检测寡核苷酸的方法

专利名称：检测寡核苷酸的方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及对样品中经修饰的核酸寡核苷酸进行检测和/或定量的方法和组合物。这些方法和组合物可用于对生物样品中诊断性和/或治疗性的合成的 经修饰的寡核苷酸加以检测和定量，所述寡核苷酸例如适配体、微RNA(HIiRNA)、小干扰 RNA(siRNA)和其它非编码RNA(ncRNA)分子、反义寡核苷酸或核酶。
背景技术：
在过去二三十年来，对特定核酸序列的鉴定和定量是分子生物学中人们极感兴趣 的领域。对某些核酸及其产物进行鉴定和定量的能力令范围广范的多门学科(例如，个体 化医学，包括分析单核苷酸多态性(SNPs)和评估药物抗性)取得进展，加深了我们对生物 化学和分子生物学过程的理解，并且在癌症诊断和治疗方面有所进展，等等。近来很多兴趣集中于某些非编码性的小RNA分子(特别是小干扰RNA(SiRNA)和 微RNA(miRNA)及其前体)的新发现的性质和它们对细胞内过程的影响。目前人们相信， siRNA参与基因沉默，而miRNA被认为负责翻译阻遏(以及在某些情况下，基因沉默)的一 些形式。随着对这些小RNA分子的兴趣极大高涨，科学家却面临对这些小分子进行鉴定和 定量的困难任务。siRNA是双链寡核苷酸，其长度典型地为19-23个核苷酸。它们可通过合成获得， 可被化学修饰，并且目前被开发为潜在候选药物。此类分子的药理学性质仍待充分研究，这 需要开发新的生物分析方法，在生物或临床样品中对它们加以检测和定量。虽然过去十年对若干小RNA分子已有很多了解，但是仍有问题尚未阐明。它们的 小尺寸可能带来问题，特别是对候选小RNA分子进行鉴定和证实有效的方面以及检测和定 量小RNA分子的已知种类的方面。传统技术由于灵敏度方面的问题不足以满足这些需求。 因此，人们需要开发更快更灵敏的方法来检测小RNA分子。

发明内容
本发明涉及对寡核苷酸分子进行快速检测和定量的组合物和方法，所述寡核苷 酸分子例如短核酸，例如小干扰RNA和其它短核酸分子。本发明部分基于下述发现对包 含寡核苷酸结合区域的反转录引物的设计对灵敏度来说高度重要。本发明增加的灵敏度 导致能够检测单个扩增分子。因此，本发明的方法和组合物提供了改进的、高度灵敏的方 法，用于定量检测短RNA，例如但不限于脱氧核糖核苷酸构成的寡核苷酸和核糖核苷酸构 成的寡核苷酸，包括但不限于，小RNA分子，例如非翻译功能性RNA、非编码RNA(ncRNA)、 小非信使 RNA (snmRNA)、siRNA、tRNA、微小非编码 RNA (tncRNA)、小调节 RNA (smRNA)、 snoRNA、stRNA, snRNA、miRNA,其包括但不限于 miRNA 前体，例如初级 miRNA(pri-miRNA) 和前体 miRNA(pre-miRNA)等(见，例如 Eddy，NatureReviews Genetics 2 :919_29，2001 ； Storz, Science 296 :1260_63, 2002 ；Buckingham, Horizon Symposia Understanding the RNAissance 1-3,2003)。因此，在一个方面，本发明涉及具有改进的灵敏度的、在样品中鉴定或定量寡核苷酸分子的方法，所述方法包括将反转录引物与寡核苷酸分子杂交，其中，反转录引物包含 具有寡核苷酸识别序列的寡核苷酸分子结合部分，所述序列包含位于3’区域与寡核苷酸分 子的区域互补的至少2个核苷酸以及位于5’区域的包含至少2个核苷酸的延伸尾；用第一 延伸酶延伸杂交的反转录引物，产生反转录产物；将正向引物与反转录产物杂交，其中正向 引物包含寡核苷酸分子结合部分，所述部分包含与寡核苷酸分子的区域相同的至少2个核 苷酸；用第二延伸酶延伸杂交的正向引物，产生第一扩增子；将反向引物与第一扩增子杂 交；用第二延伸酶延伸杂交的反向引物，产生与第一扩增子互补的第二扩增子；检测扩增 产物；以及由此对寡核苷酸分子进行鉴定或定量。该反应可以但不必须包含实时检测。在 某些实施方式中，扩增步骤包含多路技术。
所述方法可用于快速检测和定量寡核苷酸分子，例如，小RNA分子、DNA分子、经修 饰的RNA分子、经修饰的DNA分子、适配体、核酶、诱饵(decoy)寡核苷酸、免疫刺激性的寡 核苷酸。寡核苷酸具有包含10-30个核苷酸的长度，它们可被化学修饰。寡核苷酸还可以 是双链分子，例如siRNA。在另一方面，本发明提供了检测siRNA(其能通过RNAi抑制至少 一种靶基因)的方法。本发明并不限于任何类型的siRNA或靶基因或核苷酸序列。例如， 靶基因可以是细胞的基因、内源基因、病原体相关基因、病毒基因或癌基因。所述方法可用于在体液(例如血浆、脑脊液和尿)中对寡核苷酸分子进行直接检 测和定量，而无须提取RNA，所述分子例如，小RNA分子、DNA分子、经修饰的RNA分子、经修 饰的DNA分子、适配体、核酶、诱饵寡核苷酸、免疫刺激性的寡核苷酸。本发明公开了反转录酶引物，其经工程改造以包含特定的区域，例如，SRS(siRNA 相关序列)序列、探针序列和反向引物序列。探针序列位于选自正向引物和反向引物之间 或者反转录酶引物内部的位置。还公开了第一引物组，其包括正向引物和相应的反向引物， 每条都有不寻常地短寡核苷酸结合部分。第一引物和第二引物是未经修饰的引物。或者， 第一引物和第二引物是经修饰的引物。修饰的例子包括但不限于，使用LNA残基、肽核酸残 基、2’修饰的RNA残基、经修饰的核碱基(nucleobases)或其组合。在某些实施方式中，将寡核苷酸靶与反转录酶引物、包含正向引物和反向引物的 第一引物组、第二引物组和延伸酶组合，形成单一反应组合物。单一反应组合物在合适的条 件下发生反应，产生第一产物、第一扩增子、额外的第一扩增子、第二扩增子。在某些实施方 式中，检测第一扩增子、额外的第一扩增子、第二扩增子或其组合，对寡核苷酸鉴定和/或 定量。在某些实施方式中，检测包括整合报道基团(integral reporter group)、报道探针、 嵌入剂或其组合。在某些实施方式中，扩增、检测和定量包含Q-PCR或另外的实时技术。某 些实施方式包含终点检测技术。在另一实施方式中，杂交发生在两种分别的反应混合物中，其中，反转录酶引物存 在于第一反应混合物中，其被用于产生反转录产物；而正向和反向引物存在于第二反应混 合物中，其中，来自第一反应混合物的反转录产物在第二反应混合物中被用作为正向和反 向引物的模板。在某些实施方式中，本发明公开的方法包括形成至少两种不同的反应组 合物，例如但不限于，第一反应组合物和第二反应组合物。一些实施方式还至少包括第三反 应组合物。在一些实施方式中，针对每种寡核苷酸靶，两组引物组用于在至少两种不同反应 组合物(包括但不限于，第一反应组合物和多种不同的第二反应组合物，它们可以但并不 必须存在于相同的反应容器中)中进行的三个或四个扩增步骤中。根据此类方法，在第一反应组合物中进行的扩增步骤典型包括(i)使用反转录引物、第一引物组的反向引物产 生第一产物，(ii)使用第一产物作为模板，使用第一引物组的相应正向引物，产生第一扩增 子，以及任选地(iii)使用相应第一引物组的额外正向和反向引物，产生额外的第一扩增 子。当第一阶段完成后，典型地，通过组合(i)反应的第一反应组合物的全部或部分，(ii) 第二引物组，其可以但并不一定包括通用引物、包含独特杂交标签的引物或两者，(iii)第 三延伸酶以及任选地(iv)报道探针，形成第二反应组合物。在合适的反应条件下，使用额 外的第一扩增子作为模板，产生第二扩增子。在一种实施方式中，反转录酶引物的寡核苷酸分子结合部分包含与寡核苷酸分子 至少90%互补的核苷酸序列。在另一实施方式中，反转录酶引物的寡核苷酸分子结合部分 包含与寡核苷酸分子互补的大约2-17个核苷酸，其中所述寡核苷酸分子长大约4-19个核 苷酸。在一种实施方式中，反向引物的寡核苷酸分子结合部分包含与寡核苷酸分子的区域 互补的大约2-30个核苷酸。在一种实施方式中，正向引物的寡核苷酸分子结合部分包含与 寡核苷酸分子的区域具有相同序列的大约2-30个核苷酸。目前的教导还提供了特别有用于公开的方法中的报道探针。但是本领域技术人员 将知道，传统的报道探针也可用于公开的方法。在一种实施方式中，检测扩增产物的步骤包 括用第一检测探针检测第一扩增子，用第二检测探 针检测第二扩增子以及用多种检测探针 检测第一和第二扩增子两者。在一种实施方式中，第一检测探针是双链DNA嵌入剂。在一 种实施方式中，第一检测探针是SYBR Green0在另一实施方式中，第一和第二检测探针是 信号发射探针，它们使用Watson-Crick碱基配对与寡核苷酸分子结合部分结合。信号发射 探针的例子包括但不限于，FAM、VIC、JOE、NED、CY5染料、CY3-染料、TAMRA标记探针和MBG 探针、蝎探针(scorpion probe)和分子信标(beacon)。在一种优选的实施方式中，检测探 针包含FAM/TAMRA检测基团。本发明的方法出人意料地实现了对寡核苷酸分子加以定量的灵敏度的提高。在 一种实施方式中，使用信号强度读出法(readout)进行检测时，灵敏度以至少10_100，000 倍的因子或者至少100-10，000倍的因子提高。在另一实施方式中，对寡核苷酸加以定量 的灵敏度被提高到能检测大约1个分子至大约IXIOki个分子以及大约100个分子至大约 1 X IO9个分子的浓度范围的寡核苷酸分子。本发明的方法和组合物可用于在将寡核苷酸分子施用给受试者之后检测寡核苷 酸分子，施用通过临床相关途径进行，其选自但不限于气管内、鼻内、脑内、鞘内、结直肠、口 月艮、肌内、关节内、局部(包括阴道)、肺递送、眼内、腹膜内、静脉内和皮下施用构成的组。可 用能协助递送至靶细胞和/或协助被靶细胞吸收的药物载体来配制寡核苷酸分子。这选自 但不限于中性脂质体、阳离子脂质体或脂复合体(Iipoplexes)、阳离子聚合物或多聚复 合体(polyplexes)、中性聚合物、纳米颗粒、双链RNA结合蛋白、磷酸钙、细胞穿透肽、病毒 蛋白和病毒颗粒、抗体和空细菌包膜。待使用本发明的方法测试的样品选自流体、组织、细 胞和肿瘤构成的组。本发明还提供了可用于开展公开的方法的试剂盒。在某些实施方式中，试剂盒包 含第一引物组和第一延伸酶。在某些实施方式中，公开的试剂盒还包含第二延伸酶、第三延 伸酶、第二引物组、报道探针、报道基团、反应容器或其组合。本发明教导的这些和其它特征 在本文中有所示出。
附图简述本领域技术人员将理解，下文中的附图仅用于阐述目的，而非意欲以任何方式限 制本发明教导的范围。

图1显示了使用两步RT-PCR对血浆中的SiRNA进行定量；图2显示了对一步RT-PCR的比较；图3显示了基于两步RT-PCRJi siRNA ND9227进行的检测的比较，其中使用SYBR Green I或FAM/TAMRA标记的探针作为读出剂；图4显示了对大鼠肺中siRNA进行绝对定量的结果；图5是使用FAM/TAMRA探针进行的siRNA检测的示意图；以及图6是反转录引物所需的最小序列的示意图。发明详述应当理解，前述一般性描述和下文的详细描述都仅是示例性和解释性的，它们并 不意欲限于本发明教导的范围。在本申请中，除非有特别的声明，使用单数时也包括复数。 本文所用的标题仅用于组织的目的，而不应以任何方式将其解释为限制所描述的主题。为 了任何目的，本申请提到的所有文献和类似材料，包括但不限于专利、专利申请、文章、书 籍、论文和互联网网页都明确通过引用整体并入本文。当并入的文献和类似材料中一份或 多份与本申请相矛盾时，包括但不限于定义的术语、术语使用、描述的技术等方面矛盾时， 以本申请为准。I.定义术语“短干扰核酸”、“siRNA”、“短干扰RNA”、“siRNA”、“短干扰核酸分子”、“短干 扰寡核苷酸分子”或“经化学修饰的短干扰核酸分子”在本文中使用时表示能抑制或下调 基因表达或病毒复制的任何核酸分子，例如通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi” 或基因沉默来实现；见例如 Zamore 等人，2000，Cell, 101,25 33 ；Bass, 2001, Nature, 411, 428 429 ；Elbashir 等人，2001，Nature, 411,494 498 和 Kreutzer 等人，国际 PCT 公开 No. WO 00/44895 ；Zernicka-Goetz 等人，国际 PCT 公开 No. WO 01/36646 ；Fire,国际 PCT 公 开 No. WO 99/32619 ；Plaetinck 等人，国际 PCT 公开 No. WO 00/01846 ；Mello 和 Fire，国际 PCT 公开 No. W001/29058 ；Deschamps-Depaillette,国际 PCT 公开 No. WO 99/07409 和 Li 等人，国际 PCT 公开 No. WO 00/44914 ；Allshire, 2002, Science, 297,18181819 ；Volpe 等 人，2002，Science,297,1833 1837 ；Jenuwein,2002, Science,297，2215 2218 和 Hall 等 A,2002, Science,297,2232 2237 ；Hutvagner 禾Π Zamore，2002， Science,297,2056 60; McManus 等人，2002，RNA,8,842850 ；Reinhart 等人，2002，Gene&Dev.，16，1616 1626 和 Reinhart&Bartel, 2002, Science, 297,1831)。本发明的siRNA分子的非限制性例子示于本 文图4、6和表II和III中。例如，siRNA可以是包含自身互补的正义和反义区域的双链寡 核苷酸分子，其中，所述反义区域包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷 酸序列，及正义区域具有相应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。可从两条分别的寡核 苷酸来装配siRNA，在这种情况下一条链是正义链，另一条是反义链，其中反义和正义链是 自身互补的(即，每条链包含与另一条链中的核苷酸序列互补的核苷酸序列；例如，在这种 情况下反义链和正义链形成双链体或双链结构，例如，其中双链区域有大约19个碱基对)； 反义链包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，正义链包含对应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列。或者，从单条寡核苷酸装配siRNA，其中，siRNA的自身互补正义和反义区域通过基于核酸或不基于核酸的连接子相连。siRNA可以是具有双链体、 不对称双链体、发卡或不对称发卡二级结构的寡核苷酸，其具有自身互补的正义和反义区 域，其中，所述反义区域包含与各靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列， 和正义区域(具有与靶核酸序列或其部分相对应的核苷酸序列)。siRNA可以是下述环状单 链寡核苷酸，其具有两个或多个环结构和包含自身互补的正义和反义区域的茎，其中，所述 反义区域包含与靶核酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列，正义区域具有对 应于靶核酸序列或其部分的核苷酸序列，并且，其中，所述环状寡核苷酸可经体内或体外加 工，产生能介导RNAi的活性siRNA分子。siRNA还可包含下述单链寡核苷酸，其具有与靶核 酸分子或其部分中的核苷酸序列互补的核苷酸序列(例如，在这种情况下此类siRNA分子 不需要在所述siRNA分子内存在与靶核酸序列或其部分对应的核苷酸序列)，其中，所述单 链寡核苷酸还可包含末端磷酸基团，例如5’-磷酸(见，例如，Martinez等人，2002，Cell.， 110,563574 和 Schwarz 等人，2002，Molecular Cell，10，537568)或 5'，3' -二磷酸。在 某些实施方式中，本发明的siRNA分子包含分开的正义和反义序列或区域，在这种情况下 所述正义和反义区域通过本领域已知的核苷酸或非核苷酸连接子分子共价连接，或者通过 离子相互作用、氢键、范德华相互作用、疏水相互作用和/或堆叠(stacking)相互作用非共 价连接。在某些实施方式中，本发明的siRNA分子包含与靶基因的核苷酸序列互补的核苷 酸序列。在另一实施方式中，本发明的siRNA分子以能抑制靶基因的表达的方式与靶基因 的核苷酸序列相互作用。在本文中使用时，siRNA分子并不限定于仅含RNA的那些分子，其 还可包括经化学修饰的核苷酸和非核苷酸。在某些实施方式中，本发明的短干扰核酸分子 缺乏含2’-羟基(2’-OH)的核苷酸。申请人在某些实施方式中描述了下述短干扰核酸，其 不需要有具有2’ -羟基的核苷酸存在来介导RNAi，因此，本发明的短干扰核酸分子任选地 不包括任何核糖核苷酸(例如，具有2’-0H的核苷酸)。但是，此类在该siRNA分子内部无 须存在核糖核苷酸来支持RNAi的siRNA分子可具有含具有2’-0H基团的一个或多个核苷 酸的，连接的一个或多个连接子或者其它连接或联结的基团、基元或链。任选地，siRNA分子 可在核苷酸位置的大约5、10、20、30、40或50%上包含核糖核苷酸。本发明的经修饰的短干 扰核酸分子还可被称为短干扰经修饰寡核苷酸“siMON”。在本文中使用时，术语siRNA与用 于描述能介导序列特异性RNAi的核酸分子的其它术语等同，例如，短干扰RNA(SiRNA)、双 链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、短发卡RNA(shRNA)、短干扰寡核苷酸、短干扰核酸、短干扰 经修饰寡核苷酸、经化学修饰的siRNA、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。此外，在本文中 使用时，术语RNAi与用于描述序列特异性RNA干扰的其它术语等同，例如转录后基因沉默、 翻译抑制或外遗传(epigenetics)。例如，本发明的siRNA分子可用于在转录后水平或转录 前水平上对基因进行外遗传性沉默。在一种非限制性实施例中，通过本发明siRNA对基因 表达的外遗传调控可由siRNA介导的染色质结构修饰(改变了基因表达)导致(见，例如， Verdel 等人，2004，Science，303，672 676 ；Pal-Bhadra 等人，2004，Science，303，669 672 ； Allshire,2002, Science,297,1818 1819 ；Volpe ^ 人，2002，Science，297，1833 1837 ； Jenuwein, 2002，Science, 297，2215 2218 和 Hall 等人，2002，Science, 297，2232 2237)。
