黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用的制作方法

黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一个黄瓜CsLOX1基因花特异表达载体及其在花器官改造中的应用，属于生物【技术领域】。该载体为含有拟南芥花特异启动子AP3和黄瓜CsLOX1的植物表达载体。在拟南芥中表达CsLOX1基因，获得的CsLOX1转基因植株的花瓣呈封闭状、花瓣发育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的数目增加，不正常异位生长的胚珠和柱头明显可见，表明CsLOX1在黄瓜花器官的发育中起重要的调控作用。利用CsLOX1基因获得的花器官发生变异的新材料可用于农作物和观赏植物的育种应用。
【专利说明】 黄瓜CsLOXI基因花特异表达载体及其应用

【技术领域】
[0001]本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种黄瓜CsLOXl基因花特异表达载体及其应用。

【背景技术】
[0002]脂氧合酶(LOX)是一类广泛存在于动植物体中的非血红素铁蛋白，其参与脂肪酸氧化途径中的LOX途径，专一催化含有顺，顺-1，4-戊二烯结构的多元不饱和脂肪酸的加氧反应。脂氧合酶基因家族在植物界广泛存，是一个多基因的家族，具有9-L0X和13-L0X两种类型，存在着不同数量的同工酶。植物LOX基因的表达贯穿于植物生活史的整个过程，在植物生长发育的各个阶段，包括种子的萌发、块茎的形成、结节的发育、花的发育、果实的成熟以及植物体的衰老，都可以检测到LOX基因的表达。随着分子生物学技术的不断发展，已从拟南芥、水稻、番茄、马铃薯、玉米等植物器官中克隆了 LOX基因。目前，脂氧合酶基因的研究重点主要是侧重于其参与衰老和胁迫的调控、果实醛类芳香物质的形成，但其在花发育中的功能报道还较少。Ιν?η等的研究发现，玉米脂氧合酶基因TSl功能的丧失会使得雄蕊变为雌蕊状的结构，表明脂氧合酶基因在玉米花的发育中起着重要的作用。
[0003]黄瓜(Cucum is sativus L.)是葫芦科重要的蔬菜作物之一，中国是黄瓜栽培和生产大国，且为主要的温室产品之一，广泛分布于各地，对其进行深入的研究具有重要的理论和实践意义。2008年黄瓜基因组测序的完成为从分子水平上研究黄瓜基因的相关功能提供了可能。我们通过前期的研究发现，在黄瓜基因组中共存在着23个CsLOX基因，通过表达的分析发现仅CsLOXl基因在黄瓜花蕾决定的第6时期特异表达，标明其可能在黄瓜花的发育共起着重要的调控作用。进一步通过相关实验证实CsLOXl在黄瓜花发育中的作用后，可利用基因工程的策略来改变CsLOXl在植物体内的表达量以此来改变植物的花型，或作为潜在的育种材料应用在育种上。


【发明内容】

[0004]本发明的目的在于提供一种黄瓜LOXl基因花特异表达载体及其在花器官改造中的应用，该载体含有来自黄瓜脂氧合酶CsLOXl，基因的上游连有拟南芥AP3花特异启动子。
[0005]本发明的上述植物表达载体为1301-AP3_CsL0Xl，由下述方法构建而成:
(I)设计拟南芥花特异性启动子AP3特异性引物AP3-F: 5 ’ -aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3’(含 BamHI 位点)，AP3-R: 5’- aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC -3’(含PstI位点)，以拟南芥基因组为模板进行PCR扩增获得AP3启动子。回收并纯化AP3启动子，将其连接到PMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒PMD18-AP3。
[0006](2)使用BamHI和PstI酶切pMD18_AP3和表达载体1301，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得中间表达载体1301-AP3。
[0007](3)根据NCBI上黄瓜CsLOXl的公布的序列(登录号为U25058)，设计两端引物:CsLOXl-F:5，-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’(含 PstI 位点)CsLOXl-R:5，-aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’(含BamHI位点)。以黄瓜花蕾的cDNA第一链为模板进行PCR扩增，获得CsLOXl全长。回收CsLOXl的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsL0Xl。
[0008](4)使用 PstI 和 BamHI 酶切 pMD18_CsL0Xl，回收 CsLOXl 片段，使用 PstI 和 BglII(BamHI和BglII为同尾酶)酶切中间表达载体1301-AP3，回收大片段，将CsLOXl片段与载体1301-AP3大片段进行连接、转化感受态细胞，获得植物表达载体1301-AP3-CsL0Xl。
[0009]本发明的另一目的是公开黄瓜CsLOXl在花器官改造中的基因工程应用，该基因导入拟南芥后，转基因植株花瓣呈封闭状、花瓣发育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的数目增加，不正常异位生长的胚珠和柱头明显可见。该基因可作为目的基因导入其它植物，改变植物的花型，以进行植物品种的改良。

