度的测定：根据标准品绘制的标准曲线，W及酶标仪测得的各个 样本的0D值，求得相应样本的浓度即为C肤的释放量。
[0232] 结果如图15、表9和表10所示，图15A和B显示在低糖巧.5mM)、高糖（17. 5mM) 的刺激下，最佳组合4Pdxl+Pax4+Neurodl与膜岛P细胞系（NIT)膜岛素和C肤的释放量， 分别为 0. 〇4ng/ug，0. 52ng/ug ;0. 05ng/ug，0. 53ng/ug，均有统计学意义（P<0. 05)，在高糖 刺激下，组合4Pdxl+Pax4+Neurodl组膜岛素和C肤的释放量是N口细胞系的1/7左右，小 鼠肝细胞直接重编程的膜岛P细胞具有膜岛素释放功能，但功能仍低于NIT细胞系，说明 成熟度上存在不足。
[0233] 表9酶联免疫学方法检测重编程P细胞膜岛素含量（n = 3, ； ±s )
[0234]
[0237] 实施例3、直接重编程的小鼠肝细胞为P细胞治疗糖尿病的研究
[023引本研究通过构建小鼠糖尿病模型，将前一阶段筛选出的最佳组合和最佳时间段重 编程的膜岛P细胞移植到糖尿病小鼠左侧肾包膜下，监测小鼠的血糖变化，分别进行膜岛 素、C肤释放量监测，评估对糖尿病模型小鼠的降糖作用，为临床上治疗糖尿病提供一定依 据。
[0239] 1、糖尿病模型的构建
[0240] (1)喂养1周SCID-Beige小鼠后，体重为20-25g左右。
[024。（2)将小鼠禁食不禁水1地，配制的STZ溶液的浓度为20mg/ml;即5-6ul/g小鼠 体重。
[0242] (3)小鼠注射STZ之后进行正常喂养，通过尾静脉在每天早晨进行采血监测空腹 血糖，连续3天测得的血糖浓度为> 300mgAlL，即为造模成功，获得糖尿病小鼠。
[0243] 2、细胞移植
[0244] 下述待移植细胞按照如下方法制备：
[024引将PCDNA3. 1 (+)-Pdxl (N-Pdxl)转染N口-1细胞，得到首次转染细胞；24h后再 将PCDNA3. 1 (+)-Pax4(N-Pax4)转染到首次转染细胞中，得到二次转染细胞；24h后再将 PCDNA3. l(+)-Neurodl(N-Neurodl)转染到二次转染细胞，9天后收集细胞，为重编程膜岛 0细胞，即为待移植细胞。
[0246] 实验分组：
[0247] ①正常小SCID-Beige鼠化只，阴性对照）：不移植细胞；
[024引②糖尿病小鼠化只，阳性对照）：注射0.1 mlPBS到左肾包膜下；
[0249] ③移植肝细胞系组化只，左肾包膜下移植2X106细胞）
[0250] ④移植组糖尿病小鼠巧只，实验组1):将2X 106细胞移植到糖尿病小鼠左肾包 膜下；
[0巧1] ⑥移植组糖尿病小鼠2巧只，实验组2,）：将4 X 106细胞移植到糖尿病小鼠左肾包 膜下；
[0252] 具体方法如下（图16):
[0巧引（1)观察造模成功后，准备进行细胞移植，移植前一天，对小鼠进行抗生素喂养。[0254]似收集第9天的细胞进行消化，洗涂，用PBS重悬。
[0巧引做W水合氯醒0. 004血/g的浓度对小鼠进行麻醉，剔除小鼠左侧腰部的毛发，进 行消毒处理。
[0巧6] (4)小鼠左肾附近的表皮、腹膜用无菌眼科手术剪依次剪开，开口方向与脊柱呈 60°角，切口 1cm左右。
[0巧7] (5)用手轻轻按压切口两侧肌肤W挤出左肾，使无菌注射器针头在肾包膜上划开 2-3mm小口，分别用移液枪吸取细胞悬液，注入肾包膜内。
[0巧引（6)电热灼合伤口，将左肾移至腹腔缝合，对移植细胞会的小鼠放置在37°C保暖 4-5h，确保小鼠生长状态正常后放回小鼠房，连续1周投放恩诺沙星喂养。
[0259] 3、移植后受体小鼠体重血糖的监测
[0260] 对移植细胞后的4组小鼠正常小鼠组、糖尿病小鼠组、移植组糖尿病小鼠 1 (2X 106cells)、移植组糖尿病小鼠2 (4X 106cells)进行血糖和体重水平监测：S天检测 一次，至30天。
