化n Wang, Hong-Jie Yan，Shu-Yan Zhou,Yun-Shuang Wang, Hui Qi,Chun-Yan Deng,Fu-Rong Li. The immunoregulation effect of Alpha 1-antitrypsin prolongP-cell survival after transplantation. 化oS化e. 2014 ;9 (4) : e94548.)，膜岛素表达量达97 %，图8C为筛选的最佳组合 4Pdxl+Pax4+Neurodl转染得到膜岛P细胞，其膜岛素表达量达到16%，可见，本研究的重 编程效果比较明显，但与膜岛P细胞系相比，膜岛素的表达量相对较低，重编程效率还有 待于提局。
[0173] 2、最佳转染时段的筛选
[0174] 用空载体PCDNA3. 1-EGFP质粒转染NCTC-1469小鼠肝细胞系，转染后分别在12h， 24h和3化用免疫巧光技术观察巧光的表达量。
[01巧]结果如图9所示，在转染后12h，24h和3化S个时间点观察中发现，转染24h后绿 色蛋白的表达量最高，而在转染后1化时可能是转染的时间不足，而转染3化后观察数量减 少，可能是转染后出现泽灭作用，因此，本研究通过空载体观察，转染后24h绿色巧光蛋白 表达量最高。
[0176] 3、ELISA检测重编程P细胞膜岛素表达筛选最佳转染时段
[0177] 1化组样本：将PCDNA3. 1 (+) -Pdxl (N-Pdxl)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞； 1化后再将PCDNA3. l(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；1化后 再将PCDNA3. 1 (+)-Neurodl (N-Neurodl)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程 膜岛P细胞；
[0178] 2地组样本：将PCDNA3. 1 (+) -Pdxl (N-Pdxl)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞； 24h后再将PCDNA3. l(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；24h后 再将PCDNA3. 1 (+)-Neurodl (N-Neurodl)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程 膜岛P细胞；
[0179] 3化组样本：将PCDNA3. 1 (+) -Pdxl (N-Pdxl)转染NIT-1细胞，得到首次转染细胞； 3化后再将PCDNA3. l(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；3化后 再将PCDNA3. 1 (+)-Neurodl (N-Neurodl)转染到二次转染细胞，7天后收集细胞，为重编程 膜岛P细胞；
[0180] 上述S个样本分别用KRBB缓冲液洗涂2次后，每个样本设置S个组：分别加入 1ml的KRBB缓冲液、Im化RBB低糖缓冲液巧.5mM)、1ml KRBB高糖缓冲液（17. 5mM)，刺激化 后分别收集上清液，作为Elisa检测的样本。
[0181] 按照Mouse叫trasensitive Insulin ELISA试剂盒的要求进行操作，方法如下：
[0182] (1)从4°C冰箱中取出试剂盒，静置在常溫下数分钟。
[018引 似按照试剂盒的指示，配制各种试剂，依次有洗涂液、酶结合液和标准品等。
[0184] 做选取25ul的体系为准，标准品的浓度依次为0. 025ng/血，0. 09ng/ mL, 0. 188ng/mL, 0. 5ng/mL, 1. 25ng/mL。
[0185] (4)取S个样本每个组的上清液作为检测样本，用微量加样器分别按照每孔25ul 加入孔板中，每个检测样本设置2个复孔，W标准品为对照；
[0186] (5)依次向标准品和检测样本中加入75ul的酶结合液，注意避光操作。
[0187](6)将样板放置在摇床上（转速为700-80化pm)，在常溫下摇动2小时。
[0188] (7)摇动2小时结束后，用洗涂液洗涂6次，每孔加入400ul。
[0189](8)6次洗涂结束后，各个样本中依次加入lOOul的TMB (显色底物），每孔依次加 入lOOul。
[0190] (9)将各个样本放置在摇床上，转速为700-90化pm，在室溫解育30分钟。
[0191] (10)解育结束后，向各个样本中依次加入终止液，每孔加入lOOul，将各个样本轻 轻混匀后，立刻放置在0D450nm的酶标仪上测量（30分钟内）
[0192] (11)标准曲线的绘制：根据各个标准品的0D值，W及试剂盒给的浓度，绘制标准 曲线。
[0193] (12)各个样本浓度的测定：根据标准品绘制的标准曲线，W及酶标仪测得的各个 样本的0D值，求得相应样本的浓度即为膜岛素的释放量。
[0194] W NIT-1细胞系（膜岛P瘤细胞系）对照。
[0195]结果如图10和表7，可W看出，在间隔24h转染时，高糖和低糖刺激下，重编程的膜 岛0细胞的膜岛素释放量是最高，释放量达到0. 3化g/ug和0.03ng/ug，是N口-1细胞系释 放量的1/7左右（冲<0.05)具有统计学意义，但仍未达到正常膜岛P细胞膜岛素释放量， 说明直接重编程技术还有待于进一步提高。
[0196] 表7酶联免疫学方法检测细胞培养上清膜岛素含量（n = 3,X+S)
[0197]
[019引 4、检测最佳组合和最佳转染时段重编程P细胞的效率
