8a (+)-NH_E36及重组菌株的正确性， 最终获得基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH_E36。
[0042] 实施例3 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH_E36的腈水合酶表达与纯化
[0043] 将基因工程菌E.coli pET28a(+)-NH_E36甘油保藏菌种接于5mL含50yg/ml Kan的LB液体培养基中，37°C，200rpm振荡培养10?14h。取2mL培养液转接至IOOmL含 50 μ g/ml Kan的新鲜LB液体培养基中，37 °C，200rpm振荡培养至菌体密度（OD6 J达到0. 8 左右时，加入IPTG至终浓度为0· ImM，18?37°C下诱导12?18h。在5000?IOOOOXg条 件下离心5?IOmin收集细胞，用磷酸缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)洗涤两次，重悬 于磷酸缓冲液。在冰浴中，采用超声破碎仪破碎细胞，在5000?10000 X g条件下离心5? 30min，收集细胞破碎上清液，细胞破碎上清液以0. 5?2. OmL/min的流速经过镍（Ni-)柱， 再由磷酸缓冲液（50?200mM，pH5. O?8. 0,含250mM咪唑）进行洗脱，收集目标蛋白。基 因工程菌E. coli pET28a(+)-NH_E36的表达和纯化采用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电 泳（SDS-PAGE)进行检测，SDS-PAGE电泳图如图3所示。
[0044] 实施例4 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH E36催化3-氰基吡啶生成烟酰胺
[0045] 取IOOml实施例3基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在 5000?IOOOOXg条件下离心5?30min收集菌体，细胞湿重为I. 14g。然后用50ml磷酸 缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞悬液。向重悬液 中加入终浓度0. 8mol/L缓冲液的3-氰基吡啶，25°C下进行反应，反应1小时。采用HPLC 法检测反应体系内的3-氰基吡啶和烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无3-氰基吡啶 的残留，其转化率为100 %，烟酰胺的得率> 99%。
[0046] 底物和产物的检测采用高效液相色谱法（HPLC):高效液相色谱仪（Agi Ient 1100, USA)，紫外（UV)检测器，检测波长为230nm，色谱柱为Varian PURSHT C18反向色谱 柱（4. 6mmX250mm)，流动相为磷酸乙腈缓冲液（pH2. 8)，流速设定为0. 5?I. OmL/min。在 此条件下，3-氰基吡啶及其转化产物（烟酰胺和烟酸）的HPLC色谱图如图4所示，保留时 间分别为19. 3, 7. 6和6. 7min。
[0047] 首先，用蒸馏水分别配置不同浓度的3-氰基吡啶溶液（0. 2mmol/L、0. 4mmol/L、 0· 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. 0mmol/L、l. 2mmol/L)和烟醜胺溶液（0· 2mmol/L、0. 4mmol/L、 0. 6mmol/L、0. 8mmol/L、l. 0mmol/L、l. 2mmol/L)的标准溶液，HPLC 法检测积分得到峰面积， 根据峰面积绘制底物和相应产物标准曲线，并得到回归方程。3-氰基吡啶和烟酰胺的回归 方程分别为：y = 1373. 8x和y = 1279. 9x(y :峰面积；X :3_氰基啦啶和烟酰胺浓度，mmol/ L)，回归方程的R2分别为0. 994和0. 998。样品中各物质的含量由该回归方程计算得到。
[0048] 实施例5 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH E36催化4-氰基吡啶生成异烟酰 胺
[0049] 取IOOml实施例3基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在 5000?IOOOOXg条件下离心5?30min收集菌体，细胞湿重为I. 25g。然后，用50ml磷酸 缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬 液中加入终浓度0. 8mol/L的4-氰基吡啶，25°C下进行反应，反应1. 5小时。采用HPLC法 检测反应体系内的4-氰基吡啶和异烟酰胺的含量。结果发现反应体系内已无4-氰基吡啶 残留，转化率为100%，异烟酰胺得率> 99%。HPLC检测方法同实施例4。
[0050] 实施例6 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH E36催化苯甲腈生成苯甲酰胺
[0051] 取IOOrnl实施例3基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在 5000?IOOOOXg条件下离心5?30min收集菌体，细胞湿重为I. 23g。然后，用50ml磷酸 缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬 液中加入0. 5M苯甲腈，25°C下进行反应，反应1小时。采用HPLC法检测反应体系内的苯甲 腈和苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯甲腈残留，转化率为100%，本甲酰胺的 得率> 99%。HPLC检测方法同实施例4。
[0052] 实施例7 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH E36催化3-甲基苯甲腈生成3-甲 基苯甲酰胺
