直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及生物技术领域，尤其设及一种直接重编程小鼠肝细胞为膜岛P细胞 的方法及应用。
【背景技术】
[0002] 目前，糖尿病仍是困扰世界各国的严重社会卫生难题，糖尿病患病率呈急剧上升 趋势。1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，是由于T细胞参与的膜岛P细胞选择性破坏所 致，膜岛细胞移植技术存在供体缺乏及免疫抑制，应用受到限制。因此，越来越多研究关注 寻求膜岛素分泌细胞的来源问题。
[0003] 细胞直接重编程技术，是2006年化k址ashi和Yamanaka等发现的诱导性多能干 细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs)之后的一项新技术。该技术不同于诱导 性多能干细胞，它是指将一种终末分化的细胞直接转变为另外一种成体细胞。细胞直接重 编程技术，突破了伦理、免疫排斥、来源不足等问题，具有相对安全、重编程时间较短及祀向 性好的优点。运一技术的开展，为自体细胞替代治疗提供了的新方向。但直接重编程技术 目前主要处于研究阶段，应用到临床疾病治疗仍有一定的距离，其中在重编程效率和成熟 度及安全性方面还有待于进一步的完善和提高，但相信通过不断的努力，运一技术将会为 临床疾病的治疗带来新的途径。
[0004] 关于糖尿病的治疗，最早源于埃德蒙顿巧dmonton)方案的提出，膜岛移植技术的 开展为糖尿病的替代治疗开创了先河，然而，运一技术的免疫排斥及膜岛供体的不足，使得 运一技术应用上受到限制，运就需要寻求新的膜岛素分泌细胞来源。近年来研究发现，干细 胞的诱导分化，成为膜岛素分泌细胞来源的一个新的突破点。从胚胎干细胞的诱导分化、 间充质干细胞的诱导分化到目前研究热点诱导性多能干细胞（in化ced pluripotent stem cells, iPSCs)的形成，重编程技术的发展，为运一领域的研究带来新的希望。然而，运些 转变的过程中存在着伦理、免疫排斥及肿瘤风险等，需要研究新的祀目标来实现用膜岛素 分泌细胞进行糖尿病的替代治疗。细胞直接重编程技术的核屯、就是关键转录因子的筛选。 化rber等通过Pdxl基因腺病毒载体介导的经尾静脉注入糖尿病模型小鼠，研究发现，Pdxl 蛋白在小鼠的肝、肾、屯、、上皮组织均有表达，表达水平最高的为肝细胞，转染后1周小鼠血 糖变化由33.3mmol/L降到11. Immol/l，其中，肝脏中膜岛素分泌量是对照组的25倍。Yang 等利用单纯瘤疹病毒VP16蛋白激活域与Pdxl融合，由慢病毒载体介导，体外转染肝细胞 后，肝卵园细胞株（WB cell line)选择性转化为有膜岛素分泌能力的P细胞，随后又采用 慢病毒载体将Pdxl和Pdxl-PV16分别转染体外培养的肝卵园细胞株，结果显示在高葡萄 糖培养基的环境中，Pdxl-PV16的作用下膜岛素分泌能力更为明显。研究发现，Pdxl作用 后期膜岛素表达能力丧失的细胞，通过转染化urodl运些细胞又重新恢复了膜岛素表达能 力，表明化urodl和Pdxl具有协同表达膜岛素分泌细胞的特性。可见，Pdxl可W有效驱动膜 芽的形成，但是仅有Pdxl并不能定向驱动细胞进一步发育而成，需要Ngn3、化urodUMa化、 化x4等的相互作用。2008年，zhou等筛选出的最佳转录因子组合Pdxl、N即3、Ma化(PNM) 成功将小鼠膜腺外分泌细胞直接重编程为膜岛素分泌细胞，达到20%的重编程效率，不足 之处在于缺乏完整的膜岛样结构，膜岛素的分泌量远不及正常的膜岛P细胞。为了深入 研究运一过程的基因层面的变化，2012年，Akinci通过转染该组合到大鼠AR42j-B13细 胞系后发现，有大量膜岛P细胞特性基因表达，并从组蛋白和甲基化层面对Pdxl进行分 析，染色体被P醒组合所修饰，促进运些特异性基因的表达。