原受体的微环DNA缺乏抗性标记基因、复制原点等细 菌序列，相比传统质粒载体，其提1? 了在临床上的安全性，且能提1?重组嵌合抗原受:体基因 表达的稳定性和持久性；相比病毒载体，该微环DNA无插入突变的风险和免疫原性，且制备 成本低；因此，本发明提供的含重组嵌合抗原受体的微环DNA是一种安全、高效、经济的治 疗载体。
[0127] 第四方面，本发明提供了一种含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA的制备 方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0128] (1)提供或制备含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒，所述微 环DNA重组母质粒是在微环DNA空质粒的多克隆位点中插入重组嵌合抗原受体基因表达盒 的基因序列组合而成，其中，所述微环DNA空质粒为ρ2Φ031质粒或pMC. BESPX质粒，所述 重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终止密码 子和PO IyA加尾信号；
[0129] (2)将步骤（1)所得的含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒转 化宿主菌，在OC31重组酶的作用下非可逆地产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含有 attR位点的微环DNA ;
[0130] (3)步骤（2)所得的含有attL位点的细菌质粒DNA被I-Sce内切酶酶切后成线性 DNA片段后，继而在宿主菌内降解，然后采用常规质粒提纯试剂盒提纯所述含有attR位点 的微环DNA，所述微环DNA为具有attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其 中，所述重组嵌合抗原受体基因表达盒包括依次连接的启动子、重组嵌合抗原受体基因、终 止密码子和polyA加尾信号。
[0131] 优选地，所述重组嵌合抗原受体基因具有编码重组嵌合抗原受体的核苷酸序列， 所述重组嵌合抗原受体包括胞外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单 位，其中，所述胞外抗原识别亚单位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜 连接亚单位为胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚 单位具有活化免疫效应细胞的胞内信号转导区；
[0132] 所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
[0133] 肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨 膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
[0134] 其中，所述重组嵌合抗原受体为膜受体分子，其肿瘤细胞抗原表位的结合位点通 过铰链区、跨膜区与胞内信号转导区依次相连；所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点具有结 合肿瘤细胞抗原表位的能力，所述铰链区能让该膜受体分子的胞外区，即肿瘤细胞抗原表 位的结合位点充分伸展，保持其肽段的功能完整性，从而充分行使识别、结合肿瘤抗原的功 能；所述跨膜区为连接膜受体分子的胞外抗原识别亚单位和胞内信号转导亚单位的肽段； 所述胞内信号转导亚单位的肽段具有信号转导激活基序。
[0135] 进一步优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区 scFv，所述铰链区为CD8 α链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的 α链，所述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号 转导区依次包括第二转导信号和第一转导信号。
[0136] 更进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所 述第一转导信号为免疫球蛋白Fc ε RI受体的Y链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二 转导信号为⑶27、CD28、4-IBB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-1 和 ICOS 中的两种。
[0137] 特别优选地，所述抗⑶19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述 第二转导信号依次包括⑶28和4-IBB，所述⑶28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述 4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为⑶3的ζ链，所述⑶3的 ξ链的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。
[0138] 更进一步优选地，所述⑶8 α链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示；所述 ⑶8的α链的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
[0139] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体(肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链 区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信 号转导区）的氨基酸序列为