术语“扩增子”在本文中以广义使用，其包括公开的方法的扩增产物。第一产物 (包括但不限于反转录产物)、第一扩增子、额外的第一扩增子、第二扩增子或其组合都落入术语扩增子的意欲范围。术语“杂交”和“退火”以及这些术语的其它时态和词型可互换使用，它们表示 一种核酸与另一核酸的核苷酸碱基配对相互作用，导致双链体、三链体或其它更高数量级 的结构形成。一级相互作用典型地是核苷酸碱基特异性的，例如A:T、A:U和G:C，其通过 Watson-Crick和Hoogsteen型氢键实现。在某些实施方式中，碱基堆叠和疏水相互作用也 有助于双链体稳定性。报道探针和引物与互补及基本互补的靶序列杂交的条件是本领域公 知的，例如，Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, B. Hames 禾口 S. Higgins 编著，IRL Press, Washington, D. C. (1985)禾口 J. Wetmur 禾口 N. Davidson，Mol. Biol. 31 :349et seq. (1968)中所述。通常，此类退火是否发生受下述因素的影响引物和报道探针与它们 的互补序列的杂交区域的长度、PH、温度、是否存在一价和二价阳离子、G和C核苷酸在杂交 区域中的比例、介质粘度以及变性剂的存在，等等。这些变量影响杂交所需的时间。引物或 报道探针中某些核苷酸类似物或沟槽结合子(groove binder)的存在也会影响到杂交条 件。因此，优选的退火条件将取决于特定应用。但是，此类条件可由本领域普通技术人员常 规确定，而无须过多实验。在本文中使用时，术语“寡核苷酸”、“多核苷酸”、“核酸”和“核酸序列”通常可互 换使用，其包括核苷酸单体的单链和双链聚合物，包括通过核苷酸间磷酸二酯键，或者核苷 酸间类似物以及联结的平衡离子，例如H\ NH4+、三烷基铵、四烷基铵、Mg2+、Na+等，连接的 2’ -脱氧核糖核苷酸(DNA)和核糖核苷酸(RNA)。核酸可完全由脱氧核糖核苷酸构成、完 全由核糖核苷 酸构成或者是其嵌合的混合物。核苷酸单体单元可包含本文所述的任何核苷 酸，其包括但不限于天然存在的核苷酸和核苷酸类似物。核酸大小典型地在数个单体单元 (例如，5-40，本领域中一些时候称其为寡核苷酸)至数千单体核苷酸单元的范围内。除非 上下文显然另有指明或者明确指出不同，核酸序列都以从左到右的方向从5’到3’向显示， 除非上下文显然另有指明，在这些序列中，“A”指腺嘌呤，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟嘌呤，“T” 指胸腺嘧啶，“U”指尿嘧啶。术语“核苷酸碱基”在本文中使用时指经取代或未经取代的一个或多个芳香族的 环。在某些实施方式中，一个或多个芳香族的环含有氮原子。在某些实施方式中，核苷酸 碱基能与互补的核苷酸碱基形成Watson-Crick或Hoogsteen型氢键。示例性的核苷酸碱 基及其类似物包括但不限于天然存在的核苷酸碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、5-甲基胞嘧 啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶，以及天然存在的核苷酸碱基的类似物，其包括但不限于7-脱氮腺 嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-8-氮杂腺嘌呤、N6-. DELTA. 2-异 戊烯基腺嘌呤(6iA)、N6-. DELTA. 2-异戊烯基_2_甲基硫代腺嘌呤(2ms6iA)、N2- 二甲基 鸟嘌呤(dmG)、7-甲基鸟嘌呤(7mG)、肌苷、水粉蕈素、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、2， 6- 二氨基嘌呤、次黄嘌呤、假尿苷、假胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、异胞嘧啶、异 鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、2-硫代嘧啶、6-硫代鸟嘌呤、4-硫代胸腺嘧啶、4-硫代尿嘧啶、 O6-甲基鸟嘌呤、N6-甲基腺嘌呤、O4-甲基胸腺嘧啶、5，6_ 二氢胸腺嘧啶、5，6_ 二氢尿嘧啶、 吡唑并[3,4-D]嘧啶(见，例如U. S. Pat. Nos. 6，143，877和6，127，121以及PCT公开申请 WO 01/38584)、乙烯基腺嘌呤(ethenoadenine)、吲哚(例如硝基吲哚和4-甲基吲哚)和 批口各(例如销基批口各)。可在例如 Fasman，1989，Practical Handbook of Biochemistry andMolecular Biology,pp. 385-394,CRC Press,Boca Raton,Fla.及其中提到的文献中找到某些示例性的核苷酸碱基。术语“核苷酸”在本文中使用时表示包含与糖(例如核糖、阿拉伯糖、木糖和吡喃 糖)及其糖类似物的C-I'碳连接的核苷酸碱基的化合物。术语核苷酸还包括核苷酸类似 物。糖可以是经取代或未经取代的。经取代的核糖包括但不限于其中一个或多个碳原子， 例如2’ -碳原子，被一个或多个相同或不同-R、-OR、-NR. sub. 2叠氮化物、氰或卤代基团 取代的那些核糖，其中，每个R独立地是H、C1-C6烷基、C2-C7酰基或C5-C14芳基。示例性的 核糖包括但不限于2' -(C1-C6)烷氧基核糖、2' -(C5-C14)芳氧基核糖、2'，3' -二脱 氢核糖、2'-脱氧-3'-卤代核糖、2'-脱氧-3'-氟核糖、2'-脱氧-3'-氯核糖、 2'-脱氧-3'-氨基核糖、2'-脱氧-3' -(C1-C6)烷基核糖、2'-脱氧_3' -(C1-C6) 烷氧基核糖和2'-脱氧-3' -(C5-C14)芳氧基核糖、核糖、2'-脱氧核糖、2'，3' -二 脱氧核糖、2'-卤代核糖、2'-氟核糖、2'-氯核糖和2'-烷基核糖，例如，2' -0-甲 基，4' -α-异头核苷酸，1' -α-异头核苷酸，2' -4'-和3' -4'-连接的和其它“经 锁定的”或“LNA”，双环糖修饰物(见例如PCT公开申请Nos. W098/22489、WO 98/39352和 WO 99/14226 以及 Braasch 和 Corey，Chem. Biol. 8 1-7，2001)。“LNA，，或“经锁定的核酸” 是构象上被锁住的DNA类似物，从而核糖环受到亚甲基连接的限制，所述亚甲基连接位于 例如但不限于2’ -氧和3’或4’ -碳或3’ -4’ LNA和2’ -5’骨架之间的。这种连接导致的 构象限制通常增加了互补序列的结合亲和性，并且增加了此类双链体的热稳定性。寡核苷 酸内的示例性的LNA糖类似物包括但不限于其中B是任何核苷酸碱基的结构。
核糖的2’或3’位置可被修饰，其包括但不限于氢、羟基、甲氧基、乙氧基、烯丙氧 基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基、叠氮基、氰基、氨基(amido)、亚 氨基、氨基(amino)、烷氨基、氟、氯和溴。核苷酸包括但不限于天然D光学异构体以及L 光学异构体形式(见，例如 Garbesi Nucl. Acids Res. 21 4159-65 (1993) ；Fujimori (1990) J. Amer. Chem. Soc. 112 7435 ；Urata, (1993)Nucleic AcidsSymposium Ser. No. 29 :69_70)。 当核苷酸碱基是嘌呤(例如A或G)时，核糖的糖与核苷酸碱基的N. sup. 9-位连结。当核 苷酸碱基是嘧啶(例如C、T或U)时，戊糖的糖与核苷酸碱基的Nl-位连结，但假尿苷例外， 其中戊糖的糖与尿嘧啶核苷酸碱基的C5位连结(见例如Kornberg和Baker，(1992)DNA Replication,2nd Ed. , Freeman,San Francisco, Calif.)。核苷酸的戊糖碳中的一个或多个可被具有下述结构式的磷酸酯取代其中，α是 O至4的整数。在某些实施方式中，α是2，磷酸酯连结到戊糖的3’或5’碳上。在某些实 施方式中，核苷酸是这样一些，其中，核苷酸碱基是嘌呤、7_脱氮嘌呤、嘧啶或其类似物。“核 苷酸5，-三磷酸酯”指在5，位具有三磷酸酯的核苷酸，其一些时候被称为“ΝΤΡ”或“dNTP” 以及“ddNTP”，以特别说明核糖的结构特征。三磷酸酯基团可包括对若干氧的硫取代，例如， α -硫代核苷酸5，-三磷酸酯。关于核苷酸化学的综述可在Shabarova，Ζ.和Bogdanov， A. Advanced Organic Chemistry of NucleicAcids, VCH, New York,1994 禾口 Blackburn 禾口 Gait等中找到。术语“核苷酸类似物”在本文中使用时表示这样的实施方式，其中，核苷酸 的戊糖或核苷酸碱基或一个或多个磷酸酯可被其各自的类似物替换。在某些实施方 式中，示例性的戊糖类似物是上文描述的那些。在某些实施方式中，核苷酸类似物具 有上文所述的核苷酸碱基类似物。在某些实施方式中，示例性的磷酸酯类似物包括但不限于烷基磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸 酉旨、石西代 粦酸酉旨(phosphoroselenoates)、二 石西代 粦酸酉旨(phosphorodiselenoates)、 phosphoroanilothioates、苯胺磷酸酯(phosphoroanilidates)、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯 (boronophosphates)等，并可包括联结的平衡离子。核苷酸类似物的定义中还包括可聚合成寡核苷酸类似物的单体，寡核苷酸类似物 中的DNA/RNA磷酸酯或糖磷酸酯骨架的至少一部分被不同类型的核苷酸间连接代替。示例 性的寡核苷酸类似物包括但不限于肽核酸(PNA)，其中，寡核苷酸的糖磷酸酯主干被包含 酰胺键的肽主干代替。应当理解，除非上下文显然另有指明，术语“PNA”在本文中使用时包 括假互补 PNA(pcPNA)(见，例如，Datar 和Kim，Concepts in AppliedMolecular Biology, Eaton Publishing, ffestborough, Mass. ,2003,特别是 74—75 页；Verma 和 Eckstein, Ann. Rev.Biochem. 67 :99_134，1998 ；Goodchild, Bioconj. Chem.，1 :165_187，1990 ；Braasch 和 Corey, Methods23 :97_107，2001 ；Demidov 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. 99 :5953_58，1999)。核酸包括但不限于基因组DNA，cDNA, hnRNA, mRNA, rRNA, tRNA,小RNA分子，其包 括但不限于miRNA和miRNA前体，siRNA，stRNA, snoRNA,其它非编码RNA (ncRNA)，片段化的 核酸，从核、胞质、亚细胞的细胞器(例如线粒体或叶绿体)获得的核酸以及从生物样品上 或之中存在的微生物或DNA病毒或RNA病毒获得的核酸。核酸可由单种类型的糖基元构成，例如，在RNA和DNA的情况下；或者可由不同 糖基元的混合物构成，例如，在RNA/DNA嵌合体的情况下。在某些实施方式中，核酸是根据 下述结构式的核糖寡核苷酸和2’ -脱氧核糖寡核苷酸其中每个B独立地是核苷酸或者 核苷酸类似物的碱基基元，例如，嘌呤、7-脱氮嘌呤、被一个或多个经取代的烃类取代的嘌 呤或嘌呤类似物、嘧啶、被一个或多个经取代的烃类取代的嘧啶或嘧啶类似物、或核苷酸 类似物；每个m定义各核酸的长度，其可从零至数千、数万或者更多；每个R独立选自包含 氢、卤素、-R"、-0R"和-NR" R"，其中每个R"独立地是(C1-C6)烷基、(C2-C7)酰基或 (C5-C14)芳基、氰基、叠氮基的组，或者两个相邻的R—起形成键，使得核糖是2’，3’-二脱 氢核糖；并且每个R’独立地是羟基或者其中α是O、1或2。在上文阐述的核糖寡核苷酸和2’ -脱氧核糖寡核苷酸的某些实施方式中，核苷酸 碱基B与如上文所述的糖基元的Cl’碳共价连结。术语“核酸”、“核酸序列”、“多核苷酸”和 “寡核苷酸”还包括核酸类似物、多核苷酸类似物和寡核苷酸类似物。术语“核酸类似物”、 “多核苷酸类似物”和“寡核苷酸类似物”可互换使用，在本文中它们表示含有核苷酸类似 物或磷酸酯类似物或戊糖类似物的核酸。核酸类似物的定义中还包括这样的核酸，其中， 磷酸酯或糖磷酸酯连接被其它类型的连接代替，例如，N-(2-氨基乙基)-甘氨酸酰胺和其 它酰胺(见例如 Nielsen 等人，1991，Science 254 1497-1500 ；PCT 公开 No. WO 92/20702 ； U. S. Pat. Nos. 5，719，262 和 5，698，685)；吗啉代(见例如 U. S. Pat. No. 5，698，685 ； U. S. Pat. No. 5，378，841 ；U. S. Pat. No. 5，185，144)；氨基甲酸酯(见例如 Stirchak & Summerton, J. Org. Chem. 52 -.4202,1987)；亚甲基(甲基亚氨基)(见例如 Vasseur 等人， J.Am· Chem. Soc. 114:4006,1992) ；3'-硫甲缩酸(3' -thioformacetals)(见例如 Jones 等人，1993，J. Org. Chem. 58 2983)；氨基磺酸酯(见例如 U. S. Pat. No. 5，470，967) ；2-氨 基乙基甘氨酸，通常称为PNA(见例如PCT公开No. WO 92/20702 ；Nielsen, Science 254 1497-1500，1991)和其它(见例如 U. S. Pat. No. 5，817，781 ；Frier&Altman, Nucl. AcidsRes.25:4429，1997以及其中引用的文献)。磷酸酯类似物包括但不限于(i)Cl_C4烷基磷酸酯，例如甲基磷酸酯；(ii)氨基磷酸酯；(Ui)C1-C6烷基-磷酸三酯；(iv)硫代磷 酸酯和(ν) 二硫代磷酸酯。还见 Scheit，Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, (1980) ；Englisch, Agnew.Chem. Int. Ed. Engl. 30 :613_29,1991 ；Agarwa1, Protocols for Oligonucleotides and Analogs,Humana Press,1994 禾口 S. Verma 禾口 F. Eckstein,Ann. Rev. Biochem. 67 :99_134，1999。术语“报道基团”在本文中以广义使用，其表示任何可被鉴定的标签、标记或基元。 本领域技术人员将知道，很多不同种类的报道基团可用于本发明的教导中，可独立使用或 与一种或多种不同的报道基团组合使用。术语报道基团还包括多元间接报道系统的元件， 这包括但不限于，亲和性标签；以及多元相互作用报道基团或报道基团对，例如，荧光报道 基团-淬灭剂对，这包括但不限于，包含荧光淬灭剂和黑暗淬灭剂(也被称为非荧光淬灭剂 (NFQ))的对。术语“阈值循环”或“CT”在提到定量或实时分析方法时使用，就本发明教导的目 的而言，其表示待分析物、扩增子及包括但不限于它们中任何的一条或两条链的量达到固 定阈值或限制时的分次的循环数。可通过使用者人工设定阈值，或者通过实时仪器的软件 来确定。示例性的实时仪器包括ABI PRISM 7000序列检测系统、ABI PRISM 7700序列 检测系统、ABI PRISM 7900HT序列检测系统、ABI PRISM 7300实时PCR系统(Applied Biosystems) >Smart Cycler 系统(Cepheid,由 FisherScientific 提供)>LightCycler 系 统(Roche Molecular)和 Mx4000 (Stratagene，La Jolla，Calif.)。在某些实施方式中，此 类实时定量包含报道探针(其包括但不限于传统的报道探针和本发明教导的报道探针)， 嵌入染料(这包括但不限于FAM/TAMRA探针、溴化乙啶和SYBR Green I或其等同物)或 者此类报道探针和嵌入染料。关于实时分析的描述可在Essentials of Real Time PCR， Applied Biosystems P/N 105622,2002 ；PCR :The Basics from background to bench, McPherson和 Moller，BiosScientific Publishers Limited,Oxford UK,2000(" PCR :The Basics")，特别是 3. 3 部分；Real-Time PCR :An Essential Guide, Edwards 等人，eds.， Horizon Bioscience, Norwich, UK 禾口 Handbook of Fluorescent Probes andResearch Products,9. sup. th ed. ,R. Haugland,Molecular Probes,Inc. ,2002(" Molecular Probes Handbook")，特别是8. 3部分等中找到。术语“第一产物”指这样的核苷酸序列，其在当第一引物组的反向引物(与相应靶 核苷酸的第二区域杂交)在引物延伸反应中被延伸酶延伸时产生。当靶寡核苷酸是RNA分 子，例如但不限于小RNA分子时，第一产物可被称为反转录产物。本领域技术人员将知道， 根据本发明教导，第一产物的产生至少与传统RT-PCT技术中产生逆转录本类似。在本文中使用时，术语“寡核苷酸结合部分”指正向引物中与相应靶的第一区域相 同的序列，或者反向引物中与相应靶的第二区域互补的序列。本领域技术人员将知道，当靶 是多核苷酸时，术语“寡核苷酸结合部分”可与术语结合寡核苷酸部分互换使用，当靶是小 RNA分子时，术语“小RNA分子结合部分”可与术语寡核苷酸结合部分互换使用。因此，术 语寡核苷酸结合部分、结合寡核苷酸部分和小RNA分子结合部分在分别提到一般性的靶序 列、寡核苷酸靶和小RNA分子靶时使用。术语“引物结合部分”指第一引物组的正向引物或 反向引物中与第二引物组中的相应引物特异性杂交的序列。典型地，第二引物组的引物被用于使第一产物、第一扩增子、额外的第一扩增子或其组合得以扩增，这包括但不限于包括 多个扩增循环，例如PCR的技术。在某些实施方式中，第二引物组的引物被用于扩增相应的 第一产物、相应的第一扩增子的链、相应的额外的第一扩增子的链、相应的第二扩增子的链 或其组合。术语“通用碱基”或“通用核苷酸”在本文中一般可互换使用，其表示可取代寡核苷 酸中天然核苷酸或天然碱基中超过一个的核苷酸类似物(包括核苷类似物)。通用碱基典 型含有芳香环基元，其可以含有或可以不含氮原子，并且通常使用芳香环堆叠，以稳定双链 体。在某些实施方式中，通用碱基可与戊糖的c-r碳共价连结以形成通用核苷酸。在某些实 施方式中，通用碱基不与其它核苷酸碱基形成特异性的氢键。在某些实施方式中，核苷酸碱 基可通过疏水堆叠与相同核酸链上相邻的核苷酸碱基相互作用。通用核苷酸和通用碱基包 括但不限于脱氧-7-氮杂吲哚三磷酸酯(d7AITP)、脱氧异喹诺酮(deoxyisocarbostyril) 三磷酸酯(dICSTP)、脱氧丙炔基异喹诺酮三磷酸酯(dPICSTP)、脱氧甲基-7-氮杂吲哚 三磷酸酯(dM7AITP)、deoxylmPy triphosphate (dlmPyTP) (dlmPyTP)、脱氧 PP 三磷酸酯 (dPPTP)、脱氧丙炔基-7-氮杂吲哚三磷酸酯(dP7AITP)、3-甲基异喹诺酮(MICS)、5_甲基 异二价碳基(5-methyl isocarbyl) (5MICS)、咪唑4_甲酰胺、3-硝基吡咯、5-硝基吲哚、次 黄嘌呤、肌苷、脱氧肌苷、5-氟脱氧尿苷、4-硝基苯并咪唑(4-nitrobenzimidizole)和PNA 碱基，包括PcPNA碱基。关于通用碱基的描述可在Loakes，Nucl. Acids Res. 29 =2437-47, 2001 ；Berger 等人，Nucl. Acids Res. 28 :2911_14，2000 ；Loakes 等人，J. Mol. Biol. 270 426-35，1997 ；Verma 和 Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 67 :99_134，1998 ；公开的 PCT 申请 No. US02/33619 和 U. S. Pat. Nos. 6，433，134 和 6，433，134 等中找到。术语“寡核苷酸靶”、“靶寡核苷酸”或“靶”表示将要使用本发明教导的方法和试 剂盒对其身份、存在、不存在和/或量加以评估的核酸序列。在某些实施方式中，靶序列包 含寡核苷酸，其可包含或可不包含脱氧核糖核苷酸，或者RNA分子，例如miRNA前体，这包括 但不限于初级miRNA、前体miRNA或初级miRNA和前体miRNA。在一些实施方式中，寡核苷 酸靶包含小RNA分子，这包括但不限于miRNA、siRNA、stRNA、snoRNA、其它ncRNA等。术语“报道探针”指核苷酸、核苷酸类似物或者核苷酸及核苷酸类似物的序列，其 与扩增子结合或退火，当被检测时(包括但不限于强度或发射波长的变化)用于对相应 的靶寡核苷酸进行鉴定和/或定量。大多数报道探针可基于其作用模式加以分类，例如 但不限于核酸酶探针，包括但不限于TaqMan 探针(见例如Livak，Genetic Analysis BiomolecularEngineering 14 :143_149,1999 ；Yeung 等人’ BioTechniques 36 :266_75， 2004)；延伸探针，例如蝎引物、Lux 引物、Amplifluors等；杂交探针，例如分子信标、 Eclipse探针、点亮(light-up)探针、单标记报道探针的对、杂交探针对等；或其组合。在 某些实施方式中，报道探针包含酰胺键、LNA、通用碱基或其组合，并且包含茎_环和无茎报 道探针构型。某些报道探针是经单标记的，而其它一些报道探针是双标记的。在相邻杂交 探针之间包含FRET的双探针系统也在术语报道探针的意欲范围内。在某些实施方式中，报道探针包含荧光报道基团、淬灭剂报道基团(包括但不限 于黑暗淬灭剂和荧光淬灭剂)、亲和性标签、杂交标签、杂交标签互补体或其组合。在某些实 施方式中，包含杂交标签互补体的报道探针与相应杂交标签退火，多组分报道基团的成员 之一与包含多组分报道基团的相应成员的报道探针结合，或其组合。示例性报道探针包括TAM/FAMRA探针、TaqMan探针；蝎探针(也被称为蝎引物)、Lux 引物、FRET引物、Ec 1 ipse 探针、分子信标，包括但不限于基于FRET的分子信标、多色分子信标、适配体信标、PNA信标 和抗体信标；经报道基团标记的PNA钳夹、经报道基团标记的PNA开启子(openers)、经报 道基团标记的LNA探针以及包含纳米晶体的探针、金属纳米颗粒和类似的杂交体探针(见 例如 Dubertret 等人，Nature Biotech. 