[0261] 结果如表11和图17,移植后第3天，小鼠的血糖有所降低，但不是很明显，第6天 小鼠血糖降的比较明显，对照组移植小鼠肝细胞系，没有降糖作用，相对而言，移植重编程 膜岛P细胞数量较多的移植组2要比移植组1降糖效果明显，但仍未达到正常水平。第27 天摘除小鼠左肾，发现小鼠血糖上升到糖尿病小鼠血糖水平，重编程的细胞具有降糖效果， 但在体外的效果较好，体内的降糖作用较弱，一方面表明运一技术还有待于完善，另一方面 表明，可W通过提高移植重编程细胞数量来抵抗相对重编程不足而导致的降糖效果差的结 果，本研究证实了体内实验的降糖效果，但仍未达到正常小鼠的血糖水平，说明今后的研究 中，还要克服内环境对直接重编程技术带来的影响。
[0262] 表11不同移植组受体小鼠血糖变化
[0263]
[0265] 4、移植后受体小鼠糖耐量监测
[0266] (1)对移植膜岛P细胞的受体小鼠选取第7天和24天时间点进行糖耐量监测。
[0267] 似对4组小鼠禁食化，用灭菌注射用水配制的0. 5g/ml的葡萄糖溶液，用于小鼠 腹腔注射（2g/kg)，断尾采血监测注射0、15、30、60、90min后小鼠的血糖。
[026引选取第7天和第24天时间点对小鼠进行糖耐量监测，从图18、表12和表13 结果表明，与糖尿病组对比，移植重编程的膜岛P细胞，15分钟时会有血糖的降低，一 直处于一定的血糖调控作用，高于糖尿病组血糖调控，但低于正常小鼠的血糖调控，其 中，Transplantation Groups (4 X 106细胞）小鼠的调控作用高于 Transplantation Groupl (2X 106细胞），可见，增加重编程的膜岛P细胞能提高对糖尿病小鼠血糖的调控， 但二者没有明显的统计学差异（P〉0. 05)，说明直接重编程技术还有待于进一步的完善，提 高重编程的膜岛P细胞调控作用。
[0269] 表12移植后第7天各组小鼠葡萄糖耐量实验
[0270]
[0274] 5、移植后受体小鼠膜岛素的释放量监测
[027引 （1)选取移植膜岛P细胞后受体小鼠第6、12、18、24等天的时间点进行elisa监 测。
[027引 似从4组小鼠中随机抽取3只小鼠，取每只小鼠的眼周静脉的血，离屯、收集血清， 按照elisa试剂盒的要求操作。
[0277]做的绘制：根据各个标准品的0D值，W及试剂盒给的浓度，绘制标准曲线。
[027引（4)样本浓度的测定：根据标准品绘制的标准曲线，W及酶标仪测得的各个样本 的0D值，求得相应样本的浓度即为膜岛素的释放量。
[0279] WN 口-1细胞为对照。
[0280] 各组小鼠选取第6、12、18、24四个时间点进行检测，随机抽取S只小鼠，眼眶采血 后，收集血清，离屯、后，elisa检测结果如图19和表14显示四个时间段膜岛素都是有分泌， 其中，糖尿病小鼠和移植组的小鼠膜岛素释放量少于正常小鼠，与正常小鼠释放量具有统 计学差异（冲<0.05)。两组移植组小鼠的膜岛素释放量虽然不如正常小鼠膜岛素释放量 水平，但要高于糖尿病小鼠膜岛素释放量，膜岛素和C肤的释放量是NIT细胞系的1/7,其 中，Transplantation G;roup2(4Xl〇6细胞）小鼠的膜岛素释放量高于 Transplantation Groupl (2 X 106细胞），但二者无明显统计学差异，后者高于前者膜岛素释放量水平，说明通 过增加重编程膜岛p细胞的数量可w提高降糖的效果。
[0281] 表14移植后不同时间点小鼠的膜岛素释放水平
[0282]
【主权项】