同年，他们又将P醒组合构建 成串联载体，尾静脉输注的方式将小鼠体内重编程，发现了串联载体在肝脏内具有明显的 聚集性，实现了对肝脏细胞的直接重编程，并且发现了导管样结构，证实是来源于SOX9+细 胞。鉴于胆囊和膜腺的同源性，化ck巧等发现，通过转染转录因子Pdxl、Ma化、NeurogS实 现了小鼠胆囊细胞向膜岛素分泌细胞的转变。研究发现，人类膜岛组蛋白的甲基化是由于 册K4me3和册K27me3的作用所致，使得a、P细胞的转变。为了更加深入的研究与人类相 关的直接重编程技术，化nnarossa等选取猪为重编程的对象，此次重编程与之前的不同点 在于使用DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-胞喀晚巧-aza-CR)诱导所形成，重编程效率达 (38. 1 + 9. 2) %。Berneman-Zeitouni等通过转录因子Pdxl、F*ax4和Mafa的顺序进行不同 方式的转染，发现=个转录因子间隔24h转染，重编程肝细胞为膜岛素分泌细胞，转分化效 率达到15%，不但效率较高，同时具有较高的成熟度，为细胞重编程技术的发展带来了新的 突破。直接重编程技术既避免了膜岛移植供体不足和免疫排斥等限制，也可避免干细胞分 化的膜岛素细胞转分化效率低W及安全性问题。
[0005] 近年来，细胞直接重编程技术应用于寻找膜岛P细胞的来源成为一个新的热点， 但运一技术仍然存在重编程效率低、成熟度差的问题，在转染方法上也存在安全性及效率 低的问题。如何突破运些障碍成为直接重编程技术的突破口。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种使离体成体细胞重编程为膜岛P细胞的方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：将Pdxl蛋白编码基因、化x4蛋白编码基因和 Neurodl蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到膜岛P细胞；
[000引所述Pdxl蛋白的氨基酸序列为序列6 ;
[0009] 所述化x4蛋白的氨基酸序列为序列7;
[0010] 所述化urodl蛋白的氨基酸序列为序列7为序列8。
[0011] 上述方法中，
[0012] 所述Pdxl蛋白编码基因、所述化x4蛋白编码基因和所述化urodl蛋白编码基因 的转染间隔时间均为24h。
[0013] 上述方法中，
[0014] 所述Pdxl蛋白编码基因、所述化x4蛋白编码基因和所述化urodl蛋白编码基因 的转染顺序依次为所述Pdxl蛋白编码基因、所述化x4蛋白编码基因和所述化urodl蛋白 编码基因。
[0015] 上述方法中，
[0016] 所述Pdxl蛋白编码基因通过表达Pdxl蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝 脏细胞；
[0017] 所述表达Pdxl蛋白编码基因的重组载体为将所述Pdxl蛋白编码基因插入表达载 体，得到的重组载体；
[0018] 所述化x4蛋白编码基因通过表达化x4蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝 脏细胞；
[0019] 所述表达化x4蛋白编码基因的重组载体为将所述化x4蛋白编码基因插入表达载 体，得到的重组载体；
[0020] 所述化urodl蛋白编码基因通过表达化urodl蛋白编码基因的重组载体转染所述 离体肝脏细胞；
[0021] 所述表达化urodl蛋白编码基因的重组载体为将所述化urodl蛋白编码基因插入 表达载体，得到的重组载体。
[0022] 上述方法中，
[002引所述将Pdxl蛋白编码基因、化x4蛋白编码基因和化urodl蛋白编码基因转染离 体肝脏细胞为先将所述表达Pdxl蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细胞，得到 首次转染细胞，24小时后再将所述表达化x4蛋白编码基因的重组载体转染所述首次转染 细胞，得到二次转染细胞；24h后再将所述表达化urodl蛋白编码基因的重组载体转入所述 二次转染细胞。