19 365-70,2001 ；Zelphati 等人，BioTechniques 28 :304-15，2000)。在某些实施方式中，报道探针检测包含荧光偏振检测(见例如Simeonov 和 Nikiforov, Nucl. AcidsRes. 30 :e91，2002)。除了此类传统的报道探针之外，本发明教导的报道探针可用于对相应靶寡核苷 酸进行检测、鉴定和定量。本发明教导的报道探针包括缺口探针、某些嵌合探针和包含嵌 合序列的缺口探针。缺口探针被设计为与扩增子中是小RNA分子的缺口序列的副本的序 列(即，小RNA分子中与相应正向引物的寡核苷酸结合部分不相同并且与相应反向引物的 寡核苷酸结合部分也不互补，但位于这些序列之间的序列)特异性杂交。报道探针包括 (i)同源多聚探针以及(ii)异源多聚探针或嵌合探针。本发明教导的示例性同源多聚探 针包括但不限于，DNA探针、RNA探针、LNA探针、2' 0-烷基核苷酸探针、氨基磷酸酯探针 (phosphoroamidite)(例如但不限于，N3' -P5'氨基磷酸酯探针和吗啉代氨基磷酸酯探 针)、2'-氟-阿拉伯糖核酸(FANA)探针、环己烯核酸(CeNA)探针、三环-DNA(tcDNA)探 针和 PNA 探针(见，例如 Kurreck，Eur. J. Biochem.，270 1628-44，2003)。嵌合探针包括但 不限于DNA-PNA嵌合探针、DNA-LNA嵌合探针、DNA-2' 0-烷基嵌合探针等。在某些实施方 式中， 此类DNA嵌合探针包含通常(但非总是)位于探针5’末端的至少两个脱氧核糖核苷 酸。报道探针还包含报道基团，在某些实施方式中，其包含荧光报道基团-淬灭剂对。 在某些实施方式中，报道探针被设计为，仅与扩增子中发现的缺口序列或缺口序列的互补 序列杂交。本领域技术人员将知道，甚至存在人造“引物二聚体”(其一些时候伴随某些扩 增技术并且可能含有靶寡核苷酸共有的一些序列)时，也仅真正的扩增子将含有缺口序列 或其互补序列，并且由此可与公开的仅与缺口杂交的报道探针稳定杂交(假设适当的严紧 度条件，本领域技术人员理解，其可使用多种公知算法来计算或根据经验确定)。在某些实 施方式中，报道探针的扩增子结合部分被设计为，与扩增子中发现的缺口序列或缺口序列 互补序列杂交，并且也与缺口序列相邻的几个核苷酸杂交，典型地为扩增子缺口序列一侧 或两侧的一个或两个额外的核苷酸。在某些实施方式中，本发明公开了嵌合报道探针，其包含报道基团、两个或多个 脱氧核糖核苷酸以及下游的数个核苷酸类似物。典型地，选择此类核苷酸类似物，因为它 们不易用作为DNA聚合酶或反转录酶的模板，并且因此在引物延伸反应期间不会被扩增。 示例性的不可延伸的核苷酸类似物包括但不限于，经锁定的核酸(LNA)、肽核酸(PNA)和 2' 0-烷基核苷酸，例如但不限于2' 0-甲基核苷酸和2' 0-乙基核苷酸。在某些实施方 式中，嵌合报道探针包含报道基团和位于至少四个PNA上游的至少两个脱氧核糖核苷酸。 在某些实施方式中，嵌合报道探针包含荧光报道基团-淬灭剂对。在某些实施方式中，荧光 报道基团位于至少两个脱氧核糖核苷酸上游或者与两个脱氧核糖核苷酸中至少一个连结， 并且淬灭剂位于下游(或者反过来)，以形成荧光报道基团_淬灭剂对，其可以或可以不包 含荧光共振能量转移(FRET)。本领域技术人员将知道，此类报道探针可特别有用于某些检测技术，例如，核酸酶检验，这包括但不限于TaqMan. RTM.检验。公开的第一引物组包括正向引物和反向引物，每种包含显著地较短寡核苷酸结合 部分，即，正向引物含不超过2个的与第一靶区域具有相同序列的核苷酸，反向引物含不超 过2个的与第二靶区域互补的核苷酸。在某些实施方式中，正向引物的寡核苷酸结合部分 有2、3、4、5、6或7个核苷酸，其与靶的相应第一区域具有相同序列。在某些实施方式中，反 向引物的寡核苷酸结合部分有2、3、4、5、6或7个核苷酸，其与靶的相应第二区域互补。在 某些实施方式中，正向引物和反向引物还包含位于寡核苷酸结合部分上游的额外部分，且 可以(但不必一定)是引物结合部分。当其存在的时候，可将此类引物结合部分设计为与 相应第二引物组的各引物选择性杂交。因此，当并入扩增子时，使用相应的第二引物组和合 适延伸酶的额外扩增是可能的。本发明教导的第二引物组包含第一引物和第二引物，它们被设计为分别和扩增子 中与相应第一引物组的正向和反向引物的引物结合部分对应的区域退火。在某些实施方式 中，第二引物组的引物是通用引物。在某些实施方式中，第二引物组包含通用正向引物和通 用反向引物。在某些实施方式中，第二引物组的引物还包含杂交标签、亲和性标签、报道基 团或其组合。在某些实施方式中，杂交标签允许相应扩增子得以被鉴定。在某些实施方式 中，第二引物组的第一引物包含第一通用引导(priming)序列，同时相应第二引物组的第 二引物包含第二通用引导序列。在某些实施方式中，第二引物组的一条引物包含通用引导 序列，而相应第二引物组的另一条引物包含杂交标签，其包括但不限于，随后可用于鉴定相 应的扩增子的独特的杂交标签。本发明教导的第一引物组的引物、第二引物组的引物和报道探针的结合部分长 度足以允许与相应靶序列、相应扩增子的互补区域特异性退火。用于设计序列特异性核 酸引物和报道探针的标准是本领域公知的。关于核酸引物和报道探针设计的详细报道 可在 Diffenbach 禾口 Dveksler，PCRPrimer，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press (1995) ；R. Rapley, The Nucleic Acid Protocols Handbook (2000)，Humana Press， Totowa，N. J. ( " Rapley ) ;Schena 和 Kwok 等人，Nucl. Acid Res. 18 :999_1005 (1990) 等中找到。引物和报道探针设计软件程序也是商业可获得的，其包括但不限于=Primer Express, Applied Biosystems ；PrimerPremier and Beacon Designer 软 件，PREMIER Biosoft International, PaloAlto, Calif. ；Primer Designer 4, Sci—Ed 软件，Durham, N. C. ；PrimerDetective, ClonTech, Palo Alto, Calif. ；Lasergene, DNASTAR, Inc., Madison, Wis. ；Oligo 软 件，National Biosciences, Inc., Plymouth, Minn. ；iOligo, Caesar 软件,Portsmouth,N. H.禾口 RTPrimerDB (互联网上 realtimeprimerdatabase. ht. st 或 medgen31. urgent, be/primerdatabase/index)(还见 Pattyn 等人，Nucl. Acid Res. 31 122-23,2003)。本领域技术人员理解，可使用本发明的教导和本领域已知的常规方法，经验性地 确定适用于公开的方法和试剂盒的引物和报道探针，而无须过多实验。例如，可使用计算 机算法，通过从相关科学文献(包括但不限于合适的数据库)选择候选靶寡核苷酸，来 获得合适的引物、引物组和报道探针(见，例如miRNA Registry，互联网上sanger-ac. uk/Software/Rfam/miRNA/index ；MiRscan,可于 genes/mit. edu/mirscan 网络获得； miRseeker ；和 Carter 等人，Nucl. Acids Res. 29 (19) :3928_38，2001)。当确定了目的寡核苷酸之后，可使用公知的合成技术，来合成测试引物和/或报道探针，可在公开的 方法和试剂盒中对其适用性加以评估(见例如Current Protocolsin Nucleic Acid Chemistry, Beaucage 等人编辑，John Wiley & Sons，NewYork, N. Y.，包括 2004 年 8 月的 更新("Beaucage 等人，，)；Blackburn 禾口 Gait ；Glen Research 2002 Catalog, Sterling, Va. ；The Glen Report 16(2) 5,2003, Glen Research ；Synthetic Medicinal Chemistry 2003/2004，Berry 禾口 Associates，Dexter, Mich.禾口 PNA Chemistry for the Expedite 8900Nucleic Acid Synthesis System User' s Guide, Applied Biosystem)。本令页域技 术人员将知道，可通过并入小沟槽结合子、用合适的核苷酸类似物取代核苷酸(即嵌合探 针)，或使用包含合适类似物的同源多聚探针(包括但不限于PNA寡聚探针或LNA寡聚探 针，其有或没有沟槽结合子)等，来增加引物或报道探针的熔融温度(Tm)。
术语“延伸酶”指能催化杂交的引物以模板依赖性方式在合适的反应条件(包括 但不限于，合适的核苷酸三磷酸酯、辅助因子、缓冲液等)下5’ -3’延伸的多肽。典型地， 延伸酶是DNA聚合酶，例如但不限于RNA依赖性的DNA聚合酶(其包括但不限于反转录 酶)，DNA依赖性的DNA聚合酶，其包括这样的DNA聚合酶至少在某些条件下，具有这些 DNA聚合酶类别中的两种的性质，其包括这些中每种的酶活性突变体或变体。在某些实施 方式中，延伸酶是反转录酶，包括其酶活性突变体或变体，例如但不限于，逆病毒反转录酶， 例如禽类成髓细胞瘤病毒(AMV)反转录酶和莫洛尼小鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶。在 某些实施方式中，延伸酶是DNA聚合酶，这包括其酶活性突变体或变体。某些DNA聚合酶 在一定条件下具有反转录酶活性，例如但不限于，嗜热栖热菌属(ThermusthermophiIus) 的DNA聚合酶(Tth DNA聚合酶，E.C. 2. 7. 7. 7)，其在存在Mn2+而不是Mg2+时展示出反 转录活性(还见GeneAmp AccuRT RNAPCR试剂盒和Hot Start RNA PCR试剂盒，其包 含源于嗜热栖热菌属Z05种的重组聚合酶，两者均来自Applied Biosystems) 0类似地， 某些反转录酶在某些反应条件下具有DNA聚合酶活性，这包括但不限于AMV反转录酶和 MMLV反转录酶。对用于公开的方法和试剂盒的合适的DNA聚合酶的描述可在Lehninger Principles of Biochemistry,第三版，Nelson 禾口 Cox, Worth Publishing, New York, N. Y.，2000 ( “ Lehninger “)，特别是第 26 和 29 章；R. M. Twyman, Advanced Molecular Biology :A ConciseReference. Bios Scientific Publishers, New York, N. Y. (1999)禾口 EnzymaticResource Guide !Polymerases, Promega, Madison, Wis. (1998)等中找至丨J。其酶 活性突变体或变体也明确处于术语延伸酶的意欲范围内，经修饰以赋予不同的温度敏感性 性质的酶也在内(见，例如，U. S. Pat. Nos. 5，773，258 ；5，677，152 和 6，183，998)。在某些实施方式中，引物、扩增子或引物和扩增子包含报道基团。在某些实施方式 中，包含报道基团的引物通过引物延伸并入扩增子。在某些实施方式中，当经报道基团标 记的dNTP在引物延伸或其它扩增技术阶段并入的情况下，扩增子包含并入进扩增子的报 道基团。报道基团可在合适的条件下发射荧光、化学发光、生物发光、磷光或电化学发光信 号。示例性的报道基团包括但不限于荧光团、放射性同位素、色原、酶、抗体(包括但不限 于表位标签)、半导体纳米晶体(例如量子点(quantum dots))、重金属、染料、磷光基团、化 学发光基团、电化学检测基元、亲和性标签、结合蛋白、磷光体、稀土螯合剂、过度金属螯合 齐U、近红外染料(其包括但不限于"Cy7SPh. NCS”、“Cy70phEt. NCS”、“Cy70phEt. CO2Su"和 IRD800(还见 J. Flanagan 等人，Bioconjug. Chem. 8 :751-56 (1997)和 DNA Synthesis withIRD800 Phosphoramidite，LI-COR Bulletin #111，LI—COR，Inc.，Lincoln, Nebr.))、电化 学发光标记(包括但不限于三联吡啶(triS(bipyridal))钌(II)(也被称为Ru (bpy) 32+)、 0s(l, 10-菲咯啉)2双(二苯基膦基)乙烷2+ (也被称为Os (phen) 2 (dppene)2+)、鲁米诺/过 氧化氢、Al (羟基喹啉-5-磺酸)、9，10- 二苯基蒽-2-磺酸酯和tris (4-乙烯基-4'-甲 基_2，2' -二吡啶基)钌(11)(也被称为Ru(v-bpy32+)))等。术语报道基团还包括多元间接报道系统的元件，其包括但不限于，亲和性标签 (例如生物素抗生物素蛋白、抗体抗原、配体受体(包括但不限于结合蛋白与它们的 配体))等，其中，一个元件与系统的一个或多个其它元件相互作用，以实现针对可检测信 号的潜力。示例性的多元报道系统包括包含生物素受体基团的寡核苷酸和缀合有链霉 抗生物素的荧光团，或者反过来；包含DNP报道基团的寡核苷酸和经荧光团标记的抗DNP 抗体；等等。在某些实施方式中，报道基团，特别是多元报道基团，并不一定用于检测，而 是用作为亲和性标签用于分离/分开，这例如但不限于，生物素报道基团和链霉抗生物素 涂布的底物，或者反过来；地高辛报道基团和包含抗地高辛抗体或地高辛结合适配体的 底物；DNP报道基团和包含抗DNP抗体或DNP结合适配体的底物；等等。关于将报道基 团和寡核苷酸，寡核苷酸，肽，抗体和其它蛋白，单、二和寡糖、有机分子等连结的详细方 案可在 G. T. Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996 ； Beaucage 等 人；Molecular Probes Handbook 禾口 PierceApplications Handbook and Catalog 2003-2004,Pierce Biotechnology,Rockford,111. ,2003 ("Pierce Applications Handbook”)等中找到。
多元相互作用报道基团也在术语报道基团的范围内，例如荧光-淬灭剂对，这包 括但不限于荧光淬灭剂和黑暗淬灭剂(也被称为非荧光淬灭剂)。荧光淬灭剂可吸收荧光 团发射的荧光信号，吸收足够的荧光能量之后，荧光淬灭剂可发射出特征波长的荧光，例如 荧光共振能量转移。例如(但非限制)，FAM-TAMRA对可在492nm处(FAM的激发峰)被照 射，并在580nm处(TAMRA的发射峰)发射荧光。与荧光报道基团合适配对的黑暗淬灭剂从 荧光团吸收荧光能量，但是自身并不发荧光。相反，黑暗淬灭剂消耗吸收的能量(典型地， 作为热)。示例性的黑暗或非荧光淬灭剂包括Dabcyl、黑洞淬灭剂、Iowa Black、QSY-7、 AbsoluteQuencherjclipse非荧光淬灭剂、金属簇(例如金纳米颗粒)等。某些包含荧光 团-淬灭剂的经双标记的探针可在对中成员物理分离时发射荧光，例如但不限于，核酸酶 探针，例如TaqMan 探针。包含荧光团-淬灭剂对的其它一些经双标记的探针可在对中成 员空间上分离时发射荧光，例如但不限于杂交探针(例如分子信标)或延伸探针(例如蝎 引物)。荧光团_淬灭剂对是本领域公知的，它们可广泛地用于多种报道探针中(见例如 Yeung ^A, BioTechniques36 266-75,2004 ；Dubertret 等)κ, Nat. Biotech. 19 365-70, 2001 和 Tyagi 等人，Nat. Biotech. 18 :1191_96，2000)。在某些实施方式中，报道基团包含电化学发光基团，其在合适的条件下，能发射 可检测到的电产生的化学发光(ECL)。ECL中，电化学发光基元的激发是电化学驱动的， 化学发光的发射可被光学检测到。示例性的电化学发光报道基团种类包括Ru (bpy) 32+和 Ru(v-bpy)32+(发射波长为 620nm)、Os (phen) 2 (dppene) 2+(发射波长为 584nm)、鲁米诺 / 过 氧化氢(发射波长为425nm)、AI (羟基喹啉_5_磺酸)(发射波长为499nm)和9，10- 二 苯基蒽-2-磺酸酯(发射波长为428nm)等。经修饰从而适应掺入探针的这三种电化学发光报道基团种类的形式是商业可获得的，或者可使用本领域已知的技术来合成，无须过多 实验。例如，已经描述了用于通过氨基连接子基团与核酸序列偶联的Ru(bpy)32+N-羟基琥 珀酰亚胺酯(见U. S. Pat. No. 6，048，687)；可使用类似方法合成Os (phen) 2 (dppene)2+和 Al(HQS)33+的琥珀酰亚胺酯并将其与核酸序列连结。可使用商业可获得的ru-亚磷酰胺 (IGEN International, Inc.，Gaithersburg, Md.)，将 Ru(bpy)32+ 电化学发光报道基团以合 成方式并入核酸序列(见例如 Osiowy, J. Clin. Micro. 40 =2566-71, 2002)。此外，钌、锇、钼、钯和其它过度金属的其它多聚芳香族化合物已展示出电化 学发光性质。关于ECL和电化学发光基元的详细描述可在A. Bard和L. Faulkner， Electrochemical Methods, John Wiley & Sons(2001) ；Μ· Collinson禾口Μ· Wightman,Anal. Chem. 65 2576(1993) ；D.Brunce 禾口 Μ· Richter，Anal. Chem. 74 :3157 (2002) ；A. Knight, Trends in Anal. Chem. 18 47(1999) ；B. Muegge 等 A, Anal. Chem. 75 1102 (2003)； H. Abrunda 等人，J. Amer. Chem. Soc. 104 2641 (1982) ；K. Maness 等人，J. Amer. Chem. Soc. 118 :10609 (1996) ；M. Collinson 和 R. ffightman, Science268 1883et seq. (1995) 和U. S. Pat. No. 6，479，233等中找到(关于磷光镧系和过度金属报道基团的讨论还见 0' Sullivan 等人，Nucl. Acids Res. 30 :ell4，2002)。II.技术本发明的方法涉及对目的已知寡核苷酸加以定量，其特别涉及(但不限于)小RNA 分子，例如miRNA、siRNA、stRNA和其它ncRNA。在此类方法中，靶寡核苷酸的序列是已知的， 可基于已知序列来设计第一引物组(例如反转录酶、正向、反向引物)和报道探针。可将第 二引物组设计来用作为(i)用于各第一扩增子和额外的第一扩增子的扩增引物，其可以 编码或不编码用于随后分离和/或鉴定的靶特异性杂交标签，(ii)通用引物，例如但不限 于对多种第一扩增子和/或额外的第一扩增子的多路扩增，典型地，以均一方式进行，或者 (iii)通用引物和编码靶特异性杂交标签的靶特异性引物的组合。公开的其它一些方法涉及对未知靶寡核苷酸的鉴定，其特别涉及但不限于小RNA 分子，例如miRNA、siRNA、stRNA和其它ncRNA。目的序列不是已知的，虽然序列信息可部 分已知或可被预测。就阐述目的而非限制而言，若干miRNA预测算法是可获得的(见，例 如，MiRscan,可从 genes/mit. edu/mirscan 获得；miRseeker ；禾口 Carter 等人，Nucl. Acids Res. 29(19) :3928_38，2001)。可对科学文献和可获得的数据库(见，例如，miRNARegistry， 可从sanger-ac. uk/Software/Rfam/miRNA/index互联网获得)加以分析，以在潜在miRNA 靶的一个或两个末端鉴定出可能的同源性区域，可使用常规实验对其进行进一步评估。针 对可能的茎环结构，对gDNA的生物信息学检索也可显示出潜在的miRNA靶，用于根据本发 明的教导对其加以评估。此外，可使用公开的方法和组合物，经验性地对未知序列加以鉴 定。在一些实施方式中，用于鉴定寡核苷酸靶(包括但不限于小RNA分子)的第一引物组 中的一条或两条引物包含寡核苷酸结合部分，其中包括至少2、3、4、5、6或7个随机或简并 核苷酸，这包括但不限于通用碱基。本发明部分基于下述发现反转录酶引物的设计对于方法灵敏度来说是极其重要 的。对反转录酶(RT)引物的设计对于获得大的动态范围来说是重要的。RT-引物可归为三 部分，即A. SRS序列(SiRNA相关序列)
