度悬浮于自来水中，并将该浆料 的pH在搅拌下调节至6.0,然后加入0.5 pl/g淀粉的Termamyl 120L (Novo), 并将该浆液在90。C的水浴上液化处理1小时。然后冷却反应的液体，将pH调节至4.5,并加入0.6 (il/g淀粉的Dextrozyme(Novo)，并且将其在60°C的 恒温箱中糖化处理24h。获得葡萄糖浓度为175 g/L的糖化液。用水稀释该 糖化液，使葡萄糖浓度为130 g/L，并以1:1的比例混合实施例1中所用的 糖蜜的5.7倍稀释液，调节pH,高压灭菌，以此作为培养基、基质液。用于发酵的步骤和控制程序与实施例1中所述相同。进料速度l，OOO g/h, —次进料的进料时间为4 h,这与实施例1相同， 二氧化碳释放的阔值为0.08 L/min，这也与实施例1相同。发酵稳定地持续长时间，经过200h的连续运转，得到了 175升发酵液， 其中含乙醇58g/L。(实施例4)用作种子的菌体、培养基、发酵方法、发酵条件以及用于主发酵的装 置与实施例1中所用的相同。主发酵培养基、基质液为模型新鲜垃圾糖化液(乇r A生3、、;、糖化液)， 其以新鲜垃圾为原料，已发酵。将米饭(白米)250g、甘蓝59g、煮熟的胡萝卜50g、香蕉(可食用部分)50 g和生鱼片50 g混合，并在榨汁机-混合器(juicer-mixer)上用少量的水将其粉 碎、果汁化，然后加入总量为1升的水进行稀释。在搅拌下将pH调节至 4.5,然后加入0.6 jil/g淀粉的Dextrozyme (Novo),并且将其在60°C的恒温 箱中糖化处理24h。得到糖化后的葡萄糖浓度为85 g/L的糖化液，高压灭 菌，以此作为培养基、基质液。进料速度1，200g/h， 一次进料的进料时间为4h，这与实施例l相同， 二氧化碳释放的阈值为0.08 L/min，这也与实施例1相同。发酵稳定地持续长时间，经过150h的连续运转，得到了 150升发酵液， 其中含乙醇41 g/L。如以上实施例所述，使用糖蜜等含有大量未知杂质的工业原材料的连 续发酵，能够持续长时间，并且显然在发酵进行的过程中，发酵罐中的基 质浓度保持在一定的低水平。与现有技术相比，本发明有显著的优势。关于(3-内酰胺类抗生素的效果，下面描述对比例1和实施例5、 6。实 施例5和6的相同点如下。对于使用运动发酵单胞菌的连续乙醇发酵，将加入发酵罐中的培养基 高压灭菌，然后冷却，作为初始培养基。此外，将青霉素G钾溶于冷却的已灭菌的水中，并将其加到培养基中，在培养基中的浓度为5-20IU/ml,并 且加入种子菌(种子)，开始发酵。与实施例l相同，通过分批培养使菌体浓度提高，并且通过菌体浓缩 使细胞浓度增加至目标值。当细胞浓度达到目标值时，连续添加基质液， 进行连续发酵，其中，按与初始培养基相同的步骤在所述基质液中加入终 浓度为5-20 IU/ml的青霉素G钾。对于用于菌体浓缩的错流过滤单元16，同样添加终浓度为5-20 IU/ml 的青霉素G钾，30。C温育2h。通过这种方法完全杀灭残存在错流过滤单元 16的膜内或连接管隐蔽处的污染菌。这是实施例5、 6和实施例1 -4之间不同之处。如实施例5、 6中所详 细描述的，通过这样的处理，使用运动发酵单胞菌的连续乙醇发酵成功地 持续了 350h之久，而没有任何污染菌的渗透和增殖，以常规(常時)最大 速度进行了乙醇的发酵生产。这种技术不但对运动发酵单胞菌有效，也对 能够进行醇发酵的基因重组大肠杆菌有效。在本发明中，抗生素不限于仅仅是青霉素，以氨苄西林为代表的对革 兰氏阳性细菌有效的p-内酰胺类抗生素均可以获得同样的效果。下面描述对比例1，然后再描述实施例5和6。(对比例1)根据规定浓度制备YM broth (Difco laboratories, Detroit)培养基，然后 将10 ml培养基分加到试管中，115。C高压灭菌10 min。接种运动发酵单胞 菌NRRLB- 14023, 3(TC静置发酵18h，以此作为种子菌。对于主发酵，将由结晶葡萄糖140g/L、酵母提取物5g/L、味液(大豆 片(soybean flake)酸解产物)0.5 vol。/。组成的培养基调节至pH 5.5,并且将其 在120。C高压灭菌20 min。将2升培养基倒入已灭菌的小型发酵罐中(总体 积3升)，然后接种根据上述方法培养的100 ml种子发酵液，并且在30°C 培养，同时以100rpm搅拌。