【专利附图】

【附图说明】
[0010]图1为本发明中AP3启动子扩增后的电泳示意图；
图2为本发明表达载体1301-AP3的BamHI和PstI双酶切电泳检测图；
图3为本发明中CsLOXl扩增后的电泳示意图；
图4为本发明中质粒1301-AP3-CsL0Xl的SacI酶切电泳检测图；
图5为转基因植株的PCR鉴定；
图6为过量表达CsLOXl的转基因拟南芥植株的表达分析；
图7为过量表达CsLOXl的转基因拟南芥植株花的表型，其中(A)为野生型，(B)-(D)为转基因植株。

【具体实施方式】
[0011]下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，这些实施例仅用于举例说明本发明，而不对本发明的范围构成任何限制。
[0012]实施例中所涉及的试剂主要分为分子生物学实验试剂、各种限制性内切酶、TaqDNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP等为日本宝生物工程有限公司(大连)产品，质粒提取试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取试剂购自invitrogen公司，高保真酶KOD-Plus购于Τ0Υ0Β0公司，DNase I购于天根生化科技(北京)有限公司，DNA提取试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。其余试剂均为国产分析纯；仪器均为分子生物学以及基因工程实验室常用仪器。所有引物序列均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本发明实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
[0013]实施例1:花特异表达启动子表达载体1301-AP3的构建
(1)引物设计:参照Hill(1998)和Duan (2008)，从Genbank Data下载花特异性启动子AP3启动子及其5’端序列(G1: 223046640)，取转录起始位点前的726 bp，设计拟南芥花特异性启动子AP3特异性引物:
AP3-F:5，-aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA-3，(含 BamHI 位点)
AP3-R:5’ - aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC -3’(含 PstI 位点)
(2)拟南芥基因组的提取所用的拟南芥为野生型拟南芥，为江西农业大学作物生理生态与遗传育种重点实验室保存。在放有拟南芥种子1.5 ml离心管中加入I ml 75%的酒精，消毒5分钟，上下颠倒离心管使种子与酒精充分接触。消毒完后，将离心管中的酒精吸出，用灭菌的ddH20漂洗3-5遍。种子漂洗完后将适量0.1%琼脂糖加入离心管中。将种子均匀滴到1/2MS固体培养基(PH5.8-6.2,6.5%琼脂粉)中。培养皿于4°C冰箱2_3天，后置于组培室内，光照培养2周进行移栽。用喷壶浇入PNS营养液(1L体积:1M KN03 5ml ；1M Ca (N03) 2.4Η202ml ；1M MgS04.7H20 2ml ；20mM Fe-EDTA 2.5ml ；1M 磷酸缓冲液(pH5.5) 2.5ml ；MS 微量元素Iml ;水补足1L)，将营养土(体积比:蛭石:珍珠岩:黑土 =3:1:2)浇透。塑料钵置于托盘内，用镊子轻轻夹取拟南芥幼苗下胚轴处，慢慢将拟南芥的根从培养基中拔出，轻轻将根插入塑料钵内的营养土中，苗距2cm以上，播完后用保鲜膜罩上，三天揭膜。以后相对湿度70%，恒温20-24°C，光照强度80-200umol/M2/S，光照周期为8 h黑暗、16 h光照培养。移栽后30天取拟南芥叶100 mg进行DNA的提取。
[0014](3)拟南芥花特异性启动子AP3的PCR扩增
以拟南芥基因组DNA为模板，使用引物AP3-F和AP3-R进行PCR扩增AP3的启动子片段，PCR 的 25μ I 体系为:K0D 缓冲液(1X) 2.5 μ I, KOD 0.5 μ 1、cDNA 模板 I μ 1、1mMdNTP 0.5 μ 1、10μΜ AP3_F$*ly IUOyM ΑΡ3-Ι^_1μ 1、使用无菌水补足 25 μ I。反应条件为:94°C 5min, 35 个循环，94°C变性 30s，55°C退火 30s，68°C延伸 60s，68°C反应 lOmin。PCR经1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测发现，其长度与预期大小(726bp) —致(见图1)。
[0015](4)AP3片段的回收
对PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0016](5)AP3片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR产物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶缓冲液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C处理 45 min ;先加 0.18 mL无菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀60 min,12，OOOrpm, 4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存备用。
[0017](6)AP3片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到PMD18-T载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入:AP3片段的cDNA 5μ 1、pMD18-T载体0.5μ 1、10XT4 DNA连接酶缓冲液I μ 1，Τ4 DNA连接酶14 1，加无菌水至1(^1，用封口膜封好；置于161:连接4-611。将10(^1感受态肠杆菌Ε.coli DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5 min ；加入800μ1 LB液体培养基，37 °C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规