[0053] 取IOOrnl实施例3基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在 5000?10000 Xg条件下离心5?30min收集菌体，细胞湿重为I. 16g。然后，用50ml磷酸 缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重 悬液中加入终浓度0. 5mol/L的3-甲基苯甲腈，25°C下进行反应，反应1小时。采用HPLC 法检测反应体系内的3-甲基苯甲腈和3-甲基苯甲酰胺的含量。结果发现反应体系内已无 3-甲基苯甲腈残留，转化率为100%，3_甲基苯甲酰胺得率> 99%。检测方法同实施例4。
[0054] 实施例8 :基因工程菌株E. coli pET28a(+)-NH E36催化苯乙腈生成苯乙酰胺
[0055] 取IOOml实施例3基因工程菌E. coli pET28a(+)-NH E36的诱导培养液，在 5000?IOOOOXg条件下离心5?30min收集菌体，细胞湿重为I. 18g。然后，用50ml磷酸 缓冲液（50?200mM，pH5. 0?8. 0)重悬菌体细胞，即得工程菌的静息细胞重悬液。向重悬 液中加入终浓度0. 5mol缓冲液的苯乙腈，25°C下进行反应，反应1. 5小时。采用HPLC法检 测反应体系内的苯乙腈和苯乙酰胺的含量。结果发现反应体系内已无苯乙腈残留，转化率 为100%，苯乙酰胺得率> 99%。检测方法同实施例4。
[0056] 对比例1
[0057] Prasad S. (Indian Journal of Microbiology, 47:34_41，2〇〇7)等从 土壤筛 选到一株紫红红球菌PA_34(Rhodococcus rhodochrous PA-34)来催化3-氛基卩比啶的 水合反应。发现在IL的反应体系中，含9. Og野生菌细胞（干重），12h内完全转化7M 3_氰基吡啶水合生成855g烟酰胺，其生产率为71. 2g烟酰胺/L/h。本发明的工程菌 E. colipET28a(+)-NH E36,在50ml体系中，含I. 14g湿细胞，Ih内完全转化0. 8M 3-氰基吡 啶水合生成4. 88g烟酰胺，其生产率为97. 6g烟酰胺/L/h。
[0058] 对比例2
[0059] Wieser M. (FEMS Microbiology Letters, 169:17-22, 1998)等分离和纯化了来源 于野生菌Rhodococcus rhodochrous Jl的两种腈水合酶：低分子量和高分子量腈水合酶。 这两种腈水合酶对芳香腈显示出很高的催化活力，如苯甲腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶和 4_氰基吡啶。然而，由于在野生菌细胞中含有酰胺酶基因，可以进一步将烟酰胺转化为烟 酸，降低了目标产物的纯度和得率。另外，该野生菌分别在日本、美国和中国等申请了专利， 也是目前瑞士龙沙集团催化3-氰基吡啶制备烟酰胺的生产菌株。本发明构建的基因工程 菌E. coli pET28a(+)-NH E36同样对芳香腈显示出较高的活力，具有很高的应用价值。
【主权项】
1. 一种重组腈水合酶基因，其特征在于所述重组腈水合酶基因由SEQ ID NO. 2所示α 亚基、SEQ ID NO. 3所示β亚基和SEQ ID NO. 4所示活化元件依次连接构成。
2. -种由权利要求1所述的腈水合酶基因编码的重组腈水合酶。
3. 如权利要求2所述的重组腈水合酶，其特征在于所述重组腈水合酶由SEQ ID NO. 2 所示α亚基基因编码的SEQ ID NO. 5所示氨基酸序列、SEQ ID NO. 3所示β亚基基因编 码的SEQ ID NO. 6所示氨基酸序列和SEQ ID NO. 4所示活化元件编码的SEQ ID NO. 7所示 氨基酸序列依次连接构成。
4. 一种由权利要求1所述重组腈水合酶基因构建的重组载体。
5. -种由权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。
6. -种权利要求2所述重组腈水合酶基因在制备重组腈水合酶中的应用，其特征在于 所述的应用为：将SEQ ID NO. 2所示α亚基、SEQ ID NO. 3所示β亚基和SEQ ID NO. 4所 示活化元件依次连接，合成重组腈水合酶基因，将重组腈水合酶基因与载体连接，构建含重 组腈水合酶基因的重组载体，再将重组载体转化宿主菌，获得的重组基因工程菌诱导培养， 培养液分离获得含重组腈水合酶的菌体细胞。
7. -种权利要求1所述的重组腈水合酶在催化腈化合物生成酰胺中的应用。
8. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含重组腈水合酶基因的重 组基因工程经诱导培养后获得的湿菌体为催化剂，以pH5. 0?8. 0的磷酸缓冲液为反应介 质，以腈化合物为底物，在25°C下进行反应，反应结束后，获得含酰胺的反应液，将反应液分 离纯化，获得酰胺；所述催化剂的用量以湿菌体的重量计为10?50g/L缓冲液，所述底物的 终浓度为〇· 2?I. Omol/L缓冲液。
9. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述的催化剂制备方法为：将含重组腈水合 酶基因的重组基因工程接于含50 μ g/ml Kan的LB液体培养基中，37 °C，200rpm振荡培养 10?14h，取培养液以体积浓度2 %的接种量转接至含50 μ g/ml Kan的新鲜LB液体培养基 中，37°C，200rpm振荡培养至0D_达到0· 6?I. 0时，加入终浓度0· ImM的IPTG，18?37°C 下诱导12?18h，离心，获得湿菌体。
10. 如权利要求7所述的应用，其特征在于所述腈化合物为3-氰基P比啶、4-氰基P比啶、 苯甲腈、3-甲基苯甲腈或苯乙腈。
【专利摘要】本发明公开了一种腈水合酶基因、编码酶、载体、工程菌及其制备酰胺化合物的应用，所述重组腈水合酶基因由SEQ？ID？NO.2所示α亚基、SEQ？ID？NO.3所示β亚基和SEQ？ID？NO.4所示活化元件依次连接构成；本发明实现了源自亚硫酸杆菌E-36中假定腈水合酶基因在大肠杆菌细胞中的功能表达，提供了一种高效表达该酶的基因工程菌，可以高效转化芳香腈生产相应酰胺化合物。
【IPC分类】C12P17-12, C12N9-88, C12P13-02, C12N15-70, C12N1-21, C12N15-60
【公开号】CN104561064
【申请号】CN201410843293
【发明人】裴晓林, 王秋岩, 杨立荣, 吴坚平
【申请人】杭州师范大学
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月30日