随着菌体增殖，发酵液pH降低，所以使用pH 计10监测pH值，并使用1 N氨水将pH保持在5.5。图5显示对比例1的发酵过程。接种之后，通过分批培养开始菌体增 殖，当细胞浓度超过lg/L时，通过错流过滤单元开始菌体浓缩，使用基质 液补加基质，同时从培养体系中取出除去了菌体的液体，来增加细胞浓度。在培养开始约40 h时，菌体浓度达到约5 g/L的目标值，发酵进行到使用图1中所示的系统的连续^f莫式。如图5中所示，直到培养开始80 h(连续 发酵40h时)，菌体浓度保持大致6 g/L，乙醇浓度保持高于60g/L，但是它 有下降的趋势，二氧化碳释放量也倾向于降低，其为约250 ml/min(相当于 约10 mmol/min)，乙醇生产速度保持在约30 g/h。但是，在连续发酵40h之后，二氧化碳释放以及乙醇浓度急剧降低， 并且氨的消耗快速增加，以至于成为异常发酵。在培养的第120h时，发酵 变得失去控制，发酵的连续性停止。认为在培养40h时(连续模式开始时) 渗入了乳酸菌，并且在第80小时后其生长旺盛。实际上，培养100h的发 酵液在琼脂平板上培养时，观察到大量的乳酸菌落。(实施例5)根据规定浓度制备YM broth (Difco laboratories, Detroit)培养基，然后 将10ml培养基分加到试管中，115。C高压灭菌10min。接种运动发酵单胞 菌NRRLB- 14023， 30。C静置发酵18h,以此作为种子菌。对于主发酵，将由结晶葡萄糖140g/L、酵母提取物5g/L、味液(大豆 片酸解产物)0.5 vol。/。组成的培养基调节至pH5.5,并且将其在120。C高压灭 菌20min。将培养用的最初培养基、菌体浓缩用的基质液、连续发酵基质液 高压灭菌，并冷却，然后加入青霉素G钾至浓度为5IU/ml。将2升培养基倒入已灭菌的小型发酵罐(总体积3升)中，然后接种 根据上述方法培养的100 ml种子发酵液，并且在30。C培养，同时以100rpm 搅拌。随着菌体增殖，发酵液pH降低，所以使用pH计10监测pH值，并 使用1N氨水将pH保持在5.5。使用的系统与图1中所示的实施例1中的系统相同。如对比例1中所 述，以往的发酵受到污染的损害，可以确信，污染菌保留在用过的过滤单 元16的内部。因此，为了绝对地除去保留在过滤单元的所有部件中的污染 菌，将用过的滤筒分解洗净，并且浸泡在碱溶液中数日。然后用青霉素处 理该滤筒以完全杀灭剩余的污染菌。即，用青霉素洗涤图1中所示的系统 的所有部分，并将该青霉素处理的滤筒装配到发酵罐1，用于菌体浓缩循环。图6示出培养结果。接种之后，通过分批培养使菌体增殖，当细胞浓 度超过l g/L时，通过错流过滤单元16开始浓缩菌体，补加基质，即进料 添加了终浓度为5IU/ml的青霉素的基质液。此外，通过从培养体系中取出 除去了细胞的液体使细胞浓度增加。在培养开始约30 h时，菌体浓度达到5 g/L的目标值，发酵进入到图1 中所示的系统的连续模式。用于连续发酵的基质液由140 g/L红糖(三温糖)、5 g/L酵母提取物和 5ml/L味液组成，将其调节至pH5.5,并且在120°C高压灭菌20 min。在基 质液冷却之后，添加青霉素G钾至终浓度为5 IU/ml。图6示出了实施例5的连续发酵结果。发酵成功地无任何污染地进行 150h之久，在整个发酵时程中，乙醇的发酵生产是令人满意的。在连续发 酵的始终，菌体浓度保持在5±0.5 g/L, 二氧化碳释放量为约350 ml/min (约 15mmol/min),乙醇生产速度为约42 g/h，保持了非常高的生产速度。如图 6中看出，基质液进料和发酵液取出的速度稳定，在培养中无变化，连续发 酵以稳定状态持续了长时间。在发酵的所有阶段，发酵液的乙醇浓度为65±5 g/L (约8.2%)。注意到，在用青霉素清洁错流过滤单元16并将青霉素用于 基质液时，观察到了显著的效果，导致没有污染影响的长时间连续发酵。(实施例6)用作种子的菌体、培养基、发酵方法和发酵条件与实施例1中所用的 相同。初始培养基、用于细胞浓缩的基质液以及连续发酵基质液的组成及制 备方法同前。即，用水稀释玉米淀粉酶糖化液，并且添加5 ml/L的CSL (玉 米浆)，将pH调节至5.5,然后将糖化液的糖浓度调节至140 g/L，接着在 120。C高压灭菌20 min。冷却之后，加入终浓度5 IU/ml的青霉素G钾，用 于培养。