B.探针序列C.反向引物序列A. SRS 序列当存在与RT-引物3’末端的最后两个核苷酸互补的可少至2个核苷酸时，反转录 酶能将RNA或DNA分子转录为cDNA。关于反转录酶引物的设计，适用特别的规则。重要的 是，⑴在RT-引物设计中，防止SRS序列的3’末端以序列组合GC、CG、AT或TA结尾，因为 该RT-引物能形成二聚体并自身转录。为避免这种情况，如果3’末端具有任何上述序列，应 当延长或缩短SRS序列，使得其以GT、GA、CT或CA结尾；⑵在RT-引物设计中防止与SRS 序列的3’末端的互补重复。例如，如果3’末端编码GT，则在RT-引物内部的任何地方都不 能允许AC存在。如果在SRS序列中有AC序列，则延长或缩短SRS序列；以及(3) SRS序列 长度可在少至2个至11个核苷酸的范围内变化。例如，SRS序列覆盖siRNA序列的大部分 是可能的，例如，如果siRNA有19个核苷酸长，那么SRS序列可以有17个核苷酸长。B.探针序列探针序列大小可在17至30个核苷酸之间变化。序列可与正义或反义链互补。探 针序列并不限于RT-引物，但是其可以跨越siRNA序列的一部分。可用不同的荧光标记(例 如VIC、JOE、TAMRA, FAM、CY3、CY5等)组合不同的淬灭剂(例如TAMRA、BHQ等)对探针加 以标记。在PCR中使用经特异性标记的探针允许进行多路RT-PCR。这允许在相同生物样品 中同时测量例如siRNA水平、siRNA-靶mRNA水平和内对照。C.反向引物序列反向引物序列长度可变化，但当与正向引物组合使用时，必须要能产生唯一的PCR产物。当设计引物用于反应时，在反向引物的3’末端和反转录引物的3’末端之间没有 序列重叠。关于正向引物和反转录引物，如果有太多的序列重叠，将导致反转录引物以不依 赖模板的方式扩增。在正向引物和反向引物的3’末端之间有少至3个核苷酸的重叠是足 够的。为防止这种情况，可使得重叠最小化为最多2个核苷酸的重叠。虽然这些方法的某些实施方式使用“RT-PCR-PCR样”的扩增技术，但也可考虑其 它扩增技术。此外，公开的方法的某些实施方式包含单一反应组合物(其中产生扩增子)。 其它一些实施方式包含两种或多种反应组合物，包括但不限于多种形式，其中包含第一反 应组合物(其中产生第一产物、第一扩增子和额外的第一扩增子)和多种不同的第二反应 组合物(其中产生第二扩增子)。就阐述目的而言(但不以任何方式限制本发明的教导)，关于某些公开的方法的 一些方法的综述参见图1。示例性的siRNA靶与第一引物组的相应反转录引物杂交，在存在 延伸酶的情况下，杂交的反转录引物延伸，形成单链拷贝DNA。本领域技术人员将知道，根据 传统方法，在反转录引物可结合之前，对双链siRNA进行变性(例如但不限于95°C 5分钟)， 这通常在热循环仪中进行。令人吃惊地，本发明的发明人观察到，当靶是双链siRNA时，反 转录引物可等温并入，即无需变性步骤。在不受限于特定理论基础的情况下，这可能是由于 siRNA-第一靶双链体的浓度(典型地在10_15(fM)至10_12(pM)的范围)相对第一引物组的 浓度(典型地在10_8(nM)至10_6( μ M)的范围)导致的。在这些条件下，反转录引物可置换 siRNA-双链体的5’末端，并可通过延伸酶而延长，甚至是在酶活性的非最优温度下也可实现。例如，在其中靶是小RNA分子的某些实施方式中，在大约20°C孵育第一反应组合物若 干分钟(例如但不限于10-30分钟)，然后将温度升高至最优，或者至少增强延伸酶(典型 地，在此实施方式中是反转录酶)的活性。因此，在某些实施方式中，在产生单链拷贝DNA 的步骤之前，包括变性步骤，而在其它一些实施方式中，这是任选进行的。反应组合物的温 度升高，以失活反转录酶(如果有的话)和/或活化第二延伸酶(如果适用的话，例如，“热 启始”聚合酶)。在第二反应中，在合适的反应条件下，正向引物与单链拷贝DNA杂交，其被第二延 伸酶(例如“热起始”聚合酶)延伸，形成第一扩增子。在第二步骤中，反应组合物变性(例 如但不限于95°C或以上10-20秒)之后，将温度降低(至例如但不限于大约60°C大约1 分钟)，以允许反向引物与第一扩增子杂交，正向引物与单链拷贝DNA杂交，接着通过第二 延伸酶延伸这两条引物。然后在变性温度和退火/延伸温度(例如，但不限于95°C或更高 10-20秒，然后大约60°C大约1分钟)之间将反应组合物循环有限次循环(例如但不限于 35至50个循环)，以产生第一扩增子和额外的第二扩增子。在某些实施方式中，第一扩增子和额外的第一扩增子产生之后，加入第二引物组 以及任选加入延伸酶，形成第二反应组合物。在下文讨论的其它一些实施方式中，在第一反 应组合物中包括第二引物组。将反应组合物加热至足以使得第一扩增子和额外的第一扩增 子变性的温度。冷却反应混合物，以允许第二引物组的引物与第一扩增子或额外的第一扩 增子的分开的链杂交，通过延伸酶延伸第二引物组的杂交引物，产生第二扩增子，根据需要 重复循环。
在一种实施方式中，正向和反向引物是未经修饰的引物。在另一实施方式中，正向 或反向引物可经过修饰。此类修饰有助于增强引物针对靶的亲和性和/或特异性。修饰的 例子包括但不限于2’ -烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸、经锁定的核酸核 糖核苷酸(LNA)、2’ -氟核糖核苷酸、吗啉代核苷酸。在另一实施方式中，经修饰的核苷酸选自具有经修饰的下述核苷间连接的核苷 酸，所述连接选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷酸酯和酰胺连接。在某些实施方式中，加入第二引物组和任选的延伸酶时，向第二反应组合物中加 入报道探针。在其它一些实施方式中，在之后的步骤中加入报道探针。本领域技术人员将 知道，当检测包含在核酸酶检验(包括但不限于TaqMan 检验)或探针延伸检验中使用报 道探针时，需要在反应组合物中包括合适的DNA聚合酶(其可以或可以不与第二延伸酶相 同)。循环反应(这取决于所使用的检测检验的本质和报道探针)，检测报道探针，对相应 的靶加以鉴定或定量。本领域技术人员将知道，检测可包含多种具有不同作用机制的报道探针，并且，检 测可以以实时或终点模式进行。还将知道，检测可包含并入扩增子的报道基团，其可作为 经标记引物的一部分或者由于在扩增期间并入了经标记的dNTPs而并入，或者与扩增子连 结，这例如但不限于通过包含报道基团的杂交标签互补序列或者通过连接子臂(整合的或 与扩增子连结)来进行。在公开的方法的某些实施方式中，形成单一反应组合物，在相同反应组合物中，典 型地在相同反应容器中，进行2、3或4个扩增步骤(取决于反应形式)。根据公开的方法的 某些实施方式中，第一反应组合物包含寡核苷酸靶、第一引物组和延伸酶；产生并检测第一产物、第一扩增子、额外的第一扩增子或其组合；对靶寡核苷酸进行鉴定和/或定量。在某些实施方式中，单一反应组合物还包含第二引物组。第二引物组的第一和第 二引物用于扩增第一扩增子和/或额外的第一扩增子，产生第二扩增子。在某些实施方式 中，第二引物组的引物是通用引物。在某些实施方式中，第二引物组的两条引物都包含通用 引物。在某些实施方式中，第二引物之一是通用引物，相应引物包含杂交标签，该标签典型 地编码靶特异性序列，随后可用其将第二扩增子与其相应的寡核苷酸靶关联起来。在某些 实施方式中，第二引物组的引物包含亲和性标签。在某些实施方式中，用第二引物组的额外 的引物来循环第二扩增子，产生更多的第二扩增子。在某些实施方式中，检测第二扩增子或 其代替品，对相应的寡核苷酸靶进行鉴定和/或定量。在某些实施方式中，寡核苷酸靶包含小RNA分子，延伸酶包含反转录酶或具有反 转录酶活性的DNA聚合酶，第一产物包含反转录产物。在某些实施方式中，使用至少两种不 同的延伸酶，其中包括反转录酶和DNA聚合酶。在某些实施方式中，公开的方法包括形成至少两种不同的反应组合物。大体上，针 对每种寡核苷酸靶，两组引物组被用于在两种不同的反应组合物中进行的三个或四个扩增 步骤中，所述步骤可以但是不必须发生于相同反应容器中。典型发生的扩增步骤包括将反 转录引物与寡核苷酸分子杂交，其中，反转录引物包含具有寡核苷酸识别序列的寡核苷酸 分子结合部分，所述序列包含位于3’区域与寡核苷酸分子的区域互补的至少2个核苷酸以 及位于5’区域的包含至少2个核苷酸的延伸尾；用第一延伸酶延伸杂交的反转录引物，产 生反转录产物；将正向引物与反转录产物杂交，其中正向引物包含寡核苷酸分子结合部分， 所述部分包含与寡核苷酸分子的区域相同的至少2个核苷酸；用第二延伸酶延伸杂交的正 向引物，产生第一扩增子；将反向引物与第一扩增子杂交；用第二延伸酶延伸杂交的反向 引物，产生与第一扩增子互补的第二扩增子；检测扩增产物；以及由此对寡核苷酸分子进 行鉴定或定量。该反应可以但不必须包含实时检测。在某些实施方式中，扩增步骤包含多 路技术。根据本发明的寡核苷酸靶可源于任何活的或者曾经活的生物，其包括但不限于原 核生物、古细菌(archaea)、病毒和真核生物。寡核苷酸靶还可以是合成的。寡核苷酸靶可 来自核，典型地是基因组DNA (gDNA)和RNA转录产物(包括但不限于某些miRNA前体和其它 一些小RNA分子)，或者可以是核外的，例如，胞质、质粒、线粒体、病毒等。本领域技术人员 知道，gDNA不仅包括全长材料，其还包括通过任何手段(例如但不限于，酶消化、超声波处 理、剪切力等)产生的片段。在某些实施方式中，寡核苷酸靶可以以双链或单链形式存在。多种方法可用于获得用于本发明教导的方法和试剂盒的寡核苷酸靶。当从生物 基质获得靶序列时，典型地，使用某些分离技术，包括但不限于(1)有机提取接着进行乙 醇沉淀，例如使用苯酚/氯仿有机试剂(见例如Ausbel等人，特别是第1卷，第2章，第 I部分)，在某些实施方式中，使用自动提取仪，例如Model 341 DNA Extractor (Applied Biosystems)来进行；(2)固定相吸附方法(见，例如 U. S. Pat. No. 5，234，809 ；Walsh 等 人，BioTechniques 10 (4) :506_513 (1991))和(3)盐诱导的 DNA 沉淀技术(见例如 Miller等人，Nucl. Acids Res. 16(3) :9_10，1988)，此类制备方法典型地被称为“盐析”方 法。在某些实施方式中，上述分离方法之前可进行酶消化步骤，以帮助从样品消除不想要 的蛋白质，例如用蛋白酶K或其它类似蛋白酶进行处理。见，例如，U.S.专利申请Ser.No. 09/724，613 ；还见 U. S.专利申请 Ser.Nos. 10/618，493 和 10/780, 963 以及 U. S.临时 专利申请Ser. Nos. 60/499，082和60/523，056。还可使用多种可商业获得的试剂盒和仪 器来获得靶寡核苷酸，这包括但不限于小RNA分子及其前体，例如但不限于ABI PRISM . TransPr印系统、BloodPi^p . Chemistry、ABIPRISM 6100 Nucleic Acid Pr印Station 和 ABI PRISM 6700 自动核酸工作站(所有都来自 Applied Biosystems) ；SV96 Total RNA 分离系统和 RNAgents .总 RNA 分离系统(Promega，Madison, Wis.) ；mirVanamiRNA 分离 试剂盒(Ambion，Austin，Tex.)和Absolutely RNA 纯化试剂盒和Micro RNA分离试剂盒 (Stratagene, La Jolla, Calif.)。
在某些实施方式中，可对样品中的寡核苷酸分子进行限制酶切割，可将得到的限 制性片段用作为寡核苷酸靶。不同的寡核苷酸靶可以是单条连续核酸的不同部分，或者 可以处于不同核酸上。单条连续核酸的不同靶序列可以重叠或者可以不重叠。某些寡 核苷酸靶还可以存在于其它靶序列内部，这包括但不限于初级miRNA(pri-miRNA)、前体 mi RNA (pre-miRNA)、mi RNA、mRNA 和 si RNA。公开的方法的某些实施方式包括产生第一产物的步骤、产生第一扩增子的步骤、 产生额外的第一扩增子的步骤、产生第二扩增子的步骤、产生更多第二扩增子的步骤或其 组合。在某些实施方式中，这些步骤中的至少一些在第一反应组合物中同时或者接近同时 发生。在某些实施方式中，这些步骤中的一些发生于第一反应组合物中，其它一些步骤发生 于第二反应组合物或者第三反应组合物中。本发明教导的某些试剂盒包含扩增手段。根据本发明教导的扩增包括通过其能复制靶寡核苷酸和/或扩增子的至少一部 分的任何手段，典型地，以模板依赖性方式复制，所述手段包括但不限于用于(线性或指 数)扩增核酸序列的多种多样的技术。用于进行扩增步骤的示例性技术包括聚合酶链式反 应(PCR)、引物延伸(包括但不限于反转录)、链置换扩增(SDA)、多置换扩增(MDA)、基于核 酸链的扩增(NASBA)、滚环扩增(RCA)、转录介导的扩增(TMA)、转录等，这也包括其多路版 本或其组合。对此类技术的描述可在Sambrook和Russell ；Sambrook等人；Ausbel等人； PCR Primer :A LaboratoryManual, Diffenbach 编辑，Cold Spring Harbor Press (1995)； The ElectronicProtocol Book, Chang Bioscience (2002) ；Msuih等人，J. Clin. Micro. 34 : 501-07(1996) ； Rap ley ；U. S. Pat. Nos. 6，027，998 和 6，511，810 ；PCT 公开 Nos. WO 97/31256 和 WO 01/92579 ；Ehrlich等人，Science 252 1643-50 (1991) ；Innis 等人，PCR Protocols A Guide to Methods and Applications, Academic Press (1990) ；Favis 等人，Nature Biotechnology 18:561-64(2000)和 Rabenau 等人，Infection 28:97-102(2000)等中找 到。在某些实施方式中，扩增包含顺序步骤的循环(i)将引物与靶寡核苷酸和/或扩 增子(包含互补或基本互补的序列)杂交；(ii)延伸经杂交的引物，由此以模板依赖性方 式合成核苷酸的链；以及(iii)变性新形成的核酸双链体，以分离链。循环可以重复或者可 以不重复，这根据需要决定。扩增可包含热循环或者可以以等温方式进行。在某些实施方 式中，刚产生的核酸双链体最初并不被变性，而是以其双链形式用于一个或多个后续步骤， 可检测任意一条或两条链，但必须如此。在某些实施方式中，产生单链扩增子，例如但不限 于不对称PCR。引物延伸是扩增技术，其包括使用扩增手段(例如延伸酶，例如但不限于DNA聚合酶(包括但不限于反转录酶))，以5’到3’的方向，延长退火到模板上的引物。根据某些实 施方式中，采用合适的缓冲液、盐、PH、温度和核苷酸三磷酸酯(包括其类似物)，延伸酶将 与模板链互补的核苷酸从退火引物的3’末端开始合并进去，产生互补链。在某些实施方式 中，用于引物延伸的延伸酶缺乏或基本上缺乏5’ -外切核酸酶活性。本领域技术人员将理解，多种不同的酶，包括但不限于延伸酶，可用于公开的方 法和试剂盒，例如但不限于，从耐热或极端耐热的原核生物、真核生物或古生物分离的那 些。本领域技术人员还将理解，酶，例如聚合酶(包括但不限于DNA依赖性的DNA聚合 酶和RNA依赖性的DNA聚合酶)，不仅包括天然存在的酶，还包括重组的酶以及此类酶 的酶活性片段、切割产物、突变体或变体，例如但不限于Klenow片段、Stoffel片段、Taq FS (Applied Biosystems)、9Nm . DNA 聚合酶(New England BioLabs, Beverly, Mass.)和 突变体酶(包括但不限于天然存在的和人工制造的突变体)，其被描述于Luo和Barany， Nucl. Acids Res. 24 :3079_3085 (1996)，Eis 等人，Nature Biotechnol. 19 :673_76 (2001) 和U. S. Pat. Nos. 6，265，193和6，576，453中。经可逆修饰的聚合酶，例如但不限于 U. S. Pat. No. 5，773，258中描述的那些，也在本文公开的教导内。本发明的教导还包括多 种基于尿嘧啶的去污染策略，其中，例如可将尿嘧啶加入到扩增反应中，用多种糖基化酶 处理除去随后的遗留产物(见例如U. S. Pat. No. 5，536，649)。本领域技术人员将理解， 具有想要的酶活性的任何蛋白质都可用于公开的方法和试剂盒中。对DNA聚合酶(包括 反转录酶、尿嘧啶N-糖基化酶等)的描述可在Twyman，Advanced Molecular Biology, BIOS ScientificPublishers, 1999 ；Enzyme Resource Guide,rev. 092298,Promega,1998 ； Sambrook 禾口 Russell ；Sambrook 等人 ；Lehninger ；PCR :The Basics 禾口 Ausbel 等人等中找 到。公开的方法和试剂盒的某些实施方式包括分离(作为分离步骤或作为用于检测 的步骤的一部分)手段。分离包括从扩增子除去至少一些未反应组分或至少一些试剂的任 何工艺。在某些实施方式中，将扩增子与未反应组分和试剂(包括但不限于，反应组合物中 存在的未反应的分子种类、延伸酶、引物、辅助因子、dNTP等)分开。本领域技术人员将知 道，在本文公开的方法和试剂盒中可使用多种公知的分离手段，因此所使用的分离技术并 非是对公开的方法的限制。用于进行分离步骤的示例性的手段/技术包括凝胶电泳，其例如但不限于等电聚 焦和毛细电泳；介电电泳；流式细胞术(包括但不限于使用珠粒、微球等的荧光活化分选 技术)；液相色谱(包括但不限于HPLC、FPLC、尺寸排阻(凝胶过滤)色谱、亲和色谱、离 子交换色谱、疏水相互作用色谱、免疫亲和色谱和反相色谱)；亲和标签结合(例如，生物 素-抗生物素蛋白、生物素-链霉抗生物素、麦芽糖-麦芽糖结合蛋白(MBP)和钙-钙结 合肽)；适配体_靶结合；杂交标记_杂交标记互补退火；质谱(包括但不限于MALDI-T0F、 MALDI-TOF-TOF、串联质谱(MS-MS)、LC-MS 禾Π LC-MS/MS)；微流体设备(microfluidic device)等。对分离技术和分离-检测技术的讨论可在Rapley ；Sambrook等人；Sambrook 禾口 Russell ；Ausbel 等人；Molecular Probes Handbook ；Pierce Applications Handbook ； Capillary Electrophoresis :Theory and Practice, P.Grossman 禾口 J. Colburn, eds., Academic Press,1992 ；The Expanding Role of MassSpectrometry in Biotechnology, G. Siuzdak, MCC Press, 2003 ；PCT 公开 No. WO 01/92579 和 Μ. Ladisch, BioseparationsEngineering :Principles, Practice, and Economics，John Wiley & Sons，2001等中找到。在某些实施方式中，检测步骤包括使用仪器对扩增子进行分离和/或检测，即，使 用自动或半自动检测手段，其可以(但不必须)包含计算机算法。在某些实施方式中，检 测步骤与分离步骤组合或是分离步骤的延续，例如但不限于，包含荧光扫描仪和制图、记录 或读出组分的毛细管电泳仪器；偶联有质谱仪的毛细管电泳仪器；偶联有吸光度监测仪或 荧光扫描仪和图像记录仪或质谱仪的色谱柱；或具有数据记录设备(例如扫描仪或CCD照 相机)的微阵列。在某些实施方式中，检测步骤与扩增步骤和定量和/或鉴定步骤组合， 例如但不限于，实时分析，例如Q-PCR。用于进行检测步骤的示例性手段包括毛细管电泳仪 器，例如但不限于 ABI PRISM . 3100 Genetic 分析仪，ABI PRISM 3100-Avant Genetic 分析仪，ABIPRISM 3700 DNA 分析仪，ABI PRISM 3730 DNA 分析仪，ABIPRISM 3730x/ DNA分析仪(全部来自 Applied Biosystems) ；ABIPRISM 7300 实时PCR系统；ABI PRISM 7700序列检测系统；质谱仪和微阵列以及相关软件，例如具有Applied Biosystems 1700 化学发光微阵列分析仪的Applied Biosystems阵列系统和可从Affymetrix，Agilent, Illumina和Amersham Biosciences等获得的其它可商业获得的阵列系统(还见Gerry等 人，J. Mol. Biol. 292 :251_62，1999 ；De Bellis 等人，MinervaBiotec 14 :247_52，2002 和 Stears等人，Nat. Med. 9 140-45，包括增刊，2003)。