[0024] 上述方法中，所述成体细胞为在体内数量多，直接重编程一部分细胞后且不影响 宿主机体功能的成体细胞，如脂肪细胞、肌肉细胞或肝脏细胞等。本方法采用的为离体肝脏 细胞；
[00巧]所述表达载体为PCDNA3. 1-EGFP ;
[0026] 所述离体肝脏细胞为离体小鼠肝脏细胞，具体为NCTC-1469。
[0027] 由上述方法制备的膜岛P细胞也是本发明保护的范围。
[0028] 由上述膜岛P细胞分泌的膜岛素或C肤也是本发明保护的范围。
[0029] 上述方法或上述的膜岛P细胞或上述的膜岛素在制备治疗糖尿病产品中的应用 也是本发明保护的范围。
[0030] 上述方法或上述的膜岛P细胞或上述的膜岛素在制备降低血糖产品中的应用也 是本发明保护的范围。
[0031] 本发明还有一个目的是提供一种治疗糖尿病产品或降低血糖产品。
[0032] 本发明提供的产品，包括上述的膜岛P细胞或上述的膜岛素。
[0033] 所述产品为试剂盒或药物。
[0034] 或本发明提供一种使离体成体细胞重编程为膜岛P细胞的产品，为如下1)或 2);
[0035] 1)包括Pdxl蛋白、化x4蛋白和Neurodl蛋白；
[0036] 2)包括含有Pdxl蛋白编码基因的表达盒、重组载体或病毒、含有化x4编码基因的 表达盒、重组载体或病毒和含有化urodl编码基因的表达盒、重组载体或病毒；
[0037] 所述离体肝脏细胞为离体小鼠肝脏细胞，具体为NCTC-1469。
[0038] 所述产品为试剂盒。
[0039] 本发明的实验证明，本发明的优势在于，第一，采用非病毒化transterTM-D转染 试剂，不但具有较高的转染效率，同时大大提高了直接重编程过程中转染的安全性。第二， 根据文献的报道，筛选出适用于直接重编程为膜岛P细胞新的最佳转染组合Pdxl、Pax4、 Neurodl。第=，根据各个转录因子发挥作用的先后顺序，筛选出最佳转染时段2地，从而提 高了直接重编程为膜岛细胞的成熟度问题，本研究中重编程效率达23%，高糖刺激下膜岛 素和C肤的释放量是NIT-1细胞系的1/7,并通过动态观察不同天数下基因的表达情况， 重编程后第9天的膜岛P细胞基因表达量较高。通过构建糖尿病模型小鼠，将直接重编 程的膜岛P细胞移植到小鼠左侧肾包膜下，观察重编程后细胞的降糖效果。发现，直接 重编程细胞移植2组（4X10 6cells)小鼠的膜岛素释放量高于直接重编程细胞移植1组 (2X106cells)，说明通过增加重编程细胞的细胞数量可W提高降血糖的作用。
【附图说明】
[0040] 图1为PCDNA3. 1-EGFP质粒载体图谱。
[0041] 图2为流式细胞术和巧光显微镜鉴定化transterTM-D转染效率。
[0042]图3为转染后质粒在细胞系内的基因表达。
[0043] 图4为转染后质粒在细胞系内的蛋白表达。
[0044] 图5为串联载体转染细胞系后细胞形态变化。
[0045] 图6为RT-PCR筛选的最佳组合。
[0046] 图7为不同转录因子组合重编程后膜岛P细胞的mRNA的表达（冲<0. 05)。
[0047] 图8为流式细胞术检测各组膜岛素的表达量。
[004引图9为不同时间段蛋白表达。
[0049] 图10为不同时段重编程P细胞膜岛素分泌量（冲<0. 05)。
[0050] 图11为流式细胞术检测各组膜岛素的表达量。
[0051] 图12为直接重编程P细胞后基因表达情况（冲<0. 05)。
[0052] 图13为第9天重编程细胞的蛋白水平鉴定。
[0053] 图14为流式细胞术检测第9天各组直接重编程P细胞膜岛素的表达量。
[0054] 图15为ELISA检测细胞培养上清膜岛素和C肤的含量。
[00巧]图16为直接重编程P细胞进行小鼠肾包膜移植。
[0056] 图17为移植后受体小鼠血糖变化。