专利名称：酵母细胞壁β-1,3-葡聚糖的制备方法
技术领域：
本发明涉及从废弃啤酒酵母菌中提取酵母细胞壁{3-1，3-葡聚糖的方法。
背景技术：
糖类是生物体的主要成分之一，而多糖是除蛋白质、核酸外的又 一高分子化合物，在生物活性物质研究蓬勃发展的今天，多糖由于其 独特的生物功能，己成为备受重视的功能因子之一。
真菌葡聚糖重要的来源是啤酒酵母(&cc/2ara^y cescerv/Mae )， ^cweWs/^是人类使用的最古老的微生物之一，它安全无毒，在食 品和医药工业有着广泛的应用。酵母细胞能利用廉价的培养基，繁殖 快，生物量收率高，适合大规模工业化生产。酵母细胞被细胞壁包围， 一般地，酵母细胞壁占细胞干重的20 25 %，它呈三明治状——外 层为甘露聚糖(mannan)，内层为葡聚糖(glucan)，都是分枝状聚合 物，中间夹着一层蛋白质(包括多种酶，如葡聚糖酶、甘露聚糖酶等)。
酵母的细胞壁主要由以下成分组成①具有P (1—6)键合的葡 聚糖侧链的原纤维的碱不溶性p (1—3)键合的葡聚糖；②具有卩
(1—6)键合的葡聚糖侧链的碱溶性P (1—3)键合的葡聚糖；③具 有间歇性的P (1—3)键的不定型的酸溶性的P (1—6)葡聚糖；
连接到蛋白质的不定型的碱溶性的甘露聚糖。细胞壁中(3-l，3-葡聚糖 占多糖的50%—60%，表明酵母细胞壁是|3-1,3-葡聚糖较好的提取原 料。
目前对啤酒废酵母的综合利用，多集中在对其蛋白质、核酸、维 生素、微量元素和酶方面，研究最多的是从酵母中回收蛋白质和可溶 性营养物制作营养添加剂和调味品。
卩-1， 3-葡聚糖(卩-l,3-D-glucan)是以葡萄糖为基本单位，通过 (1-3)-卩-D—糖苷键连接而成的一类高分子化合物。它广泛存在于 细菌、酵母、蘑燕、谷类和海藻中，系(3-l，3-D-吡喃型葡聚糖聚合物， 呈梳子状结构，(1—3) -p-主链和(1—6)-卩-分支是其免疫活性所必 需的。
目前P-l，3-葡聚糖的制备方法有以下三种
1、 国外报道
Masler等(1986)报道了酸碱处理制备酵母卩-l，3-葡聚糖的方法 将lkg压搾酵母分散到1.5L 、 6%(w/v)NaOH溶液，60"C搅拌4h。 然后加入1L水，1200g离心20min ，收集沉淀。沉淀再分散到1. 5L、 3Q/o(w/v)NaOH溶液，90。C保温2h ， 1200g离心20 min，收集沉淀。 沉淀用200mL水洗3遍。室温下，用200mL、 4%(w/v)HCl浸提2遍， 每遍2h， 1200g离心20min，收集沉淀，干燥后得到P-l，3-葡聚糖产品。 Williams等作了一些修改S.ce^v/w^分散到3 °/。 (w/v) NaOH溶液， 75X:搅拌2h ，自然冷却，继续搅拌5h,离心，弃上清，沉淀再分散 到3。/。(w/v)NaOH溶液75。C下搅拌lh ，自然冷却至室温，继续搅拌 3h，加水过夜。离心，弃上清，沉淀再分散到3。/。(w/v)NaOH ， 75 。C搅拌lh ，用HC1调至pH4.5，离心，弃上清，沉淀依次用水、无 水乙醇和无水乙醚洗涤数次，37。C下干燥。传统的p-l，3-葡聚糖制备 方法是基于酸碱反复萃取，这种方法明显不足在于酸、碱试剂用量大、 产物杂质含量高、耗时和环境污染大。从真菌细胞提取的|3-1,3-葡聚 糖仍含有5 10%的杂质，主要是蛋白质和甘露聚糖等多糖。
2、 国内研究
将新鲜酵母300g(相当于重100g)悬浮于l L， 1 mol/LNaOH溶液 中，IOO 。C下剧烈搅拌l h冷却至40 50。C， 3000 rpm离心15 min，弃 上清液，不溶物用1L、 0.75mol/LNaOH溶液重新悬浮，加热至10(TC 维持15min， 3000 rpm离心去上清，沉淀用1L、 0. 75 mo1/L NaOH溶 液重新悬浮，加热至10(TC维持15min，冷却后用HCl调节至pH 4. 5， 然后用200mL蒸馏水洗涤2遍，200mL无水乙醇脱水2次，再用200mL 无水乙醚脱水，37 。C下风干12 h，获得碱不溶性(3-l，3-葡聚糖。使用 无水乙醚一方面可以脱水，另一方面还能脱脂，用皂化法检测不出脂 肪。用酸一碱法制备P-l，3-葡聚糖，0. 75mol/LNaOH在100 。C下作用 2h。能有效地去除甘露糖蛋白，0.75mol/L硫酸提高了P-l，3-葡聚糖 的比粘度，制备的P-l，3-葡聚糖不溶于水、乙醇、丙酮等有机溶剂，但 能在二甲基亚砜中形成稳定的悬浊液，亦可溶于发烟盐酸。从啤酒废 酵母泥中提取的酵母多糖溶液为粘稠的胶体，表现为非牛顿假塑性, 其溶液的粘度随温度升高、受热时间延长而下降。