用于报道基团检测、数据收集和分析的 示例性软件包括GeneMapper 软件、GeneScan 分析软件和Genotyper 软件(全部来自 AppliedBiosystems)。在某些实施方式中，分离或检测包括流式细胞方法，包括但不限于荧光活化分选 (见例如Vignali，J. Immunol. Methods 243 :243_55，2000)。在某些实施方式中，检测包括 使用迁移率依赖性的分离技术，例如毛细管电泳，分离扩增子和/或扩增子代替品；使用例 如但不限于荧光扫描仪，检测洗出液，以检测洗脱的扩增子；以及评估扩增子的荧光谱，典 型地使用检测和分析软件，例如使用GeneScan 分析软件的ABI PRISM Genetic分析仪 (两者均来自Applied Biosystems)来进行。在某些实施方式中，测定包括平板读数仪和合 适的光源。在某些实施方式中，检测包括单链扩增子或扩增子代替品，例如但不限于，整合进 被检测的单链分子中的报道基团的检测，例如，并入扩增子的荧光报道基团或释放的杂交 标签互补序列(示例性的扩增子代替品)的报道基团；与被检测的单链扩增子杂交的分子 上的报道基团，例如报道探针。在某些实施方式中，检测双链扩增子。典型地，通过三链体形成，或通过双链分子 的局部开放，使用例如但不限于PNA开启子、PNA钳夹和三链体形成寡核苷酸(TFOs)(经 报道基团标记或与经标记的物体(例如分子信标)联合使用)，来检测此类双链扩增子或 扩增子代替品(见，例如，Drewe 等人，Mol. Cell. Probes 14 :269_83，2000 ；Zelphati 等 人，BioTechniques 28 :304_15，2000 ；Kuhn 等人，J. Amer. Chem. Soc. 124 1097-1103，2002 ； Knauert 禾口 Glazer，Hum. Mol. Genet. 10 :2243_2251，2001 ；Lohse 等人，Bioconj. Chem. 8 503-09，1997)。在某些实施方式中，扩增子和/或扩增子代替品包含同型嘌呤序列的片断。III.经修饰的核苷酸在一种实施方式中，本发明涉及经化学修饰的核酸分子，例如，短干扰核酸分子， 其中所述化学修饰包含与核酸分子共价连结的缀合物。缀合物的非限制性例子包括但不限于2’ _烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸、经锁定的核酸核糖核苷酸(LNA)、 2’_氟核糖核苷酸、吗啉代核苷酸。在另一实施方式中，经修饰的核苷酸选自具有经修饰的 下述核苷间连接的核苷酸，所述连接选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼代磷 酸酯和酰胺连接。
在一种实施方式中，本发明的缀合物分子包含协助将经化学修饰的核酸分子例如 siRNA分子递送到生物系统(例如细胞)中的分子。在另一实施方式中，与经化学修饰的 siRNA分子连结的缀合物分子是聚乙二醇、人血清清蛋白或能介导细胞吸收的细胞受体的 配体。在2002年7月22日提交的Vargeese等人，U. S. Ser. No. 10/201，394中描述了一些 特别的缀合物分子的例子，该文献通过引用并入本文。可针对改善的药物代谢动力学曲线、 生物利用率和/或siRNA构建体的稳定性(同时保持siRNA介导RNAi活性的能力)，对本 发明siRNA分子使用的缀合物的种类和缀合的程度加以评估。由此，本领域技术人员可对 经多种缀合物修饰的siRNA分子加以筛选，以确定siRNA缀合物复合体是否具有改进的性 质同时又保持介导RNAi的能力，例如在动物模型中进行，这是本领域通常已知的。还可用 能协助递送到靶细胞和/或协助靶细胞吸收的药物载体来配制经化学修饰的核酸分子。选 自但不限于中性脂质体、阳离子脂质体或脂复合体、阳离子聚合物或多聚复合体、中性聚 合物、纳米颗粒、双链RNA结合蛋白、磷酸钙、细胞穿透肽、病毒蛋白和病毒颗粒、抗体和空 细菌包膜。在一种实施方式中，本发明涉及下述短干扰核酸siRNA分子，其包含核苷酸、非核 苷酸或混合的核苷酸/非核苷酸，例如适配体。“适配体”或“核酸适配体”在本文中使用 时表示与靶分子特异性结合的核酸分子，其中，所述核酸分子具有下述序列，所述序列包含 在其天然设置下能被靶分子识别的序列。或者，适配体可以是这样的核酸分子当靶分子 天然并不与核酸结合的情况下，其可与靶分子结合。靶分子可以是任何目的分子。例如， 适配体可用于与蛋白质的配体结合结构域结合，由此阻止天然存在的配体与蛋白质的相互 作用。这是非限制性的例子，本领域技术人员将知道，可使用本领域通常已知的技术，容 易产生其它实施方式(见，例如，Gold 等人，1995，Annu. Rev. Biochem.，64，763 ；Brody ^P Gold,2000，J. Biotechnol. ,74,5 ；Sun,2000, Curr. Opin. Mol. Ther. ,2,100 ；Kusser,2000, J. Biotechnol. ,74,27 ；Hermann 禾口 Patel，2000，Science,287,820 禾口 Jayasena，1999， Clinical Chemistry,45,1628.)。修饰的例子包括但不限于帽区域的修饰。“帽结构”表示这样的化学修饰，其被掺 入寡核苷酸的任一末端(见，例如Adamic等人，U. S. Pat. No. 5，998，203，其通过引用并入本 文)。这些末端修饰保护核酸分子抵挡外切核酸酶的降解，并且可帮助递送和/或在细胞内 定位。帽可存在于5’-末端(5’-帽)或3’-末端(3’-帽)，或者可存在两个末端。在一 些非限制性的例子中，5’ -帽包括但不限于甘油基，反转(inverted)脱氧无碱基残基(基 元)；4'，5'-亚甲基核苷酸；1_(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸；碳环型核 苷酸；1，5-失水己糖醇核苷酸；L-核苷酸；α -核苷酸；经修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯 连接；苏-戊呋喃糖基核苷酸；非环式3'，4' _开环核苷酸；非环式3，4-二羟基丁基核苷 酸；非环式3，5-二羟基戊基核苷酸，3' -3'-反转核苷酸基元；3' -3'-反转无碱基基 元；3' -2'-反转核苷酸基元；3' -2'-反转无碱基基元；1，4-丁二醇磷酸酯；3'-氨 基磷酸酯；己基磷酸酯；氨基己基磷酸酯；3'-磷酸酯；3'-巯基磷酸酯；二硫代磷酸酯；或桥联或非桥联甲基膦酸酯基元。3’_帽的非限制性例子包括但不限于甘油基，反转脱氧无碱基残基(基元)； 4'，5'-亚甲基核苷酸；1_(β-D-赤呋喃糖基)核苷酸、4'-硫代核苷酸；碳环型核苷 酸；5’ -氨基烷基磷酸酯；1，3- 二氨基-2-丙基磷酸酯；3-氨基丙基磷酸酯；6-氨基己基 磷酸酯；1，2_氨基十二烷基磷酸酯；羟基丙基磷酸酯；1，5_失水己糖醇核苷酸；L-核苷 酸；α -核苷酸；经修饰碱基核苷酸；二硫代磷酸酯；苏-戊呋喃糖基核苷酸；非环式3'， 4' _开环核苷酸；3，4-二羟基丁基核苷酸；3，5-二羟基戊基核苷酸，5' -5'-反转核苷 酸基元；5' -5'-反转无碱基基元；5'-氨基磷酸酯；5'-硫代磷酸酯；1，4-丁二醇磷 酸酯；5’-氨基；桥联或非桥联5'-氨基磷酸酯，硫代磷酸酯和/或二硫代磷酸酯，桥联或 非桥联甲基膦酸酯和5，-巯基基元(更多细节参见Beaucage和Iyer，1993，Tetrahedron 49，1925 ；其通过引用并入本文)。在另一丝实施方式中，本发明涉及本发明的SiRNA分子的缀合物和/或复合体。 此类缀合物和/或复合体可用于协助将SiRNA分子递送进生物系统(例如细胞)。本发明 提供的缀合物和复合体可通过将治疗性化合物转运经过细胞膜、改变药物代谢动力学和/ 或调节本发明的核酸分子定位来施加治疗作用。本发明包括对用于递送分子(包括但不 限于小分子、脂类、胆固醇、磷脂、核苷、核苷酸、核酸、抗体、毒素、负电荷聚合物和其它聚合 物，例如蛋白质、肽、激素、碳水化合物、聚乙二醇或聚胺)穿过细胞膜的新颖缀合物和复合 体的设计和合成。通常，描述的转运蛋白被设计为或者单个使用或作为多组分系统的一部 分使用，可以有或没有可降解的连接子。这些化合物预计能改善在存在或 不存在血清的情 况下本发明的核酸分子向来自不同组织的多种细胞类型的递送和/或定位(见Sullenger 和Cech，U. S. Pat. No. 5，854，038)。本文描述的分子的缀合物可通过可生物降解的连接子 (例如可生物降解的核酸连接子分子)与生物活性分子连结。最优地，外源递送的治疗性核酸分子(例如SiRNA分子)在细胞中稳定，直到RNA 的反转录被调节足够长到能降低RNA转录本的水平。核酸分子能抗核酸酶，以作为有效的 细胞内治疗剂发挥功能。本发明和本领域中描述的对核酸分子化学合成的改进拓展了通过 引入核苷酸修饰来修饰核酸分子以增强其核酸酶稳定性的能力(如上文所述)。在又一实施方式中，本发明提供了具有化学修饰的SiRNA分子，其能保持或增强 RNAi中涉及的蛋白质的酶促活性。此类核酸通常还比未经修饰的核酸对核苷酸更有抗性。 因此，体外和/或体内活性不应被显著降低。使用本发明的基于核酸的分子将通过提供组合疗法(例如，靶向不同基因的多种 siRNA分子；与已知小分子调节剂偶联的核酸分子；或者用分子(包括不同基序和/或其它 化学或生物分子)的组合的间歇疗法)的可能性而获得更好的对疾病进程的治疗。用siRNA 分子治疗受试者还包括不同类型的核酸分子的组合，它们例如酶促性核酸分子(核酶)、异 型酶、反义、2，5-A寡腺苷酸、诱饵和适配体。在另一方面，本发明的siRNA分子包含一种或多种5’和/或3’ -帽结构，例如，仅 在正义siRNA链上、仅在反义siRNA链上，或者在两条siRNA链上。IV.核酸分子的递送可对核酸分子(例如siRNA分子)加以改造，使得其适合单独或与其它治疗组 合，用于调节、改善或治疗例如本文所述的多种疾病和病况，例如增殖性疾病和病况和/或癌症，包括乳腺癌，头颈癌(包括多种淋巴瘤，例如，套细胞淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤)、 腺瘤、鳞状细胞癌、喉癌、视网膜癌、食道癌、多发性骨髓瘤、卵巢癌、子宫癌、黑素瘤、结直肠 癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌、成胶质细胞瘤、肺癌(包括非小细胞肺癌)、胰腺癌、宫颈癌、头 颈癌、皮肤癌、鼻咽癌、脂肪瘤、上皮癌、肾细胞癌、胆囊腺癌、腮腺癌、子宫内膜瘤、抗多种药 物的癌；和增殖性疾病和病况，例如，与肿瘤血管新生相关的新血管形成，眼部疾病(例如 黄斑变性(例如湿/干AMD)、角膜新血管形成、糖尿病性视网膜病变、新生血管性青光眼、近 视性变性)和其它增殖性疾病和病况，例如再狭窄和多囊肾病以及与细胞或组织中的靶蛋 白(例如VEGF和/或VEGFr)水平相关或将应答于其的任何其它疾病或病况。例如，siRNA 分子可包含用于施用给受试者的递送载体(包括脂质体)、载体和稀释剂及其盐，和/或其 可以存在于可药用制剂中。用于递送核酸分子的方法被描述于Akhtar等人，1992，Trends Cell Bio. ,2,139 ；Delivery Strategies for Antisense OligonucleotideTherapeutics 编辑，Akhtar，1995，Maurer 等人，1999，Mol. Membr. Biol.，16，129 140 ；Hofland 和 Huang, 1999，Handb. Exp. Pharmacol.，137，165192 和 Lee 等人，2000，ACS Symp. Ser.，752，184 192中，所有这些文献都通过引用并入本文。Beigelman等人，U. S. Pat. No. 6，395，713和 Sullivan等人，PCT WO 94/02595还描述了用于递送核酸分子的一般性方法。这些方案可 用于递送几乎任何核酸分子。可通过本领域技术人员已知的多种方法来将核酸分子施用给 细胞，所述方法包括但不限于包埋于脂质体中，通过离子电渗疗法(见例如WO 03/043689 和WO 03/030989)或通过并入进其它载体，例如可生物降解的聚合物、水凝胶、环糊精(见 例如 Gonzalez 等人，1999，Bioconjugate Chem.，10，1068 1074 ；Wang 等人，国际 PCT 公 开Nos. WO 03/47518和WO 03/46185)、聚乳酸乙醇酸共聚物(PLGA)和PLCA微球体(见 例如U. S. Pat. No. 6，44 7，796和U. S.专利申请公开No. U. S. 2002130430)、可生物降解的 纳米胶囊和生物黏附性微球体，或通过蛋白质性载体(0' Hare和Normand，国际PCT公开 No. WO 00/53722)。在另一实施方式中，本发明的核酸分子还可与聚乙烯亚胺及其衍生物 (例如，聚乙烯亚胺-聚乙二醇-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-GAL)或聚乙烯亚胺-聚乙二 醇-三-N-乙酰半乳糖胺(PEI-PEG-triGAL)衍生物)一起配制或复合。或者，可通过直接 注射或使用输注泵来局部递送核酸/载体组合。 用于增加体内寡核苷酸施用进脊椎动物的效率的其它方法包括使用化学试剂或 物理操作。此类化学试剂包括聚合物(Mumper，R. J.，等人，Pharm. Res. 13 701-709 (1996)； Mumper R. J.,等人，J. Cont. Rel. 52 191-203 (1998) ；Anwer, K.,等人，Pharm. Res, 16 889-895(1999) ；Boussif 0·，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7297-7301 (1995); Orson F. Μ.,等人，J. Immunol. 164 :6313_6321 (2000) ；Turunen Μ. P.,等人，Gene Ther. 6 6-11(1999) ；Shi N. Y.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97 :7567_7572 (2000) ；Rozema, D. B. PNAS early edition July 24,1-6(2007) ；Thomas, Μ.等 K Expet opin.Biol Ther. 5 :495_505 (2005) ；Howard, K. Α·等人 Mol. Ther. 14 :476_484 (2006) ；Leong K. W.， 等 K, J. Controlled Release 53 183-193 (1998) ；Baranov A.,等 K, Gene Ther. 6 1406-1414(1999) ；Lunsford L.，等人，J. Drug Targeting 8 39-50(2000) ；Bertling W. Μ.,等人，Biotechnol. App 1. Biochem. 13 :390_405 (1991) ；Heldel J. D.，PNAS. 104 5715-5721 (2007) ；Schiffelers, R. M.等人 Nucleic Acids Res. 32 :el49 (2004) ；Davis, Μ. Ε.等人 Curr. Med. Chem. 11 179-197 (2004))、去垢剂(Freeman D. J.和 Niven R. W.,Pharm. Res. 13 202-209 (1996) ；Raczka Ε.，等人 Gene Ther. 5 1333-1339(1998))、可协助 寡核苷酸进入细胞脂双层的阳离子或非阳离子性脂类(Liu Y.，等人，Nat. Biotechnol. 15 167-173(1997) ；Eastman S. J.，等人 Hum. Gene Ther. 8 :313_322 (1997) ；Simoes, S.，等 A, Biochim. Biophys. Acta Biomembranes 1463 459-469 (2000) ；Thierry, A. R. , φ A, Gene Ther. 4 226-237 (1997) ；Floch V. , ^ABiochim. Biophys. ActaBiomembranes 1464 95-103(2000) ；Egilmez N. K.,等人 Biochem. Biophys. Res. Commun. 221 169-173 (1996)； Santel A. , Gene Ther. 13 1360-1370 (2006) ；Li, W. Pharm. Res. 24 438-449 (2007), Pirollo, K. F. Cancer Res. 67 (7) 2938-2943 (2007) ；Cardoso, A. L. C. J. Gene Med. 9 170-183(2007) ；Zimmermann，Τ. S.等人 Nature 441 :111_114(2006) ；Chein, P. Y 等人 Cancer Gene Ther. 2 321-328) ；Landen, C. N.等 A Cancer Res. 65 6910-6918(2005)； Morrissey, D. V.等人 Nat Biotechno. 23 1002-1007 (2005))、蛋白质和肽(Ryter J. M.， The EMBO Journal 17 7505-7515 (1998) ；Kumar, P.等人 Nature 448:39-43(2007); Deshayes, S.等人 Biochimica Acta, 1667 141-147 (2004) ；Morris, Μ. C.等人 Nucleic acidsResearch 25 :2730_2736 (1997) ；Simeoni, F.等人 Nucleic acids Research31 2717-2724(2003) ；US patent 5，264，618 和 5，334，761)。其它方法包括使用空细 菌包膜(MacDiarmid J. A.等人 Cancer Cell 11:431-445(2007))，以电的方式开启 肌肉细胞孔以允许更多寡核苷酸进入细胞的电穿孔(Aihara，H.和Miyazaki，J.， Nature Biotechnol. 16 867-870 (1998) ；Mir, L. Μ.,等人，C R Acad Sci. III 321 893-899 (1998)，Mir, L. Μ.，等人，Proc. Natl. Acad. Sci，USA 96 :4262_4267 (1999)； Mathiesen, I. ， Gene Ther. 6 508-514 (1999) ；Rizzuto, G. ， ·入，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:6417-6422(1999) ；Schiffelers, R. Μ.等人 Arthritis and Rheumatism 52: 1314-1318(2005) ；Golzio, Μ.等人 Gene Ther. 12 246-251 (2005))；使用血管内压或水力 递送(Budker, V.，等人，Gene Ther. 5 :272_276 (1998) ；McCaffrey, A. P.等人 Nature 418 28-39(2002))。在一种实施方式中，本发明的SiRNA分子被设计或配制为能特异性靶向内皮细胞 或肿瘤细胞。例如，可利用多种制剂和缀合物来特异性靶向内皮细胞或肿瘤细胞，它们包括 PEI-PEG-叶酸酯、PEI-PEG-RGD、PEI-PEG-生物素、PEI-PEG-胆固醇和本领域已知能特异性 靶向内皮细胞和/或肿瘤细胞的其它缀合物。在一种实施方式中，用于治疗眼部病况(例如黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等) 的化合物、分子或组合物眼内或通过眼内手段施用给受试者。在另一实施方式中，用于治疗 眼部病况(例如黄斑变性、糖尿病性视网膜病变等)的化合物、分子或组合物眼周或通过眼 周手段施用给受试者(见例如Ahlheim等人，国际PCT公开No. WO 03/24420)。在一种实 施方式中，siRNA分子和/或其制剂或组合物眼内或通过眼内手段施用给受试者。在另一 实施方式中，siRNA分子和/或其制剂或组合物眼周或通过眼周手段施用给受试者。眼周 施用通常提供了侵入性较少的途径，来向受试者施用siRNA分子及其制剂或组合物(见例 如Ahlheim等人，国际PCT公开No. WO 03/24420)。使用眼周施用还使得视网膜脱落的风险 最小化，这允许更频繁地给剂量或施用，提供了用于黄斑变性和其它眼部病况的临床相关 的施用途径，还提供了使用存贮体(reservoirs)(例如植入体、泵或其它设备)来递送药物 的可能性。在一种实施方式中，本发明的siRNA化合物和组合物单独或与本文其它化合物和/或疗法组合，局部施用，例如通过眼内或眼周手段，例如注射、离子电渗疗法(见例如WO 03/043689和W003/030989)，或者通过植入体，大约每1_50周施用一次(例如大约每1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、 31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49 或 50 周)。在一种实施 方式中，本发明的siRNA化合物和组合物单独或与本文描述的和/或本领域已知的其它化 合物和/或疗法组合，全身性施用(例如通过静脉内、皮下、肌内、输注、泵、植入体等)，大约 每 1-50 周施用一次(例如大约每 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、 20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、 45、46、47、48、49 或 50 周)。