[0140] SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:5-SEQ ID N0:6-SEQ ID N0:2-SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:4。
[0141] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体(肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链 区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信 号转导区）基因的核苷酸序列为
[0142] SEQ ID N0:9-SEQ ID NO:IO-SEQ ID NO:Il-SEQ ID N0:12-SEQ ID N0:13-SEQ ID NO:14。
[0143] 其中，所述核苷酸序列皆为基因 （DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠 代表各核苷酸序列顺序连接。
[0144] 进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中 的一种。
[0145] 进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、 胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和 甲状腺癌细胞中的一种。
[0146] 以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明 所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
[0147] 进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原 表位。
[0148] 进一步优选地，所述启动子和所述重组嵌合抗原受体基因之间连接有编码CD8信 号肽的核苷酸序列，所述编码CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID N0:7所示。
[0149] 优选地，所述p2 C>C31质粒构建方法参照Chen ZY et al.，Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo, Molecular Therapy, 2003,Volume8, Number3, 495-500、Chen ZY et al. , Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo, Human Gene Therapy, 2005, Volumel6, Numberl, 126-131 和美国专利 US7897380B2。
[0150] 优选地，所述pMC. BESPX质粒的全基因序列如Chen ZY et al. , A robust system for production of minicircle DNA vectros, Nature Biotechnology, 2010, Volume28, Nu mberl2, 1289-1291 所述。
[0151] 优选地，所述启动子为巨细胞病毒CMV启动子、劳斯肉瘤病毒RSV启动子、泛素 UBC 启动子和延长因子EFla启动子。
[0152] 进一步优选地，所述启动子为延伸因子启动子（EF1 a启动子)。
[0153] 该EFl a启动子能使得目的蛋白在NK、T细胞等免疫效应细胞中更高效的表达。
[0154] 优选地,所述EFl a启动子的核苷酸序列如SEQ ID N0:8所示。
[0155] 本发明采用的启动子可以为巨细胞病毒CMV、RSV、UBC和EFla等真核表达启动子 之一，EFl a启动子只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选启动子，本发明可以根据表 达宿主细胞的不同等条件选择不同的启动子构建微环DNA母质粒。
[0156] 优选地，所述终止密码子的核苷酸序列为TAG。
[0157] 优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA或SV40加尾信号。
[0158] 进一步优选地，所述polyA加尾信号为牛生长激素多聚核苷酸bpA。
[0159] 优选地，所述牛生长激素多聚核苷酸bpA加尾信号的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15 所示。
[0160] 本发明采用的polyA加尾信号可以为SV40等polyA加尾信号之一，bpA加尾信号 只是本发明构建的微环DNA母质粒的更优选的加尾信号，本发明可以根据表达宿主细胞的 不同等条件选择不同的加尾信号构建微环DNA母质粒。
[0161] 优选地，所述重组嵌合抗原受体基因由全基因合成或PCR克隆的方式获得。
[0162] 优选地，所述重组酶为Φ031重组酶。
[0163] 优选地，所述宿主菌为ToplO。
[0164] 优选地，所述宿主菌为ZYCY10P3S2T工程菌。
[0165] 优选地，所述含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA重组母质粒在宿主菌 内发生位点特异性重组的过程为：含重组嵌合抗原受体基因表达盒的重组表达载体具有 attB位点和attP位点，该attB位点和attP位点能在C>C31重组酶的作用下进行重组，使 得微环母质粒非可逆地产生含有attL位点的细菌质粒DNA环和含attR位点的微环DNA，所 述含attR位点的微环DNA不含原核质粒序列，且能游离于人及哺乳动物细胞染色体DNA外 稳定持久表达重组嵌合抗原受体，所述含有attL位点的细菌质粒DNA环则被I-Scel酶切 为线性DNA，继而被宿主菌降解，有利于微环DNA的分离提纯。
[0166] 优选地，本发明提供的如第三方面或第四方面所述的含重组嵌合抗原受体基因表 达盒的微环DNA按下述一种或多种方法进行应用：
[0167] (1)将所述微环DNA单独进行应用；