3,000 rpm离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清,剩余约0.1 ml时,使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒PMD18-AP3，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2 μ l.BamH I 0.5 μ l.Pst I 0.5 μ IUOXbuffer (K) I μ 1，使用无菌水补足20μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒pMD18-AP3可酶切出预期大小，将酶切正确的重组质粒PMD18-AP3进行测序验证插入基因的正确性。
[0018](7)表达载体1301-AP3的构建
使用BamHI和PstI对质粒pMD18_AP3和载体PCAMBIA1301 (简称1301)进行双酶切，分别获得5’端带有BamHI和3’端带有PstI的AP3片段和1301载体，电泳后分别进行胶回收，16°C连接4-6h ;将100 μ I感受态肠杆菌Ε.coli DH5 α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42°C热刺激90s后，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液体培养基，37°C >200rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后,常规3，000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时,使用移液枪混勻,接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，37°C、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒1301-AP3，具体方法为:向0.5 ml 的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2 μ 1、BamHI 0.5μ 1、PstI 0.5μ1、1Xbuffer (Κ)2 μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒1301-AP3可酶切出预期大小(726bp)的片段(见图2)。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行序列验证，最后获得花特异表达启动子表达载体1301-AP3。
[0019]花特异表达启动子表达载体1301-AP3_CsL0Xl的构建
(I)引物设计:根据NCBI上黄瓜CsLOXl的公布的序列(登录号为U25058)，设计两端引物:
CsLOXl-F:5，-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’(含 PstI 位点)
CsLOXl-R:5’ -aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’(含 BamHI 位点)。
[0020](2)黄瓜花蕾总RNA的提取
所用黄瓜品种为华北型黄瓜。取长度约0.7 mm的花蕾lmg，取材后立刻冻到液氨中，米用 TRIzol (Invitrogen,USA)试剂法提取总 RNA:加 1.5 ml Trizol 后，室温放置 5 min,使其充分裂解。12，OOOrpm离心5 min，弃沉淀。加200 ul氯仿，振荡混匀后室温放置15min。4°C 12, OOOg离心15 min。吸取上层水相，至另一离心管中。加0.5ml异丙醇，混匀，室温放置30 min。4°C 12, OOOg离心10 min，弃上清。用I ml 75%乙醇洗涤2次沉淀。4°C 8, OOOg 离心 5 min,弃上清。室温晾干 10 min。用 50 uL H2O (Rnase free)溶解 RNA。
[0021](3)黄瓜花蕾总cDNA第一链的合成
黄瓜花蕾RNA用DNase I处理后用于以Oligo (dT) 18为引物的反转录:取RNA 15 uL，加Oligo (dT) 18 I uL，混匀，70°C保温5min，立即冰水浴，稍离心，依次加入10XM-MLV Buffer
2uL、dNTP (1mM) I uL、RNasin (40U/uL) I uL、M-MLV (200U/uL) I uL，总体积 20 uL,混匀，42°C保温60min，95°C 1min灭活M-MLV酶活性，_20°C保存。
[0022](4) CsLOXl基因的扩增
设计特异性引物:CsLOXl-F: 5，-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3，(含 PstI 位点)，CsLOXl-R:5’ -aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG-3’(含 BamHI 位点)，以第一链产物为模板，用长片段、高保真酶KOD-PIus进行PCR扩增，PCR反应条件为:94 V 5 min ；94 V 30s ；56 0C 30 s ；68 °C 3.0 min, 40 个循环；68°C 5 min。PCR 产物用 1.2% 琼脂糖进行电泳检测，扩增片段大小约2637bp，与预期大小一致(图3)。
[0023](5) CsLOXl片段的胶回收
对PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的片段，使用胶回收试剂盒，按照试剂盒说明书对目的片段进行回收。