在一种实施方式中，本发明的核酸分子施用至CNS。实验已证实神经元能有效体 内吸收核酸。作为将核酸局部施用到神经细胞的一个例子，Sommer等人，1998，Antisense Nuc. Acid Drug Dev.，8，75描述了这样的研究，其中，通过向脑中显微注射，将15元的硫 代磷酸酯反义核酸分子(针对c-fos)施用给大鼠。注射后30分钟，神经元排他性地吸收 了经四甲基若丹明-异硫氰酸酯(TRITC)或异硫氰酸荧光素(FITC)标记的反义分子。在 这些细胞中观察到了扩散的胞质染色和核染色。作为核酸全身性施用到神经细胞的例子， Epa 等人，2000，Antisense Nuc. Acid Drug Dev.，10，469 描述了一种体内小鼠研究，其中， β -环糊精_金刚烷_寡核苷酸缀合物被用于靶向神经元型分化的PC12细胞中的ρ75神 经营养因子受体。2周时程的IP施用后，在背根神经节(DRG)细胞中观察到了 ρ75神经营 养因子受体反义的明显吸收。此外，在DRG神经元中观察到了 ρ75的显著且持续的下调。 Broaddus 等人，1998，J. Neurosurg.，88(4)，734 ；Karle 等人，1997，Eur. J. Pharmocol.， 340(2/3)，153 ；Bannai 等人，1998，Brain Research, 784 (1, 2), 304 ；Rajakumar 等人，1997， Synapse,26(3)，199 ；ffu-pong 等人，1999，BioPharm,12(1)，32 ；Bannai 等人，1998，Brain Res. Protoc. ,3(1) ,83 ；Simantov 等人，1996，Neuroscience, 74 (1), 39 中描述了用于核酸 靶向神经元的其它手段。可使用的CNS递送的传统手段包括但不限于，鞘内和脑室内施用， 导管和泵的植入，在受伤或损伤位点直接注射或灌注，注射进脑动脉系统或者通过化学或 渗透开启血脑屏障。其它手段可包括使用多种运送和载体系统，例如通过使用缀合物和可 生物降解的聚合物。另外，基因治疗手段，例如Kaplitt等人，U. S. Pat. No. 6, 180，613和 Davidson, W004/013280中描述的那些，可用于在CNS中表达核酸分子。在一种实施方式中，本发明的核酸分子通过肺部递送来施用，例如通过吸入气溶 胶或喷雾干燥制剂(通过吸入设备或喷雾器施用)，使得核酸分子被快速局部吸收进相关 肺组织中。可通过磨碎干燥或冻干的核酸组合物，然后使微粒化的组合物经过例如400目 筛，以破碎或分离出大的团块，来制备含有可被呼吸的微粒化核酸组合物的干燥颗粒的固 体颗粒组合物。包含本发明核酸组合物的固体颗粒组合物任选可含有分散剂(其作用于协 助气溶胶形成)以及其它治疗性化合物。合适的分散剂是乳糖，其可与核酸化合物以任何 合适的比例(例如重量比1比1)掺合。可通过任何合适的手段来制备包含本发明核酸组 合物的液体颗粒的气溶胶，例如使用喷雾器(见例如U. S. Pat. No. 4，501，729)。喷雾器是 可商业获得的设备，其通过窄液体流动孔(venturi orifice)加速压缩气体(典型地是空 气或氧气)或通过超声波振荡，将活性成分的溶液或悬浮液转化为治疗性气溶胶雾。用于 喷雾器中的合适制剂包括以可至多为制剂40% w/w但优选小于20% w/w的量的处于液体载体中的活性成分。载体典型地是水或稀释水性醇溶液，其优选通过加入例如氯化钠或其 它合适的盐被制造为与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂(如果制剂没有被无菌制备 的话)(例如，对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂、矫味剂、挥发油、缓冲剂和乳化剂以及其它制 剂表面活性剂。可用任何固体颗粒气溶胶发生器，类似地生产包含活性组合物和表面活性 剂的固体颗粒的气溶胶。用于将固体颗粒治疗剂递送给受试者的气溶胶发生器以适于人类 施用的速率，产生可被呼吸的颗粒(如上文所解释的)，以及产生含有预先计量的剂量的治 疗组合物的气溶胶体积。固体颗粒气溶胶发生器的一种阐述性类型是吹入器。用于通过吹 入法施用的合适制剂包括经精细粉碎的粉末，其可通过吹入器递送。吹入器中的粉末(例 如其预先计量的、能有效进行本文所述治疗的剂量)被包含在胶囊或药筒(典型地由明胶 或塑料制成)中，在吸入时该胶囊或药筒原位刺穿或打开，通过空气牵引经过设备或者通 过人工操作的泵来递送粉末。用于吹入器中的粉末仅由活性成分构成，或者由包含活性成 分、合适的粉末稀释剂(例如乳糖)和合适的表面活性剂的粉末掺合物构成。活性成分典 型地占到制剂的0. 1至lOOw/w。第二种类型的阐述性气溶胶发生器包含带计量型剂量吸 入器。带计量型剂量吸入器是加压气溶胶分散器，其典型地含有处于液化推进剂中的活性 成分的悬浮液或溶液制剂。在使用期间，这些设备通过适合递送经计量的体积的阀，将制剂 释放以产生含活性成分的精细颗粒喷雾。合适的推进剂包括某些含氯氟烃化合物，例如，二 氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。制剂可额外含有一种或多种共溶剂 (例如，乙醇)、乳化剂和其它制剂表面活性剂(例如油酸或山梨聚糖三油酸酯)、抗氧化剂 和合适的矫味剂。用于肺部递送的其它方法被描述于例如U. S.专利申请No. 20040037780 和 U. S. Pat. Nos. 6，592，904,6, 582，728,6, 565，885 中。在一种实施方式中，本发明的SiRNA分子以离子电渗疗法施用，例如施用到特定 的器官或区室(例如，眼、眼底、心脏、肝、肾、膀胱、前列腺、肿瘤、CNS等)中。关于离子电 渗疗法递送的非限制性例子被描述于例如WO 03/043689和WO 03/030989中，它们通过引 用整体并入本文。在一种实施方式中，本发明的SiRNA分子与膜破坏试剂(例如U. S.专利申请公开 No. 20010007666中描述的那些，该文献包括附图在内通过引用整体并入本文)复合。在另 一实施方式中，一种或多种膜破坏试剂和siRNA分子还与阳离子脂类或助手(helper)脂类 分子(例如U. S. Pat. No. 6，235，310中描述的那些，该文献包括附图在内通过引用整体并入 本文)复合。因此，本发明涉及包含处于可药用载体(例如稳定剂、缓冲液等)中本发明的一种 或多种核酸的药物组合物。可通过任何标准手段，在有或没有稳定剂、缓冲液等的情况下， 将本发明的寡核苷酸(例如RNA、DNA或蛋白质)形成药物组合物以施用和导入受试者。当 想要使用脂质体递送机制时，可遵循标准的脂质体形成方案。本发明的组合物还可被配制 和用作为片剂、胶囊或酏剂(用于口服施用)、栓剂(用于直肠施用)、无菌溶液/悬浮液 (用于可注射施用)和本领域已知的其它组合物。本发明还包括所描述化合物的可药用制剂。这些制剂包括上述化合物的盐(例如酸加成盐，例如盐酸、氢溴酸、乙酸和苯磺酸盐)。药物组合物或制剂指适于施用(例如全身性施用)进细胞或受试者(包括例如 人)的形式的组合物或制剂。合适的形式部分取决于用途或进入途径，例如口服、透皮或通过注射。此类形式不应阻碍组合物或制剂到达靶细胞(即，想要将带负电荷的核酸递送至 的细胞)。例如，注射进血流的药物组合物应当是可溶的。其它因素是本领域已知的，包括 考虑到阻碍组合物或制剂发挥其作用的毒性和形式。“全身性施用”表示在血流中的药物体内全身性吸收或积累接着在全身中分布。导 致全身性吸收的施用途径包括但不限于静脉内、皮下、腹膜内、吸入、口服、肺内和肌内。这 些施用途径中的每种都将本发明的siRNA分子暴露给可达到的疾病组织。药物进入循环的 速率已显示为分子量或分子大小的函数。使用包含本发明化合物的脂质体或其它药物载体 有望将药物定位于某些组织类型(例如网状内皮系统(RES)的组织)中。可协助将药物与 细胞(例如淋巴细胞和巨噬细胞)表面联结的脂质体制剂也是有用的。该手段可通过利用 巨噬细胞和淋巴细胞对异常细胞的免疫识别的特异性，来增强药物向靶细胞的递送。“可药用制剂”表示这样的组合物或制剂，其允许本发明的核酸分子以最适于其期待活性的方式在体内位置处有效分布。适用于与本发明的核酸分子一起配制的试剂的非 限制性例子包括P-糖蛋白抑制剂(例如Pluronic P85)；可生物降解的聚合物，例如聚 (DL-乙丙交酯)(poly(DL-lactide-coglycolide))微球体，用于缓释递送(Emerich，DF 等 人，1999，Cell Transplant,8,47 58)；以及经装载的纳米颗粒，例如聚氰基丙烯酸丁酯制 造的那些。用于本发明的核酸分子的递送策略的其它非限制性例子包括Boado等人，1998， J. Pharm. Sci.，87，1308 1315 ；Tyler 等人，1999，FEBSLett.，421，280 284 ；Pardridge 等 人，1995，PNAS USA. ,92,5592 5596 ；Boado,1995, Adv. Drug Delivery Rev. ,15,73 107 ； Aldrian-Herrada等人，1998，Nucleic Acids Res. ,26,4910 4916和 Tyler等人，1999，PNAS USA.，96，7053 7058中描述的材料。本发明还涉及使用包含经表面修饰的脂质体的组合物，所述脂质体含有聚(乙二 醇)脂类(经PEG修饰的或长循环脂质体或隐形脂质体(stealthliposomes))。这些制 剂提供了增加药物在靶组织中积累的方法。这类药物载体能抵抗单核吞噬细胞系统(MPS 或RES)的调理作用和清除，由此能够在血液循环中保持更长的时间，以及增强包入胶囊的 药物的组织暴露(Lasic 等人 Chem. Rev. 1995，95，2601 2627 ；Ishiwata 等人，Chem. Pharm. Bull. 1995,43,1005 1011)。此类脂质体已显示能在肿瘤中选择性积累，这大概是通过新 形成血管的靶组织的外渗和捕获导致的(Lasic等人，Science 1995，267，1275 1276 ；Oku 等人，1995，Biochim. Biophys. Acta, 1238，8690)。这些长循环脂质体能增强DNA和RNA的 药物代谢动力学和药物动力学，特别是较之已知能在MPS的组织中积累的传统阳离子脂质 体而言(Liu 等人，J. Biol. Chem. 1995,42, 24864 24870 ;Choi 等人，国际 PCT 公开 No. WO 96/10391 ；Ansell 等人，国际 PCT 公开 No. W096/10390 ；Holland 等人，国际 PCT 公开 No. WO 96/10392)。长循环脂质体还可以比阳离子脂质体更好的程度，保护药物抵挡核酸酶降解， 这基于其避免在具代谢侵略性的MPS组织(例如肝和脾)中积累的能力。本发明还包括制备用来贮藏或施用的组合物，其中包括药物有效量的想要的化合 物，其处于可药用载体或稀释剂中。对于治疗用途而言可接受的载体或稀释剂是制药领 域已知白勺，其被描述于例如 Remington' sPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Germaro编辑，1985)中，该文献通过引用并入本文。例如，可提供防腐剂、稳定剂、 染料和矫味剂。它们包括苯甲酸钠、山梨酸和对羟基苯甲酸的酯。此外，可使用抗氧化剂和 悬浮剂。
药物有效剂量是对疾病状态加以预防、抑制其发生或治疗(将症状减轻至一定程 度，优选所有症状)所需的剂量。药物有效剂量取决于疾病类型、所使用的组合物、施用途 径、被治疗的哺乳动物的类型、考虑的特定哺乳动物的身体特征、同时进行的治疗以及医药 领域技术人员将认识到的其它因素。通常，施用的活性成分的量在0. lmg/kg体重/天至 100mg/kg体重/天之间，这取决于带负电荷的聚合物的效力。本发明的核酸分子及其制剂可以以含有传统非毒性可药用载体、佐剂和/或载体 的剂量单位制剂的形式，口服、局部、胃肠道外、通过吸入或喷雾或直肠施用。术语胃肠道外 在本文中使用时包括经皮、皮下、血管内(例如静脉内)、肌内或鞘内注射或输注技术等。此 夕卜，本发明提供了包含本发明的核酸分子和可药用载体的药物制剂。本发明的一种或多种 核酸分子可与一种或多种非毒性可药用载体和/或稀释剂和/或佐剂以及如果需要的话其 它活性成分联合存在。含有本发明核酸分子的药物组合物可以是适于口服使用的形式，例 如作为片剂、糖锭(troches)、锭剂(lozenges)、水性或油性悬浮液、可分散粉末或颗粒、乳 液、硬或软胶囊或糖浆或酏剂。可按照本领域已知用于生产药物组合物的任何方法，来制备意欲口服使用的组合 物，此类组合物可含有一种或多种增甜剂、矫味剂、着色剂或防腐剂，以提供药学上精巧可 口的制剂。片剂含有与适用于生产片剂的非毒性可药用赋形剂混合的活性成分。这些赋形 剂可以是，例如，惰性稀释剂，例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠；制粒和崩解剂， 例如，玉米淀粉或褐藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；以及润滑剂，例如硬脂酸 镁、硬脂酸或滑石。片剂可以是不经包覆的，或可通过已知技术对其进行包覆。在一些情况 下，可通过已知技术制备此类包覆，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收，由此在较长时间内持 续提供作用。例如，可使用时间延迟性材料，例如甘油单硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯。用于口服使用的制剂还可呈现为硬明胶胶囊(其中活性成分与惰性固体稀释剂 (例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土)混合)或软明胶胶囊(其中，活性成分与水或油介质(例 如花生油、液体石蜡或橄榄油)混合)。水性悬浮液含有与适用于生产水性悬浮液的赋形剂混合的活性材料。此类赋形 剂是悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙甲基纤维素、褐藻酸钠、聚乙烯吡咯 烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或湿润剂可以是天然存在的磷脂，例如卵磷脂，或氧化烯 与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧乙烯硬脂酸酯，或者氧化乙烯与长链脂肪醇的缩合产物，例 如十七乙烯氧鲸蜡醇(h印tadecaethyleneoxycetanol)，或氧化乙烯与源于脂肪酸和己糖 醇的部分酯的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇单油酸酯，或氧化乙烯与源于脂肪酸和脱 水己糖醇(hexitol anhydrides)的部分酯的缩合产物，例如聚乙烯去水山梨糖醇单油酸 酯。水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(例如，对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸正 丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种矫味剂以及一种或多种增甜剂(例如蔗糖或糖精)。可通过将活性成分悬浮于植物油(例如花生油、橄榄油、芝麻油或椰油)或矿物油 (例如液体石蜡)中，来配制油性悬浮液。油性悬浮液可含有增稠剂，例如蜂蜡、硬石蜡或鲸 蜡醇。可加入增甜剂和矫味剂，以提供可口的口服制剂。可通过加入抗氧化剂(例如抗坏 血酸)来防腐这些组合物。适用于通过加水来制备水性悬浮液的可分散粉末和颗粒将活性成分提供于与分 散剂或湿润剂、悬浮剂和一种或多种防腐剂混合的混合物中。合适的分散剂或湿润剂或悬浮剂的例子是上文已经给出的那些。也可存在其它赋形剂，例如增甜剂、矫味剂或着色剂。本发明的药物组合物还可以是水包油乳液的形式。油相可以是植物油或矿物油或 它们的混合物。合适的乳化剂可以是天然存在的胶，例如阿拉伯胶或黄蓍胶，天然存在的磷 月旨，例如大豆、卵磷脂，以及源于脂肪酸和己糖醇、酸酐的酯或部分酯，例如去水山梨糖醇单 油酸酯，以及所述部分酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯去水山梨糖醇单油酸酯。乳 液还可含有增甜和矫味剂。可用增甜剂(例如甘油、丙二醇、山梨糖、葡萄糖或蔗糖)来配制糖浆和酏剂。此 类制剂还可含有缓和剂、防腐剂和矫味剂和着色剂。药物组合物可以是无菌可注射的水性 或油质悬浮液的形式。可使用那些合适的分散剂或湿润剂以及悬浮剂(上文已提到)，根据 本领域的已知内容，来配制该悬浮液。无菌可注射制剂还可以是非毒性肠胃外可接受的稀 释剂或溶剂的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1，3_ 丁二醇的溶液。可使用的可接受载 体和溶剂包括水、Ringer’ s溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的非挥发油传统上也可用 作为溶剂或悬浮介质。就此目的而言，可使用任何温和的非挥发油，包括合成的甘油单酯或 甘油二酯。此外，脂肪酸，例如油酸，可用于制备可注射制剂。本发明的核酸分子还可以以栓剂的形式施用，例如用于直肠施用药物。可通过将 药物与合适的无刺激性赋形剂(其普通温度下是固体但是在直肠温度下是液体，因此可在 直肠中溶化以释放药物)混合，来制备这些组合物。此类材料包括可可脂和聚乙二醇。本发明的核酸分子可在无菌介质中肠胃外施用。取决于所使用的载体和浓度，药 物可悬浮或溶解于载体中。有利地，可将佐剂(例如局部麻醉剂)、防腐剂和缓冲剂溶于载 体中。每天每千克体重大约0. Img至大约140mg的数量级上的剂量水平可用于治疗上文 指出的病况(每天每受试者大约0. 5mg至大约7g)。可与载体材料组合以生产单一剂量形 式的活性成分的量根据接受治疗的宿主和特定施用模式而变化。剂量单位形式通常含有大 约Img至大约500mg的活性成分。应当理解，用于任何特定受试者的特定剂量水平取决于多种因素，这包括所使用 的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康情况、性别、膳食、施用时间、施用途径、排泄率、 药物组合和接受治疗的特定疾病的严重程度。为施用给非人动物，还可将组合物加入到动物饲料或饮用水中。配制动物饲料和 饮用水组合物，以令动物随其膳食摄入治疗合适量的组合物，这可能是方便的。将组合物制 备为用于加入进饲料或饮用水的预混合物，也可能是方便的。本发明的核酸分子还可与其它治疗性化合物组合施用给受试者，以增加总体治疗 效果。使用多种化合物来治疗适应症可增加有益作用同时降低副作用的存在。在一种实施方式中，本发明包含适用于将本发明的核酸分子施用给特定细胞类 型的组合物。例如，脱唾液酸糖蛋白受体(ASGPr) (Wu和Wu, 1987，J. Biol. Chem. 262,4429 4432)是肝细胞特有的，其结合带支链的半乳糖末端糖蛋白，例如，脱唾液酸血清类粘蛋 白(ASOR)。在另一例子中，叶酸受体在很多癌细胞中过量表达。此类糖蛋白、合成的糖 缀合物或者叶酸与受体的结合以强烈依赖寡糖链分支程度的亲和性进行，例如，三枝结构 (triatennary structures)就以 t匕二枝(biatenarry)或单枝(monoatennary)链更高白勺 亲和性结合(Baenziger 和 Fiete，1980，Cell，22，611 620 ;Connolly 等人，1982，J.Biol.Chem. ,257,939 945)。Lee 和 Lee，1987，Glycoconjugate J. ,4,317 328 通过使用 N-乙 酰-D-半乳糖胺作为碳水化合物基元(其较之半乳糖有更高的受体亲和性)，获得了这种 高特异性。针对甘露糖基结尾的糖蛋白或糖缀合物，也报导了这种“簇效应”(Ponpipom等 人，1981，J. Med. Chem. ,24,1388 1395)。使用基于半乳糖、半乳糖胺或叶酸的缀合物来将 外来化合物运送通过细胞膜，可提供靶向递送手段，以例如治疗肝病、肝癌或其它癌症。使 用生物缀合物也可降低治疗所需的治疗性化合物的需要剂量。此外，可通过使用本发明 的核酸生物缀合物，来调节治疗的生物利用率、药物动力学和药物代谢动力学参数。此类 生物缀合物的非限制性例子被描述于2001年8月13日提交的Vargeese等人，U. S. Ser. No. 10/201，394 和 2002 年 5 月 17 日提交的 Matulic-Adamic 等人，U. S. Ser. No. 10/151，116 中。在一种实施方式中，本发明的核酸分子与纳米颗粒(例如乙肝病毒S、M或L包膜蛋白 (见例如 Yamado 等人，2003，Nature Biotechnology, 21,885))复合或共价连结。在一种 实施方式中，本发明的核酸分子特异递送至人肿瘤细胞，特别是非凋亡性人肿瘤细胞，其包 括，例如，T-细胞、肝细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞、黑素瘤细胞、肠上皮细胞、前列腺细胞、 睾丸细胞、非小细胞肺癌、小细胞肺癌等。