1. 一种使离体成体细胞重编程为胰岛0细胞的方法，包括如下步骤：将Pdxl蛋白编 码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurodl蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到胰岛0细 胞； 所述Pdxl蛋白的氨基酸序列为序列6 ; 所述Pax4蛋白的氨基酸序列为序列7 ; 所述Neurodl蛋白的氨基酸序列为序列7为序列8。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于： 所述Pdxl蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurodl蛋白编码基因的转 染间隔时间均为24h。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于： 所述Pdxl蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurodl蛋白编码基因的转 染顺序依次为所述Pdxl蛋白编码基因、所述Pax4蛋白编码基因和所述Neurodl蛋白编码 基因。4. 根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于： 所述Pdxl蛋白编码基因通过表达Pdxl蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细 胞； 所述表达Pdxl蛋白编码基因的重组载体为将所述Pdxl蛋白编码基因插入表达载体， 得到的重组载体； 所述Pax4蛋白编码基因通过表达Pax4蛋白编码基因的重组载体转染所述离体肝脏细 胞； 所述表达Pax4蛋白编码基因的重组载体为将所述Pax4蛋白编码基因插入表达载体， 得到的重组载体； 所述Neurodl蛋白编码基因通过表达Neurodl蛋白编码基因的重组载体转染所述离体 肝脏细胞； 所述表达Neurodl蛋白编码基因的重组载体为将所述Neurodl蛋白编码基因插入表达 载体，得到的重组载体。5. 根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于： 所述离体成体细胞为离体肝脏细胞； 所述表达载体为PCDNA3. I-EGFP ; 所述离体肝脏细胞具体为NCTC-1469。6. 由权利要求1-5中任一所述方法制备的胰岛P细胞。7. 由权利要求6所述胰岛P细胞分泌的胰岛素或C肽。8. 权利要求1-5中任一所述方法或权利要求6所述的胰岛P细胞或权利要求7所述 的胰岛素在制备治疗糖尿病产品中的应用。9. 权利要求1-5中任一所述方法或权利要求6所述的胰岛P细胞或权利要求7所述 的胰岛素在制备降低血糖产品中的应用。10. -种治疗糖尿病产品或降低血糖产品，包括权利要求6所述的胰岛P细胞或权利 要求7所述的胰岛素； 或一种使离体成体细胞重编程为胰岛P细胞的产品，为如下1)或2); 1) 包括Pdxl蛋白、Pax4蛋白和Neurodl蛋白； 2) 包括含有Pdxl蛋白编码基因的表达盒、重组载体或病毒、含有Pax4编码基因的表达 盒、重组载体或病毒和含有Neurodl编码基因的表达盒、重组载体或病毒； 所述离体成体细胞为离体肝脏细胞。
【专利摘要】本发明公开了直接重编程小鼠肝细胞为胰岛β细胞的方法及应用。本发明提供了一种使肝细胞重编程为胰岛β细胞的方法，包括如下步骤：将Pdx1蛋白编码基因、Pax4蛋白编码基因和Neurod1蛋白编码基因转染离体肝脏细胞，得到胰岛β细胞；本发明的优势在于，第一，采用非病毒EntransterTM-D转染试剂，不但具有较高的转染效率，同时大大提高了直接重编程过程中转染的安全性。第二，根据文献的报道，筛选出适用于直接重编程为胰岛β细胞新的最佳转染组合Pdx1、Pax4、Neurod1。第三，根据各个转录因子发挥作用的先后顺序，筛选出最佳转染时段24h，从而提高了直接重编程为胰岛细胞的成熟度问题，本研究中重编程效率达23％。
【IPC分类】A61K38/28, C12N5/10, C12N5/071, C07K14/62, A61K35/39, A61P3/10
【公开号】CN105002142
【申请号】CN201510400183
【发明人】李富荣, 齐晖, 邓春艳, 张田田
【申请人】深圳市人民医院
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月9日