防止污染的方法尤其是用青霉素清洁错流过滤单元16的方法如前 面所述。图7示出实施例6的发酵结果。所用的系统与实施例1相同。接种之 后，通过分批培养使菌体增殖，当细胞浓度超过lg/L时，通过错流过滤单 元16开始浓缩菌体，补加基质，即进料添加了终浓度为5 IU/ml的青霉素 的基质液。此外，通过从培养体系中取出除去了细胞的液体使细胞浓度增 加。在培养27 h时，菌体浓度达到约6 g/L的目标值，发酵进入到图1中所 示的系统的连续模式。连续发酵的基质液由前述玉米淀粉酶糖化液(糖浓度 140g/L)和5ml/L的CSL(玉米浆)组成，调节至pH5.5,然后在120。C高压 灭菌20min。冷却之后，加入终浓度5 IU/ml青霉素G钾。如图7中所示，发酵成功地无任何污染地进行350h之久，在整个发酵 时程中，乙醇的发酵生产是令人满意的。在连续发酵的始终，菌体浓度保 持在6±0.5 g/L, 二氧化石友释》文量为约500 ml/min (约21 mmol/min)，乙醇生 产速度为约58g/h,在整个培养时间内保持了非常高的生产速度。如图7下看出，基质液进料和发酵液取出的速度稳定，在培养中无变 化，连续发酵以稳定状态持续了长时间。在发酵的所有阶段，发酵液的乙 醇浓度为65±5 g/L(约8.2%)。注意到，在用青霉素清洁错流过滤单元16并 将青霉素用于基质液时，观察到了显著的效果，导致没有污染影响的长时 间连续发酵。
权利要求
1.产醇细菌的连续培养装置，包括培养产醇细菌的发酵罐；将基质液进料到所述发酵罐的供给单元；用于检测从所述发酵罐释放的二氧化碳的流量值或其函数值的计量器；和控制单元，其根据所述计量器的输出控制所述供给单元，其中当从所述发酵罐释放的二氧化碳的流量值低于预定范围时，所述控制单元以此为触发条件，使所述供给单元将基质液进料至所述发酵罐。
2. 权利要求1所述的连续培养装置，其中所述供给单元将基质液进料 到所述发酵罐的时间和将基质液在单位时间里进料到所述发酵罐的进料速 度是恒定的。
3. 权利要求1所述的连续培养装置，其中所述预定范围根据二氧化碳 流量值的阈值确定。
4. 权利要求1所述的连续培养装置，还包括取出单元，用于从所述发 酵罐取出发酵液，其中所述控制单元控制所述取出单元，使得所述取出单元从所述发酵 罐取出一定量的发酵液，所述取出的发酵液的量根据由所述供给单元进料 到所述发酵罐的基质液的量来确定。
5. 产醇细菌的连续培养方法，包括 将基质液进料到培养产醇细菌的发酵罐；并且，从所述发酵罐取出一定体积的发酵液，所述取出的发酵液的体 积根据进料到所述发酵罐的基质液的量来确定；和当从所述发酵罐释放的二氧化碳流量值达到低于预定范围时，以此为 触发条件，将基质液进料到发酵罐。
6. 权利要求5所述的产醇细菌的连续培养方法，其中将基质液进料到 所述发酵罐的时间和将基质液在单位时间里进料到所述发酵罐的进料速度 是恒定的。
7. 权利要求5所述的产醇细菌的连续培养方法，其中所述预定范围根 据二氧化碳流量值的阈值确定。
8. 权利要求5所述的产醇细菌的连续培养方法，还包括添加(3-内酰胺 类抗生素。
9. 权利要求8所述的产醇细菌的连续培养方法，其中所述(3-内酰胺类 抗生素是青霉素。
10. 权利要求8所述的产醇细菌的连续培养方法，其中所述(3-内酰胺 类抗生素在清洗连续发酵装置的包括发酵罐在内的至少一部分时添加。
11. 权利要求8所述的产醇细菌的连续培养方法，其中所述P-内酰胺类 抗生素在包括发酵罐的连续发酵装置运转时添加。
全文摘要
一种连续培养装置，其中使用厌氧细菌，甚至是借助于含有高比例杂质的基质进行乙醇连续发酵，发酵液的基质浓度在低水平保持恒定，以保证减少的基质损失。提供一种连续培养装置，其包括用于培养产醇细菌的发酵罐(1)；用于将基质液进料到发酵罐的供给泵(12)；用于检测从发酵罐放出的二氧化碳气体的流速值的流量计(4)；和能够基于流量计的输出控制供给泵的控制单元(5)；其中当二氧化碳气体的流速值低于给定的范围时，控制单元根据流速值触发供给泵将基质液供给到发酵罐。供给泵每次供给基质液的速度保持恒定。
文档编号C12M1/00GK101268179SQ200680034108
公开日2008年9月17日 申请日期2006年9月8日 优先权日2005年9月15日
发明者岛崎敬士, 河野明彦, 石崎文彬 申请人:尼克弗公司