或者，本发明的某些SiRNA分子可在细胞中从真核启动子启动表达(例如， Izant 禾口 Weintraub，1985， Science,229, 345 ；McGarry 禾口 Lindquist，1986，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA 83，399 ;Scanlon 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA，88，10591 5 ； Kashani-Sabet 等人，1992，Antisense Res. Dev. ,2,3 15 ；Dropulic 等人，1992，J. Virol.， 66，143241 ；Weerasinghe 等人，1991，J. Virol.，65，55314 ；Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10802 6 ;Chen 等人，1992，Nucleic Acids Res. ,20,4581 9 ;Sarver 等 人，1990Science，247，1222 1225 ;Thompson 等人，1995，Nucleic Acids Res.,23,2259 ； Good等人，1997，Gene Therapy，4，45)。本领域技术人员知道，任何核酸都可从合适的 DNA/RNA载体表达于真核细胞中。可通过酶促性核酸将其从初级转录本释放，来增加此类 核酸的活性(Draper 等人，PCT W093/23569 和 Sullivan 等人，PCT WO 94/02595 ；Ohkawa 等人，1992，NucleicAcids Symp. Ser. ,27,15 6 ;Taira 等人，1991，Nucleic Acids Res., 19，512530 ;Ventura 等人，1993，Nucleic Acids Res. ,21,3249 55 ;Chowrira 等人，1994， J. Biol. Chem，269，25856)。在本发明的另一方面，本发明的RNA分子可从插入进DNA或RNA载体的转录单 元表达(见例如Couture等人，1996，TIG.，12，510)。重组载体可以是DNA质粒或病毒载 体。可基于但不限于腺相关病毒、逆病毒、腺病毒或α病毒，来构建表达siRNA的病毒载 体。在另一实施方式中，可使用基于pol III的构建体，来表达本发明的核酸分子(见例如 Thompson, U. S. Pas. Nos. 5，902, 880 和 6，146，886)。可按照上文递送能表达 siRNA 分子的 重组载体，它们可在靶细胞中持久保持。或者，可使用病毒载体，提供核酸分子的瞬时表达。 如果必要的话，此类载体可重复施用。一旦表达，siRNA分子即与靶mRNA发生相互作用，产 生RNAi应答。表达siRNA分子的载体的递送可以是全身性的，例如通过静脉内或肌内施用， 通过向从受试者中外植的靶细胞施用接着再引入进受试者，或者通过能允许引入目标靶细 胞的任何其它手段来进行(综述参见Couture等人，1996，TIG.，12，510)。在一个方面，本发明涉及包含编码本发明的至少一种siRNA分子的核酸序列的表 达载体。所述表达载体可编码siRNA双链体的一条或两条链，或者单条自身互补的链，其自身杂交成siRNA双链体。编码本发明的siRNA分子的核酸序列可以以能允许siRNA分子表达的方式有效地相连(见例如 Paul 等人，2002，Nature Biotechnology, 19, 505 ；Miyagishi 禾口 Taira，2002，Nature Biotechnology，19，497 ;Lee 等人，2002，Nature Biotechnology, 19，500 和 Novina 等人，2002，Nature Medicine，进一步的在线公开 doi :10· 1038/nm725)。在另一个方面，本发明涉及表达载体，其包含a)转录起始区域(例如真核pol I、 II或III起始区域)；b)转录终止区域(例如真核pol I、II或III终止区域)和C)编码 制少一条本发明siRNA分子的核酸序列，其中所述序列与所述起始区域和所述终止区域以 允许表达和/或递送siRNA分子的方式有效相连。载体可任选包括与本发明siRNA编码序 列的5’侧或3’侧有效相连的蛋白质的开放读码框(ORF)；和/或内含子(居间序列)。可由用于真核RNA聚合酶I (pol 1)、1 嫩聚合酶11( 01 II)或RNA聚合酶III (pol III)的启动子，来驱动SiRNA分子序列的转录。来自pol II或pol III启动子的转录本 在所有细胞中以高水平表达；给定的pol II启动子在给定的细胞类型中的水平取决于附 近存在的基因调控序列(增强子、沉默子等)的性质。如果原核RNA聚合酶在合适的细胞 中能表达的话，还可使用原核RNA聚合酶启动子(Elroy-Stein和Moss，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87,6743 7 ;Gao 和 Huang 1993，Nucleic Acids Res. ,21,2867 72 ；Lieber 等人，1993，Methods Enzymol. ,217,47 66 ;Zhou 等人，1990，Mol. Cell. Biol.，10，4529 37)。若干研究者发现，从此类启动子表达的核酸分子可在哺乳动物细胞中发挥功能(例 如 Kashani-Sabet 等人，1992，Antisense Res. Dev. ,2,315 ；Ojwang 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89,10802 6 ;Chen 等人，1992，Nucleic Acids Res. ,20,4581 9 ;Yu 等人， 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,6340 4 ;L' Huillier 等人，1992，EMBO J, 11,4411 8 ； Lisziewicz 等人，1993，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α.，90,8000 4 ；Thompson 等人，1995， Nucleic Acids Res. ,23,2259 ；Sullenger & Cech，1993，Science, 262，1566)。更具体地，可 使用转录单元，例如源于编码U6小核(snRNA)、转运RNA(tRNA)和腺病毒VA RNA的基因的 那些，在细胞中产生高浓度的想要的RNA分子，例如siRNA (上文的Thompson等人；Couture 禾口 Stinchcomb，1996 ；Noonberg 等人，1994，Nucleic Acid Res. ，22，2830 ；Noonberg 等人， U. S. Pat. No. 5，624，803 ；Good 等人，1997, GeneTher. ,4,45 ；BeigeIman 等人，国际 PCT 公开 No. WO 96/18736)。上述siRNA转录单元可并入多种载体，用于引入哺乳动物细胞，它们包 括但不限于质粒DNA载体、病毒DNA载体(例如腺病毒或腺相关病毒载体)或病毒RNA载 体(例如逆病毒或α病毒载体)(综述参见上文的Couture和Stinchcomb，1996)。在另一方面，本发明涉及下述表达载体，其包含以允许下述siRNA分子表达的方 式编码至少一种本发明的siRNA分子的核酸序列。在一种实施方式中，表达载体包含a)转 录起始区域；b)转录终止区域；和c)编码siRNA分子的至少一条链的核酸序列，其中所述 序列以允许siRNA分子表达和/或递送的方式与起始区域和终止区域有效地相连。在另一实施方式中，表达载体包含a)转录起始区域；b)转录终止区域；C)开放 读码框；和d)编码siRNA分子的至少一条链的核酸序列，其中所述序列与开放读码框的3’ 末端有效地相连，并且其中所述序列以允许siRNA分子表达和/或递送的方式与起始区域、 开放读码框和终止区域有效地相连。在又一实施方式中，表达载体包含a)转录起始区域； b)转录终止区域；c)内含子；和d)编码至少一种siRNA分子的核酸序列，其中，所述序列以 允许核酸分子表达和/或递送的方式与起始区域、内含子和终止区域有效地相连。
在另一实施方式中，表达载体包含a)转录起始区域；b)转录终止区域；C)内含 子；d)开放读码框；和e)编码siRNA分子的至少一条链的核酸序列，其中所述序列所述序 列与开放读码框的3’末端有效地相连，并且其中以允许siRNA分子表达和/或递送的方式 与起始区域、内含子、开放读码框和终止区域有效地相连。V.某些试剂盒本发明的教导还提供了涉及来协助本发明方法的试剂盒。试剂盒可用于提升公开 的方法的性能，这通过将实现某些方法所需的两种或多种组分组装起来而实现。试剂盒可 含有预先测量的单位量的组分，从而使得最终使用者的测量需求最小化，并且还可包括进 行一种或多种公开的方法的说明书。典型地，对试剂盒的组分加以优化，使得其互相联合运 行。公开的试剂盒可用于对寡核苷酸(包括小RNA分子和包含脱氧核糖核苷酸的寡核苷 酸)进行鉴定、检测和/或定量。在某些实施方式中，包含反转录引物的试剂盒包含具有 寡核苷酸识别序列的寡核苷酸分子结合部分，所述序列包含位于3’区域与寡核苷酸分子的 区域互补的至少2个核苷酸以及位于5’区域包含至少2个核苷酸的延伸尾；正向引物，其 中所述正向引物包含寡核苷酸分子结合部分，其中包含与寡核苷酸分子的区域相同的至少 2个核苷酸；以及反向引物。在某些实施方式中，此类试剂盒包含第一引物组，其中包括正 向和相应的反向引物。在某些实施方式中，公开的试剂盒还包含第二引物组，其包括但不限 于通用正向引物、通用反向引物或两者；报道探针；报道基团；反应容器，其包括但不限于 多孔板或微流体设备；底物；缓冲液或缓冲盐；表面活性剂；或其组合。在某些实施方式中， 公开的试剂盒还可包含第一延伸酶、第二延伸酶和/或第三延伸酶。 实施例试剂使用下述寡聚DNA 反转录(RT-)弓| 物5，-GTATCC AGT GCA GGGTCC GGT CGA-3，(SEQ ID NO 1)；正向(FW-)引物5，-GCG TTGAGG TTT GAA ATC-3，(SEQ ID NO: 2)；反向(Rev-)引物:5，-GTA TCCAGT GCA GGG TCC-3，(SEQ ID NO :3)。针对 VEGFR2 的 siRNA 反义序歹Ij :5，-UUG AGG UUU GAA AUC GAC Cx_3，(SEQ ID NO 4) (χ 是 C3-连接子)。TaqMan MicroRNA(Part no. 4346906) > Taqman 2 X Universal PCR Master 混合物(Part no. 4324018)和 MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板(Part no. 4366597) 购自 Applied Biosystems0 SYBR GreenI (S7563)从 Invitrogen 获得。用于两步RT-PCR的方案在无RNAse的水中将血浆分别稀释10、100和1000倍(根据经验建立最佳稀释)。 在无RNAse的水中，通过对双链siRNA进行系列稀释，获得标准曲线。在第一步中，在95°C 对样品加热5分钟，在操作台上令其冷却至室温。随后，将3μ1样品与12μ1 RT-缓冲液 混合，缓冲液含有0. 15 μ IlOOmM dNTP、2yl 0. 5 μ M RT-引物、1.5μ1 IOXRT-缓冲液、 1. 0μ IMultiscribe 反转录酶 50U/μ 1、0· 19 μ 1 RNAse 抑制剂 20U/μ 1 禾Π 7. 16 μ 1 无 RNAse 的水。将RT混合物施加到96孔MicroAmp板上，在16°C (30分钟),42°C (30分钟),85°C (5 分钟)孵育，然后保持于4°C。在第二步骤中，将3μ1 RT反应物与12 μ 1 PCR缓冲液混合， 缓冲液含有0. 3μ1 IOyMFW引物、0. 3μ 1 10 μ M通用Rev引物、3. 8 μ 1无RNAse的水、 7. 5μ 1 Taqman2XUniversal PCR Master 混合物和 0· 1 μ 1 100XSYBR Green I。用下述参数进行PCR反应1个循环95°C 10分钟；45个循环95°C 15秒，50°C 1分钟。数据分析使用系统软件(7500或7900HT Fast System软件)分析数据。针对每份样 品，通过减去无模板对照样品的Ct-值，来计算Δ Ct-值(Taqman阈值循环)。用公式 EXP(-In(2)* Δ Ct)将ACt值转化为线性信 号。在EXCEL中绘制标准曲线。示出的值代表 每微升血浆的siRNA浓度(三种稀释的平均信号以及其相应的标准偏差)。图1示出了实验结果，其显示了使用两步RT-PCR对血浆中siRNA的定量。用IOmg/ kg siRNA或100mg/kg，经腹膜内(i. ρ)或通过管饲(ρ.ο 经口)来处理小鼠(每组三只动 物)。施用后数分钟内获取血浆(TO)。上面的图显示针对VEGFR2检测的经修饰siRNA的标 准曲线。针对信号强度对siRNA的量绘图。使用线性回归计算斜率(0. 9882)、截距(0. 9564) 和R-平方(0.9984)。下面的图显示了柱状图，其代表在每组一只小鼠中通过RT-PCR检测 的每微升血浆的VEGFR2-siRNA的量(fmol)。为进行比较，将每只动物的血浆(1. 25 μ 1)上 样到凝胶上，用SYBR GOLD染色。作为参照，还在凝胶上包括进从0. 1到6. 3pmol siRNA范 围的的稀释系列。实施例2 使用一步RT-PCR检测血浆中的siRNA试剂用于检测针对VEGFR2 的 siRNA 反义序列5，_UUG AGG UUU GMAUC GAC Cx_3，(SEQ ID NO 5) (x是C3-连接子)，使用下述寡聚DNA 反转录(RT-)引物5，GTA TCC AGT GCA GGG TCC GGT CGA-3，(SEQ ID NO 6)；正向(Fff-)引物5，-GCG TTG AGG TTT GAAATC-3，(SEQ ID NO 7)；反向(Rev-)引物5，-GTA TCC AGT GCAGGG TCC-3，(SEQ ID NO :8)。TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒(Part no. 4346906)和 MicroAmpFast 光学 96 孔 反应板(Part no. 4366597)购自 Applied Biosystems0 SYBRGreen I (S7563)和 ROX参照染 料(cat. no 12223-012)从 Invitrogen 获得。Taq 聚合酶(cat. No 04738225001)从 Roche 获得。样品描述将肿瘤培养7天。在第7天，从首次用于实验的小鼠收集血浆，用载体(小鼠1至 6)、0. 2mg VEGFR2siRNA(小鼠 7 至 12)或 2. Omg VEGFR2siRNA(小鼠 13 至 18)来处理。随 后,施用VEGFR2siRNA后1小时后分离血浆(小鼠19至24 0. 2mg VEGFR2 siRNA/小鼠25 至30 2. 0mgVEGFR2 siRNA)。第14天，从经载体处理的小鼠(31至36)；经0. 2mgVEGFR2 siRNA处理的小鼠(37至42)和经2. Omg VEGFR2处理的动物(43-48)分离血浆。该数据组 反映了 siRNA施用后24小时的siRNA水平。还在siRNA处理之后1小时收集血浆(小鼠 49 至 54 0. 2mg VEGFR2siRNA/ 小鼠 55 至 60 2. Omg VEGFR2 siRNA)。用于一步RT-PCR的方案在无菌无RNAse的水中将血浆稀释10倍。制备VEGFR2 siRNA标准，在95°C对样品 和标准都加热5分钟，随后在冰上冷却。将5 μ 1样品与10 μ IRT-PCR缓冲液混合，缓冲液含 有0. 15μ1 IOOmM dNTP、0. 1 μ 1 10 μ M RT-引物、0. 3 μ 1 10 μ M FW-引物、0. 3 μ 1 10 μ M Rev-引物、1·5μ1 10XRT-缓冲液、0· 1 μ 1 100 X SYBR Green Ι、0·03μ1 ROX 参照染料、 0· 5 μ 1 Multiscribe 反转录酶(50U/ μ 1)、0· 19 μ 1 RNAse 抑制剂(20U/ μ 1)、0· 15 μ 1 Taq 聚合酶(IU/ μ 1)和6. 68 μ 1无RNAse的水。将PCR混合物施加到96孔MicroAmp板上，随后在16°C (30分钟)、42°C (30分钟)、95°C (10分钟)孵育，接着进行45个循环95°C (15 秒),500C (1分钟，获得数据)，这使用9800Fast热循环仪(Applied Biosystems)来进行。 使用系统软件分析数据(7500Fast System软件)。数据分析在EXCEL中绘制标准曲线，使用线性回归，获得式y = ax+b中的a和b的值。使 用该式，将样品的Ct值转化为每微升血浆飞克siRNA的值。描述的值代表同一组内所有动 物的平均值以及相应的标准偏差。图2显示了使用一步RT-PCR对血浆中siRNAs的定量。通过管饲(p.o 经口)，用 载体或含有0. 2mg或2. Omg针对编码VEGFR2的mRNA的siRNA的载体，处理小鼠。从首次 用于实验的小鼠(第7天T0)，处理后1小时(第7天处理后1小时，和第14天处理后 1小时)以及最后一次处理后24小时(第14天处理后24小时)分离血浆。siRNA。使用 标准曲线(上图)来计算检测到的血浆中的siRNA的量。柱状图代表每组内的平均siRNA 水平及其相应的标准偏差(下图)。实施例3 使用两步RT-PCR检测组织中的siRNA将基于SYBR Green I的检测与FAM/TAMRA探针的检测进行比较试剂针对基于SYBR Green I的对siRNA的检测，使用下述寡聚DNA 反转录(RT-)弓丨 物5，-GCG TAT CGA GTG CAG GAT CCA CTT TC-3，(SEQ ID NO 9)；正向(FW-)引物5，_GCG TGT TCT TGT CAT TGA-3，(SEQ ID NO 10)；反向(Rev-)引物5，-GCG TAT CGA GTG CAG G-3，(SEQ ID NO :11)。针对基于FMA/TAMRA的对siRNA的检测，使用下述寡聚DNA 反转录(RT-)引物 5，-GCG TAT CGA GTG CAG GAT CCT GGA AGCAGC MC TTT C_3，(SEQ ID NO 12)；正向(FW-) 引物5，-GCG TGTTCT TGT CAT TGA-3' (SEQ ID NO 13)；反向(Rev-)引物5，-GCGTAT CGA GTG CAG G-3，(SEQ ID NO 14)；探针5，FAM_TGG AAGCAG CM CTT TCA ATG A_3，TAMRA(SEQ ID NO :15)。反义 siRNA 序列 ND9227 :5，-UGU UCU UGU cAU UGA AAG UTsT-3，(SEQ IDNO 16)。反义 siRNA 序列 AD1955 :5，-UCGAAGuACUcAGCGuAAGTsT-3，(SEQ ID NO: 17)。TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒(Partno. 4346906)和 MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板(Part no. 4366597)购自 Applied Biosystems. ROX 参照染料(cat. no 12223-012)从 Invitrogen 获得，Taq 聚合酶(cat. no 11647679001)从 Roche 获得。样品描述大鼠41 和 42 低渗盐水(IOOmOsmol/kg 水)。大鼠 49 和 50 :10mg/kgsiRNA AD1955，以24小时间隔给两次剂量，最后一次处理后24小时时进行收获。大鼠57和58 50mg/kg siRNA AD1955，以24小时间隔给两次剂量，最后一次处理后24小时时进行收获。 大鼠65和66 :10mg/kg siRNAND9227,以24小时间隔给两次剂量，最后一次处理后24小时 时进行收获。大鼠73和74 :50mg/kg siRNA ND9227,以24小时间隔给两次剂量，最后一次 处理后24小时时进行收获。从组织分离siRNA:使用手持Polytron (PT1200，Kinematica AG, Switzerland)，在 TRIZOL (每 IOOmg 组织Iml TRIZ0L)中对经粉碎的冷冻肺组织进行勻浆均质化。在室温下对勻浆孵育5分钟，加入氯仿(200μ 1/lml TRIZOL)后，对样品剧烈振荡15秒，接着在12000rpm离心15分钟 (2-80C ) 0将上面的相转移到新的管中，通过加入2-丙醇(500μ 1/lml TRIZOL)接着在室 温孵育10分钟来沉淀RNA。在12000rpm离心10分钟(2_8°C )后，用Iml冰冷的75% EtOH 洗沉淀，并将其重新悬浮于无RNAse的水中。使用NanoDrop ND-100分光光度计(Witec AG) 测定RNA浓度。为进行RT-PCR的目的，将所有样品调节至IOng/ μ 1的终RNA浓度。用于两步RT-PCR的方案