[0168] (2)将所述微环DNA与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合 应用；
[0169] (3)采用体内靶向投递的方式将所述微环DNA直接投递到患者体内进行治疗；
[0170] (4)先通过体外转染技术将所述微环DNA转染免疫效应细胞，然后将所述转染有 微环DNA的免疫效应细胞输回患者体内实施治疗。
[0171] 本发明提供的微环DNA不含原核质粒序列，且能游离于人及哺乳动物细胞染色体 DNA外稳定持久表达重组嵌合抗原受体，可单独使用进行靶向治疗，比如投递到患者体内表 达重组嵌合抗原受体，引导T细胞特异性杀伤肿瘤细胞。
[0172] 本发明提供的微环DNA还可以在体外转染患者的免疫效应细胞，再将该转染后的 免疫效应细胞回输患者体内，以细胞的形式进行治疗。
[0173] 本发明提供的微环DNA还可以通过联合化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗等 技术进行治疗。
[0174] 第五方面，本发明提供了一种宿主，所述宿主包含如第三方面或第四方面所述的 微环DNA。
[0175] 优选地，所述宿主为人或哺乳动物。
[0176] 优选地，所述宿主为人或哺乳动物细胞。
[0177] 进一步优选地，所述哺乳动物细胞为CHO细胞。
[0178] 第六方面，本发明提供了一种重组嵌合抗原受体，所述重组嵌合抗原受体包括胞 外抗原识别亚单位、穿膜连接亚单位和胞内信号转导亚单位，其中，所述胞外抗原识别亚单 位具有肿瘤细胞抗原表位的结合位点和铰链区，所述穿膜连接亚单位为胞内信号转导蛋白 的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区，所述胞内信号转导亚单位具有活化免疫效应细胞的 胞内信号转导区；
[0179] 所述重组嵌合抗原受体的氨基酸序列连接形式依次为：
[0180] 肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨 膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信号转导区。
[0181] 优选地，所述肿瘤细胞抗原表位的结合位点为单克隆抗体的单链可变区scFv，所 述铰链区为CD8a链的铰链区，所述I型跨膜蛋白的跨膜区为CD4、CD28或CD8的α链，所 述胞内信号转导蛋白的跨膜区为IgG的重链，所述活化免疫效应细胞的胞内信号转导区依 次包括第二转导信号和第一转导信号。
[0182] 进一步优选地，所述单克隆抗体的单链可变区scFv为抗CD19分子单链抗体，所述 第一转导信号为免疫球蛋白Fc ε RI受体的Y链和CD3的ζ链中的至少一种，所述第二转 导信号为 CD27、CD28、4-IBB (CD137)、0X40、CD30、CD40、PD-1 和 ICOS 中的两种。
[0183] 特别优选地，所述抗⑶19分子单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示；所述 第二转导信号依次包括⑶28和4-IBB，所述⑶28的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述 4-IBB的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述第一转导信号为⑶3的ζ链，所述⑶3的 ξ链的氨基酸序列如SEQ ID Ν0:4所示。
[0184] 进一步优选地，所述⑶8 a链的铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；所述 ⑶8的a链的氨基酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0185] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体(肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链 区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信 号转导区）的氨基酸序列为
[0186] SEQ ID N0:1-SEQ ID N0:5-SEQ ID N0:6-SEQ ID N0:2-SEQ ID N0:3-SEQ ID N0:4。
[0187] 优选地，本发明提供的重组嵌合抗原受体(肿瘤细胞抗原表位的结合位点-铰链 区-胞内信号转导蛋白的跨膜区或I型跨膜蛋白的跨膜区-活化免疫效应细胞的胞内信 号转导区）基因的核苷酸序列为
[0188] SEQ ID N0:9-SEQ ID NO:IO-SEQ ID NO:Il-SEQ ID NO:12- SEQ ID N0:13-SEQ ID NO:14。
[0189] 其中，所述核苷酸序列皆为基因 （DNA片段）两条单链之一的核苷酸序列，横杠 代表各核苷酸序列顺序连接。
[0190] 进一步优选地，所述免疫效应细胞选自T淋巴细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞中 的一种。
[0191] 进一步优选地，所述肿瘤细胞选自B淋巴细胞肿瘤细胞、白血病细胞、肺癌细胞、 胃癌细胞、结直肠癌细胞、肝癌细胞、食管癌细胞、乳腺癌细胞、胰腺癌细胞、膀胱癌细胞和 甲状腺癌细胞中的一种。
[0192] 以上所述免疫效应细胞和所述肿瘤细胞为优选的种类，实际应用中不限于本发明 所例举的具体的上述免疫效应细胞和肿瘤细胞。
[0193] 进一步优选地，所述胞外抗原识别亚单位靶向结合所述肿瘤细胞的至少一个抗原 表位。
[0194] 优选地，所述重组嵌合抗原受体由含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA在 宿主细胞内表达。
[0195] 进一步优选地，所述重组嵌合抗原受体锚定在宿主细胞膜的表面。
[0196] 第七方面，本发明提供了一种重组嵌合抗原受体的制备方法，其特征在于，包括如 下步骤：
[0197] (1)提供或制备含重组嵌合抗原受体基因表达盒的微环DNA，所述微环DNA为具有 attR位点和重组嵌合抗原受体基因表达盒的环状DNA，其中，所述重组嵌