3、自溶法生产葡聚糖
将新鲜酵母300g (相当于干重100g)悬浮于lLlmol/L的NaOH溶 液中，100。C下剧烈搅拌lh，自溶的酵母细胞冷却至40 5(TC， 3 000rpm/min离心15min，去上清液。自溶的酵母细胞用1L 0. 75mol/L 的NaOH溶液重新悬浮，直接加热至100。C维持15min， 3000 rpm/min 离心去上清液，溶解的酵母细胞再用1L 0. 75 mol/L的NaOH溶液重复 提取一次，降至70'C保温16h，冷却后用HCl调pH至4. 5， 3 000 rpm/min 离心去上清液，用200mL蒸馏水悬浮煮沸10min，重复两次，离心去 上清液，200mL无水乙醇分两次脱水，再用200mL无水乙醚脱水，37 'C下风干12h，得碱不溶性葡聚糖，称为酵母葡聚糖。
酵母泥预处理—水洗，离心—自溶—离心，沉淀溶于水中—超声 波粉碎—木瓜蛋白酶，pH7.0， 55°C，酶解—离心—沉淀—碱溶—离 心—沉淀水洗—无水乙醇洗涤—抽提—烘干
以上方法存在下列不足之处1、原料问题文献报道中有的实 验采用新鲜酵母为原料，这样的原料来源不便，成本较高。2、工艺 问题文献报道大部分为实验室小量试验，很少有工业化规模的研究 的报道， 一些工艺不便于工业化规模使用。3、后处理问题大量的 酵母经过处理后形成了可溶性物质和葡聚糖混合的状态，如果通过离 心的方式进行分离，则要大型的离心设备，并且消耗大量的电能。4、 干燥问题已有方法在后处理过程中多采用有机溶剂进行脱水，工业 化生产有易燃易爆的危险。 发明的内容
本发明的目的是提供一种酵母细胞壁(3-1， 3-葡聚糖制备方法， 该方法的工艺简单，有效地降低成本，并且可工业化生产。
本发明的技术方案是 一种酵母细胞壁P-1， 3-葡聚糖的制备方 法，其特征在于依照如下步骤完成1)杂质处理将酵母干粉分 散于水中，酵母干粉与水的质量比为1: 1.5——1: 20搅拌使其充分 混合，通过60—100目筛过滤除去其中的杂质；如果原料为酵母悬液， 则直接通过60—100目筛过滤除去其中的杂质；2)碱处理向过滤
后的酵母悬液中加入碱，使悬液中碱的浓度达到0.5—7%,升温到96
—121°C，搅拌转速10 — 500转/min，反应l一7小时，静置过夜，弃 去上清液，再加入水和碱，使碱最终浓度仍为0.5—7°/。，加热到96 —121°C，反应时间为1—7小时；3)清洗静置使葡聚糖沉降，弃 去上清液，再将沉淀物加水混匀，静置0.2—48小时，利用虹吸的方 法吸去上清液，如后反复清洗，每次静置0.2—48小时，直到上清液 澄清透明无杂质，且pH值到7—8为止；4)喷雾干燥将清洗后的 酵母葡聚糖经均质后，浓縮到喷雾干燥设备要求的浓度范围，通过喷 雾干燥设备进行喷雾干燥，最终得到卩-1， 3-葡聚糖固体粉末。 本发明还可以采用如下技术措施
上述碱采用NaOH或KOH。
上述杂质处理步骤中采用80目筛子进行过滤。 上述碱处理步骤中碱的浓度为4%，温度为IO(TC，搅拌转速350 转/min,反应时间为3小时；第二次处理碱浓度为4%，温度为IO(TC， 时间为l-7小时；静置时间为3-12小时，pH为7-8。
上述杂质处理和碱处理步骤之间可以增加酶处理工艺，酶的加入 量为3-30AU/千克蛋白，处理时间在O.l小时-10小时之间，处理温度 在50-60。C之间，pH值为7-10。
上述酶采用碱性蛋白酶。
本发明的优点是1、本发明采用的是啤酒工业和酒精工业废弃 的酵母菌，这样的原料量大、成本低廉且较易获得，并且有废弃物利 用的社会效益。2、本发明所述方法较其它方法省去了很多步骤，有
助于降低工业化生产的成本。3、本发明所述的操作过程简单，易于 实现工业化生产，使用的设备较简单。4、原料中蛋白去除率高，产 物P-l, 3-葡聚糖的得率和纯度较高。5、本发明根据葡聚糖在水中和 碱液中都不溶的特点，采用自然沉降的方式进行分离，并且用虹吸的 方式分离上清液，这样有利于节省设备投资，降低生产成本。6、酶 处理条件温和，对葡聚糖的生物活性没有任何破坏。由于酶对蛋白的 降解，对于后处理具有明显的优势。