在95 V对RNA样品(IOng/ μ 1)加热5分钟，在冰上冷却。将5 μ 1样品与 10 μ 1 RT-缓冲液混合，缓冲液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 1 μ 110 μ M RT-引物、1.5μ1 10XRT-缓冲液、0· 5 μ 1 Multiscribe 反转录酶 50U/μ 1、0· 19 μ 1 RNAse 抑制剂 20U/μ 1 和7. 56 μ 1无RNAse的水。将RT-混合物施加到96孔MicroAmp板上，在16°C (20分钟)、 420C (20分钟)、85°C (5分钟)孵育，然后保持于4°C。随后，将5 μ 1 RT-反应物与10 μ 1 PCR 缓冲液混合，缓冲液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 3 μ 1 10 μ M Fff-引物、0. 3 μ 110 μ M Rev-引物、0.3μ1 30 μ M FAM/TAMRA 探针、1. 5 μ 1 10XPCR-缓冲液(+MgC12)、0· 03 μ 1 ROX参照染料、0. 12 μ 1 Taq聚合酶(5υ/μ 1)和7. 3 μ 1无RNAse的水。采用基于SYBR Green I的检测，用0. 1 μ 1 100Χ CYBRGreen I代替FAM/TAMRA探针，相应地调节终体积。 将PCR混合物施加到96孔MicroAmp板上，随后95°C孵育(5分钟)，接着进行40个循环 950C (15秒)、58°C (30秒)和72°C (1分钟，获取数据)，这使用9800Fast热循环仪(Applied Biosystems)来进行。使用系统软件(7500FastSystem软件)分析数据。数据分析针对每种样品，通过减去无模板对照样品的Ct-值，来计算ACt-值(Taqman阈值 循环)。用公式EXP(-In(2)* Δ Ct)将Δ Ct值转化为相对信号强度。示出的值代表两次独 立RT-PCR反应的平均信号及其标准偏差。图3显示了对使用SYBR Green I或经FAM/TAMRA标记的探针作为读出剂对siRNAs ND9227进行基于两步RT-PCR的检测的比较。在从用siRNA ND-9227 (10mg/kg ；大鼠65/66， 50mg/kg ；大鼠 73-74)或AD1955 (10mg/kg ；大鼠 49/50，50mg/kg ；大鼠 57-58)处理的大鼠肺 或保持未处理(大鼠41/42)的大鼠肺获得的50ng总RNA上进行两步RT-PCR。使用SYBR Green 1(上面的图)作为信号强度的读出剂或经FAM/TAMRA标记的探针(下面的图)，建 立相对表达(通过信号强度反映)。柱状图代表两次独立的RT-PCR反应的平均值及它们相 应的标准偏差(η = 2，士stdev)。实施例4 使用FAM/TAMRA探针在大鼠肺中定量检测siRNA试剂使用下述寡聚DNA 反转录(RT-)引物5，-GCG TAT CGA GTGCAG GAT CCT GGA AGC AGC AAC TTT C_3，(SEQ ID N0:18)；正向(Fff-)引物5，-GCG TGT TCT TGT CAT TGA-3，(SEQ ID NO 19)；反向(Rev-)引物5，-GCG TAT CGA GTG CAG G_3，(SEQ ID NO 20)；探针5'FAM-TGG AAG CAG CAA CTT TCA ATG A_3，TAMRA(SEQID NO :21)。反义 siRNA 序列 ND9227 :5，-UGU UCU UGU cAU UGA AAGUTsT-3，(SEQ ID NO :22)。TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒(Part no. 4346906)和 MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板(Part no. 4366597) 购自 Applied Biosystems。ROX 参照染料(cat. no :12223_012)从 Invitrogen 获得，Taq 聚合酶(cat. no 11 647 679 001)从 Roche 获得。
样品描述大鼠41 和 42 低渗盐水(IOOmOsmol/kg 水)。大鼠 49 和 50 :10mg/kgsiRNA AD1955，以24小时间隔给两次剂量，最后一次处理后24小时时进行收获。大鼠57和58 50mg/kg siRNA AD1955，以24小时间隔给两次剂量，最后一次处理后24小时时进行收获。 大鼠65和66 :10mg/kg siRNAND9227,以24小时间隔给两次剂量，最后一次处理后24小时 时进行收获。大鼠73和74 :50mg/kg siRNA ND9227，以24小时间隔给两次剂量，最后一次 处理后24小时时进行收获。从组织分离siRNA:使用手持Polytron (PT1200，Kinematica AG, Switzerland)，在 TRIZOL (每 IOOmg 组织Iml TRIZ0L)中对经粉碎的冷冻肺组织进行勻浆同质化。在室温下对勻浆孵育5分钟， 加入氯仿(200μ 1/lml TRIZ0L)后，对样品剧烈振荡15秒，接着在12000rpm离心15分钟 (2-80C ) 0将上面的相转移到新的管中，通过加入2-丙醇(500μ 1/lml TRIZ0L)接着在室 温孵育10分钟来沉淀RNA。在12000rpm离心10分钟(2_8°C )后，用Iml冰冷的75% EtOH 洗沉淀，并将其重新悬浮于无RNAse的水中。使用NanoDrop ND-100分光光度计(Witec AG) 测定RNA浓度。为进行RT-PCR的目的，将所有样品调节至IOng/ μ 1的终RNA浓度。用于两步RT-PCR的方案在95 V对RNA样品(IOng/ μ 1)加热5分钟，在冰上冷却。将5 μ 1样品与 10 μ 1 RT-缓冲液混合，缓冲液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 1 μ 110 μ M RT-引物、1.5μ1 10XRT-缓冲液、0. 5 μ 1 Multiscribe 反转录酶 50U/μ 1、0· 19 μ 1 RNAse 抑制剂 20U/μ 1 和7. 56 μ 1无RNAse的水。将RT-混合物施加到96孔MicroAmp板上，在16°C (20分钟)、 420C (20分钟)、85°C (5分钟)孵育，然后保持于4°C。随后，将5 μ 1 RT-反应物与10 μ 1 PCR 缓冲液混合，缓冲液含有0. 15 μ 1 IOOmM dNTP、0. 3 μ 1 10 μ M Fff-引物、0. 3 μ 110 μ M Rev-引物、0.3μ1 30 μ M FAM/TAMRA 探针、1. 5 μ 1 10XPCR-缓冲液(+MgC12)、0· 03 μ 1 ROX参照染料、0. 12 μ 1 Taq聚合酶(5U/ μ 1)和7. 3 μ 1无RNAse的水。将PCR混合物施 加到96孔MicroAmp板上，随后95°C孵育(5分钟)，接着进行40个循环95°C (15秒)和 600C (1分钟，获取数据)，这使用9800Fast热循环仪(Applied Biosystems)来进行。使用 系统软件(7500Fast System软件)分析数据。数据分析针对每种样品，通过减去无模板对照样品的Ct-值，来计算ACt-值(Taqman阈值 循环)。用公式EXP (-In (2)* Δ Ct)将Δ Ct值转化为相对信号强度。使用标准曲线计算样 品中siRNA的量。示出的值代表三次独立RT-PCR反应的平均信号及其标准偏差。图4显示了对大鼠肺中siRNA进行绝对定量的结果。在从用siRNAND-9227 (IOmg/ kg ；大鼠 65/66，50mg/kg ；大鼠 73-74)或 AD1955 (10mg/kg ；大鼠 49/50，50mg/kg ；大鼠 57-58)处理的大鼠肺或保持未处理(大鼠41/42)的大鼠肺获得的50ng总RNA(下面的图) 和siRNA ND9227(上面的图)的系列稀释液上进行两步RT-PCR。柱状图代表三次独立的 RT-PCR反应的平均siRNA浓度及它们相应的标准偏差(η = 3，士 stdev)。图5显示了使用FAM/TAMRA探针进行siRNA检测的概括。在反转录期间，通过反 转录(RT)-引物识别反义RNA，产生单链拷贝DNA(cDNA)。随后，在聚合酶链式反应(PCR) 的第一循环中，用cDNA作为正向引物的模板，产生双链DNA分子。在第二 PCR循环中，用该新合成的DNA链作为FAM/TAMRA探针和反向引物的停靠位点。不存在模板的情况下，探针是完整的，报道染料与淬灭剂染料的近似性导致报道荧光被抑制。但是，当探针与其靶序列 结合时，DNA聚合酶系统的5’ -3’核酸酶活性在报道和淬灭剂之间切割探针，导致对信号的 检测。在该过程期间，探针片段被从靶上置换下来，链的聚合继续。封闭探针的3’末端，以 阻碍PCR期间探针的延伸。该过程在每个循环中都发生，其不会干扰产物的指数积累。参考文献1. Fire, Andrew ；Xu, SiQun ；Montgomery, Mary K. ；Kostas, StevenA.； Driver, Samuel Ε. ；Mello, Craig C. Potent and specific geneticinterference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature(1998) 391 :806-811.2. Elbashir, Sayda M. ；Harborth, Jens ；Lendeckel, Winfried ；Yalcin, Abdullah ；Weber, Klaus ；Tuschl, Thomas. Duplexes of 2l~nucIeotideRNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature(2001)411 :494-498.3. Meister, Gunter ；Tuschl, Thomas. Mechanisms of gene silencingby double-stranded RNA. Nature(2004) 431 :343_349.4. Filipowicz, ffitold. RNAi :The nuts and bolts of the RISCmachine. Cell (2005) 122 17-20.5. Mukherji, Mridul ；Bell, Russell ；Supekova, Lubica ；Wang, Yan ；Orth, Anthony P. ；Batalov, Serge ；Miraglia, Loren ；Huesken, Dieter ；Lange, Joerg；Martin, Christopher ；Sahasrabudhe, Sudhir ；Reinhardt, Mischa ；Natt, Francois ；Hall, Jonathan ；Mickanin, Craig ；Labow, Mark ；Chanda, Sumit K. ；Cho, Charles Y. ；Schultz, Peter G.Genome-widefunctional analysis of human cell—cycle regulators. Proceedings of theNational Academy pf Sciences of the United States of America(2006) 103 14819-14824.上述说明书中提到的所有出版物和专利都通过引用并入本文。对描述的本发明的 方法和系统的多种改动和变化对本领域技术人员来说是明显的，这不背离本发明的范围和 宗旨。虽然参照一些特别的优选实施方式对本发明进行了描述，但是应当理解，要求保护的 发明不应被不适当地限制于此类特别的实施方式。事实上，分子生物学、遗传学或相关领域 的技术人员显而易见对描述的用于开展本发明的模式的若干改动，它们也意欲包括在所附 权利要求的范围内。
权利要求
具有改进的灵敏度、在样品中鉴定或定量寡核苷酸分子的方法，所述方法包括将反转录引物与寡核苷酸分子杂交，其中，所述反转录引物包含具有寡核苷酸识别序列的寡核苷酸分子结合部分，所述序列包含位于3’区域与所述寡核苷酸分子的区域互补的至少2个核苷酸以及位于5’区域的包含至少2个核苷酸的延伸尾；用第一延伸酶延伸杂交的反转录引物，产生反转录产物；将正向引物与所述反转录产物杂交，其中所述正向引物包含寡核苷酸分子结合部分，所述部分包含与所述寡核苷酸分子的区域相同的至少2个核苷酸；用第二延伸酶延伸杂交的正向引物，产生第一扩增子；将反向引物与所述第一扩增子杂交；用第二延伸酶延伸杂交的反向引物，产生与所述第一扩增子互补的第二扩增子；检测扩增产物；以及由此对所述寡核苷酸分子进行鉴定或定量。
2.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸分子选自小RNA分子、DNA分子、经修饰的RNA 分子、经修饰的DNA分子、适配体、核酶、诱饵寡核苷酸、免疫刺激性的寡核苷酸构成的组。
3.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸具有包含10-30核苷酸的长度。
4.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是经化学修饰的。
5.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是双链的。
6.权利要求1的方法，其中所述寡核苷酸是siRNA。
7.权利要求1的方法，其中所述反转录酶引物还包含反向引物序列。
8.权利要求1的方法，其中所述反转录酶引物还包含探针序列。
9.权利要求8的方法，其中所述探针序列定位于选自正向引物和反向引物之间或者反 转录酶引物内部的位置。
10.权利要求1的方法，其中所述第一引物和第二引物是未经修饰的引物。
11.权利要求1的方法，其中所述第一引物和第二引物是经修饰的引物。
12.权利要求11的方法，其中所述第一引物或第二引物是经修饰的，其中所述修饰包 含使用LNA残基、肽核酸残基、经2’ -修饰的RNA残基、经修饰的核碱基或其组合。
13.权利要求1的方法，其中所述杂交发生于包含所述反转录酶引物、所述反向引物和 所述正向引物的单一反应混合物中。
14.权利要求1的方法，其中所述杂交发生在两种分别的反应混合物中，其中，所述反 转录酶引物存在于第一反应混合物中，其被用于产生反转录产物；而所述正向和所述反向 引物存在于第二反应混合物中，其中，来自所述第一反应混合物的所述反转录产物在所述 第二反应混合物中被用作为所述正向和反向引物的模板。
15.权利要求1的方法，其中所述反转录酶引物的所述寡核苷酸分子结合部分包含与 所述寡核苷酸分子至少90%互补的核苷酸序列。
16.权利要求15的方法，其中所述反转录酶引物的所述寡核苷酸分子结合部分包含与 所述寡核苷酸分子互补的大约2-17个核苷酸，其中所述寡核苷酸分子长大约4-19个核苷 酸。
17.权利要求1的方法，其中所述反向引物的所述寡核苷酸分子结合部分包含与所述 寡核苷酸分子的所述区域互补的大约2-30个核苷酸。
18.权利要求1的方法，其中所述正向引物的所述寡核苷酸分子结合部分包含与所述 寡核苷酸分子的所述区域具有相同序列的大约2-30个核苷酸。
19.权利要求1的方法，其中检测所述扩增产物的步骤包括用第一检测探针检测所述第一扩增子，用第二检测探针检测所述第二扩增子以及用多种检测探针检测所述第一和第 二扩增子两者。
20.权利要求19的方法，其中所述第一检测探针是双链DNA嵌入剂。
21.权利要求19的方法，其中所述第一检测探针是SYBRGreen.
22.权利要求19的方法，其中所述第一和第二检测探针是信号发射探针，其使用 Watson-Crick碱基配对与所述寡核苷酸分子结合部分结合。
23.权利要求22的方法，其中所述信号发射探针选自FAM、VIC、JOE、NED、CY5染料、 CY3-染料、经TAMRA标记的探针和MBG探针、蝎探针和分子信标构成的组。
24.权利要求23的方法，其中所述检测探针包含FAM/TAMRA检测基团。
25.权利要求1的方法，其中使用信号强度读出法进行检测时，对所述寡核苷酸分子进 行定量的所述灵敏度以至少10-100，000倍的因子提高。
26.权利要求1的方法，其中使用信号强度读出法进行检测时，对所述寡核苷酸进行定 量的所述灵敏度以至少100-10，000倍的因子提高。
27.权利要求1的方法，其中对所述寡核苷酸进行定量的所述灵敏度被提高到能检测 浓度范围为大约1个分子至大约1X10"1个分子的寡核苷酸分子。
28.权利要求1的方法，其中对所述寡核苷酸进行定量的所述灵敏度被提高到能检测 浓度范围为大约100个分子至大约1X109个分子的寡核苷酸分子。
29.权利要求1的方法，其中在将所述寡核苷酸分子施用给受试者之后检测所述寡核 苷酸分子，所述施用通过临床相关途径进行，其选自但不限于气管内、鼻内、脑内、鞘内、结 直肠、口服、肌内、关节内、局部包括阴道、肺递送、眼内、腹膜内、静脉内和皮下施用构成的 组。
30.权利要求1的方法，其中用能协助递送至所述靶细胞和/或协助被所述靶细胞吸收 的药物载体来配制所述寡核苷酸分子。这选自但不限于中性脂质体、阳离子脂质体或脂复 合体、阳离子聚合物或多聚复合体、中性聚合物、纳米颗粒、双链RNA结合蛋白、磷酸钙、细 胞穿透肽、病毒蛋白和病毒颗粒、抗体和空细菌包膜。
31.权利要求1的方法，其中所述样品选自流体、组织、细胞和肿瘤构成的组。
全文摘要
本发明提供了用于对核酸寡核苷酸进行检测和/或定量的方法和组合物。这些方法和组合物可用于在生物样品中对诊断和/或治疗性用的合成靶寡核苷酸，例如适配体、RNAi、siRNA、反义寡核苷酸或核酶，加以检测和定量。
文档编号C12Q1/68GK101835903SQ200880112769
公开日2010年9月15日 申请日期2008年8月21日 优先权日2007年8月23日
发明者A·吉尔, F·J-C·纳特, I·伯文克 申请人:诺瓦提斯公司