[0199] 最佳组合4按照如下方式转染：将PCDNA3. 1 (+) -Pdxl (N-Pdxl)转染NIT-1细胞， 得到首次转染细胞；24h后再将PCDNA3. l(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到 二次转染细胞；24h后再将PCDNA3. 1 (+) -Neurodl (N-Neurodl)转染到二次转染细胞，7天后 收集细胞，为重编程膜岛P细胞；
[0200] W小鼠肝细胞系NCTC-1469和小鼠膜岛P瘤细胞系N口-1为对照。收集转染7 天后的细胞（即为重编程细胞），按照上述1的方法检测重编程效率，结果如图11，图A小 鼠肝细胞系NCTC-1469、图B小鼠膜岛P瘤细胞系NIT-1、图C重编程膜岛P细胞；流式细 胞术检测重编程效率公式为：重编程后的膜岛P细胞数量/转染的肝细胞系数量X 100% =重编程效率％，重编程效率达21 %，与前面筛选的最佳组合重编程效率相比，效率有所提 高，说明不同时间段转染有助于提高重编程效率，但与小鼠膜岛P细胞系相比仍有一定的 距离。
[0201] 因此，重编程膜岛P细胞的最佳组合为组合4,最佳转染间隔为2地。
[0202] =、检测最佳组合和最佳转染时段获得重编程P细胞
[0203] 1、直接重编程膜岛P细胞mRNA表达水平的检测
[0204] 最佳组合4按照如下方式转染：将PCDNA3. 1 (+) -Pdxl (N-Pdxl)转染NIT-1细胞， 得到首次转染细胞；24h后再将PCDNA3. l(+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到 二次转染细胞；24h后再将PCDNA3. 1 (+) -Neurodl (N-Neurodl)转染到二次转染细胞，7天后 收集细胞，为重编程膜岛P细胞；
[0205] 在转染后第3、6、9、12天收集转染后细胞采用巧光定量PCR检测转染后细胞个基 因的表达量，所用引物见表2。
[0206] 结果如图12和表8所示，可W看出，在重编程后的第3、6、9天中，膜腺发育相关 基因的表达与对照组相比，表达量呈上调趋势，第3天和第6天，基因的表达逐渐上升，第9 天基因表达量最高，第12天基因表达有所下降，每个基因的表达量同第3天对比，具有统计 学意义（冲<0. 05)，Pdxl和Ma化运两个基因的表达在四个时间点的表达都是比较高的，而 Insl和Ins2两个基因是在第9天表达最高，因此，通过本实验，将选取重编程后第9天的细 胞作为为最佳动态时间点，且同时也证明了重编程细胞为膜岛P细胞。
[0207] 表8直接重编程后基因表达情况
[020引
[0210] 2、直接重编程膜岛P细胞蛋白水平的检测
[0211] 收集将上述1的方法获得的转染第9天的细胞（重编程膜岛P细胞），按照实施 例1的转染后蛋白的鉴定的方法进行蛋白水平检测。
[0212] 结果如图13,显示最佳转录因子组合和最佳转染时段筛选后，重编程膜岛P细胞 的第9天有蛋白Insulin、Pdxl、C-p巧tide、Glucagon等表达，但表达量不明显。可能是由 于细胞重编程效率不高有关，也有可能在染色过程中存在部分巧光丢失等因素。
[0213] 3、直接重编程P细胞重编程效率的检测
[0214] 收集将上述1的方法获得的转染第9天的细胞（重编程膜岛P细胞），按照上述 二的1的方法检测重编程效率。
[021引结果如图14所示，图A小鼠肝细胞系NCTC-1469、图B小鼠膜岛P瘤细胞系 NIT-1、图C最佳组合Ad-Pdxl+Pax4+Neurodl ;表明，重编程第9天后，多次重复实验，重编 程效率在21% -25%之间，均值为23%的膜岛素阳性细胞表达，与之前文献报道相似。
[0216] 4、直接重编程P细胞成熟度的检测
[0217] 收集将上述1的方法获得的转染第9天的细胞（重编程膜岛P细胞），按照上述 二的3的方法检测重编程P细胞成熟度。
[0218] C 肤检测方法：（80-CPTMS-E01，ALPC0)
[0219] 收集最佳组合Pdxl+Pax4+Neurodl和最佳转染时段24h转染第9天的重编程细 胞，用KRBB缓冲液洗涂最佳组合和N口组2次后，2个样本设置S个组，分别加入1血的 KRBB缓冲液，ImLKRBB低糖缓冲液巧.5mM)，ImLKRBB高糖缓冲液（17. 5mM)，分别刺激化后 收集上清液，作为Elisa检测的样本。按照Mouse叫trasensitive Insulin C-peptide试 剂盒的要求进行操作，方法如下：
[0220] (1)从4°C冰箱中取出试剂盒，静置在常溫下数分钟。
[0221] (2)按照试剂盒的指示，配制各种试剂，依次有洗涂液、酶结合液和标准品等。 [022引 做选取25ul的体系为准，标准品的浓度依次为0.0 Ong/血，0. 18化g/ mL, 0. 781ng/mL, 2. 342ng/mL, 4. 683ng/mL, 9. 367ng/mL。
[0223] (4)取2个样本，分别设置2个复孔，用微量加样器分别向孔板中依次加入标准品、 样本（分别在0mM、5. 5mM和17. 5mM浓度刺激下的上清液），每孔加入lOuL。
[0224] (5)依次向标准品和样本中加入lOOuL的酶结合液，注意避光操作。
[0225] (6)将样板放置在摇床上（转速为700-90化pm)，在常溫下摇动2小时。
[0226] (7)摇动2小时结束后，用洗涂液洗涂3次，每孔加入lOOuL。
[0227] (8) 3次洗涂结束后，各个样本中依次加入lOOuL的TMB (显色底物），每孔依次加 人 lOOuL。
[022引 （9)将各个样本放置在摇床上，转速为700-90化pm，在室溫解育10分钟。
[0229] (10)解育结束后，向各个样本中依次加入终止液，每孔加入lOOuL将各个样本轻 轻混匀后，立刻放置在0D450nm的酶标仪上测量（30分钟内）
[0230] (11)标准曲线的绘制：根据各个标准品的0D值，W及试剂盒给的浓度，绘制标准 曲线。
[0231] (。）各个样本浓