图l是本发明的工艺流程图。
具体实施例方式实施例1
取500g啤酒干酵母加入4.5升水，混合均匀后，通过80目筛去 除麦皮等杂质，然后加入NaOH，使NaOH终浓度为4%，加热到 IO(TC， 350转/min搅拌反应3h，静置过夜，次日弃去上清液，倒入 与弃去上清液等量的清水，加入NaOH并且使其终浓度为4。/。，加热 到10(TC， 350转/min搅拌反应3h，静置弃去上清液，倒入清水，反 复洗涤得到的沉降物，经喷雾干燥得到葡聚糖。
实施例2:
取500g啤酒干酵母加入4.5升水，混合均匀后，通过60目筛去 除麦皮等杂质，然后加入NaOH，使NaOH终浓度为4.5%，加热到 ll(TC， 300转/min搅拌反应3.5h，静置过夜，次日弃去上清液，倒 入与弃去上清液等量的清水，加入NaOH并且使其终浓度为5。/。，加 热到110'C， 350转/min搅拌反应3h，静置弃去上清液，倒入清水， 反复洗涤得到的沉降物，经喷雾干燥得到葡聚糖。
实施例3:
取lKg啤酒千酵母加入4.5升水，混合均匀后，通过80目筛去 除麦皮等杂质，然后加入NaOH调节pH值到8，加入碱性蛋白酶， 于55'C反应2小时；加入5L清水，然后加入NaOH使悬液浓度为 1%，加热到10(TC， 300转/min搅拌反应3h ，静置弃去上清液，倒 入清水，反复洗涤得到的沉降物，经喷雾干燥得到葡聚糖。
权利要求
1. 一种酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，其特征在于依照如下步骤完成1)杂质处理将酵母干粉分散于水中，酵母干粉与水的质量比为1∶1.5——1∶20搅拌使其充分混合，通过60-100目筛过滤除去其中的杂质；如果原料为酵母悬液，则直接通过60-100目筛过滤除去其中的杂质；2)碱处理向过滤后的酵母悬液中加入碱，使悬液中碱的浓度达到0.5-7％，升温到96-121℃，搅拌转速10-500转/min，反应1-7小时，静置过夜，弃去上清液，再加入水和碱，使碱最终浓度仍为0.5-7％，加热到96-121℃，反应时间为1-7小时；3)清洗静置使葡聚糖沉降，弃去上清液，再将沉淀物加水混匀，静置0.2-48小时，利用虹吸的方法吸去上清液，如后反复清洗，每次静置0.2-48小时，直到上清液澄清透明无杂质，且pH值到7-8为止；4)喷雾干燥将清洗后的酵母葡聚糖经均质后，浓缩到喷雾干燥设备要求的浓度范围，通过喷雾干燥设备进行喷雾干燥，最终得到β-1，3-葡聚糖固体粉末。
2、 根据权利要求1所述的酵母细胞壁卩-1 ， 3-葡聚糖的制备方法， 其特征在于上述碱采用NaOH或KOH。
3、 根据权利要求1所述的酵母细胞壁(3-1， 3-葡聚糖的制备方法， 其特征在于上述杂质处理步骤中釆用80目筛子进行过滤。
4、 根据权利要求1所述的酵母细胞壁p-l，3-葡聚糖的制备方法， 其特征在于上述碱处理步骤中碱的浓度为4%，温度为IO(TC，搅 拌转速350转/min，反应时间为3小时；第二次处理碱浓度为4%， 温度为10℃，时间为1-7小时；静置时间为3-12小时，pH为7-8。
5、根据权利要求1所述的酵母细胞壁(3-1， 3-葡聚糖的制备方法， 其特征在于上述杂质处理和碱处理步骤之间可以增加酶处理工艺， 酶的加入量为3-30AU/千克蛋白，处理时间在0.1小时-10小时之间， 处理温度在50-6(TC之间，pH值为7-10。
6、根据权利要求5所述的酵母细胞壁(3-1 ，3-葡聚糖的制备方法， 其特征在于上述酶采用碱性蛋白酶。
全文摘要
一种酵母细胞壁β-1，3-葡聚糖的制备方法，依照如下步骤完成1)杂质处理将酵母干粉分散于水中，过滤除去其中的杂质；2)碱处理向过滤后的酵母悬液中加入碱，使悬液中碱最终浓度仍为0.5-7％；3)清洗利用虹吸的方法吸去上清液，直到上清液澄清透明无杂质，且pH值到7-8为止；4)喷雾干燥最终得到β-1，3-葡聚糖固体粉末。本发明的优点是1.降低工业化生产的成本。2.操作过程、使用的设备简单，易于实现工业化生产。3.原料中蛋白去除率高，产物β-1，3-葡聚糖的得率和纯度较高。
文档编号C12P19/00GK101205552SQ200610130420
公开日2008年6月25日 申请日期2006年12月20日 优先权日2006年12月20日
发明者储兆坤, 姜文侠, 张英筠, 王海燕, 呐 魏 申请人:天津市工业微生物研究所