[0024](6) CsLOXl 片段加尾
取1.5 ml灭菌的eppendorf管,依次加入回收的PCR产物14μ 1、10X Taq DNA聚合酶缓冲液 2 μ l、10mM dNTP 2 μ I, Taq DNA 聚合酶 2 μ I ;72°C处理 45 min ;先加 0.18 mL无菌水，再加20 μ I 3Μ醋酸钠，混匀，最后加入2倍体积的无水乙醇，-20°C沉淀60 min,12，OOOrpm, 4°C离心lOmin。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀2次。DNA晾干后加入20 μ L无菌水溶解沉淀，溶解的DNA置于_20°C保存备用。
[0025](7) CsLOXl片段的T/A克隆和测序
将回收片段连接到PMD18载体上，其具体步骤为:向1.5 ml离心管中分别加入:CsLOXl 片段的 cDNA 5 μ l、pMD18 载体 0.5 μ 1、10XT4 DNA 连接酶缓冲液 I μ 1，Τ4 DNA 连接酶1μ 1，加无菌水至10μ 1，用封口膜封好；置于16°C连接4_6h。将100 μ I感受态肠杆菌Ε.coli DH5a加入连接体系中混匀；混合液冰浴30 min，42°C热刺激90 s后，冰浴5min;加入800μ1 LB液体培养基，37 °C、200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后，常规3，000 rpm离心2 min收集菌体；在超净台上吸去上清,剩余约0.1 ml时,使用移液枪混匀，接入带有Amp抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种到带有Amp抗性的LB液体培养基中培养12h，收集菌体，采用质粒抽提试剂盒提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒pMD18-CsL0Xl，具体方法为:向0.5 ml的离心管中分别加入:质粒 DNA (50ng/y I) 2μ 1、PstI 0.5μ 1、BamH I 0.5 μ IUOXbuffer (K) 2μ I,使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;然后将酶切正确的重组质粒pMD18-CsL0Xl进行测序验证插入基因的正确性。
[0026](8)表达载体 1301-AP3_CsL0Xl 的构建
使用PstI和BglII对质粒1301-AP3进行双酶切，使用PstI和BamHI对载体pMD18-CsL0Xl进行双酶切，分别获得5’端带有PstI和3’端带有BamHI的CsLOXl片段，5’端带有PstI和3’端带有BglII的1301-AP3载体(BamHI和BglII为同尾酶)，电泳后分别进行胶回收，16°C连接4-6h ;将100 μ I感受态肠杆菌Ε.coli DH5 α加入6 μ I连接体系中混匀；混合液冰浴30min，42°C热刺激90s后，冰浴5 min ;加入800 μ I LB液体培养基，37°C >200 rpm摇床培养45min使菌体复苏；培养结束后,常规3，000 rpm离心I min收集菌体；在超净台上吸去上清，剩余约0.1 ml时，使用移液枪混匀，接入带有Kan抗性的LB固体平板上，用无菌三角棒涂布均匀；37°C过夜培养；挑取菌落接种于LB液体+Kan的培养基，370C、180rpm培养12h后，提取质粒。通过酶切检测获得的重组质粒1301-AP3，具体方法为:向 0.5 ml 的离心管中分别加入:质粒 DNA(50ng/μ 1)2 μ l、SacI 0.5 μ 1、10Xbuffer(L)2 μ 1，使用无菌水补足20 μ I ;37°C反应4h ;经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测发现，重组质粒1301-AP3-CsL0Xl可酶切出预期约600 bp和360 bp的片段(图4)。将酶切正确的重组质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序进行序列验证(其核苷酸序列如SEQ IDNOl所示)，最后获得花特异表达启动子表达载体1301-AP3-CsL0Xl。
[0027]实施例2:1301-AP3-CsL0Xl 转农杆菌 GV3101 (I)农杆菌感受态细胞制备挑取农杆菌GV3101单菌落接种于5ml YEB培养基中，28°C摇培过夜，按1:100的比例接种于50 ml YEB培养基中扩培，28°C继续培养约6_7h至0D600=0.4-0.6。将菌液置于冰上30min ；5, 000 rpm, 4°C离心 5min,弃上清，将菌体悬于 10 ml 0.15 M NaCl 中；5，000 rpm,4°C离心5min，弃上清，菌体用I ml 20 mM CaCl2,4°C )轻轻悬浮，每管200μ1分装，或加入终浓度为20%的无菌甘油，-70°C保存。
[0028](2)农杆菌的转化及鉴定
将10μ1质粒DNA加入200 μ I农杆菌感受态中，混匀，冰浴30min，液氮冷冻3_5min，37°C水浴5min,加入I mlYEB培养基，28°C摇培3_4h。10，OOOrpm,室温离心30s,弃上清，加入200 μ I YEB培养基重悬菌体，涂于YEB培养基上，28°C培养2天；碱裂解法提取农杆菌质粒DNA，酶切验证。质粒再重新转化大肠杆菌(DH5 α )，过夜培养后，挑取单菌落液体培养，提取质粒DNA，再用酶切鉴定。
[0029]实施例3:含1301-AP3_CsL0Xl的农杆菌GV3101转化拟南芥 (I)拟南芥的种植
①当年收获的种子种植后4度春化72 h，隔年种子种植后春化24 h。然后转入人工培养室中在相对湿度80%，恒温20-24°C，光照强度80-200 μ mol/M2/S,光照周期为8 h黑暗、16 h光照培养。所用的土为3份蛭石，I份珍珠岩和2份黑土混合而成。
[0030]②将营养土用塑料盆装好，在托盘里加入营养液，待营养土吸水潮湿后，开始点种。
[0031]③将拟南芥的种子放在平铺的纸上，用牙签将拟南芥的种子点在土上。用保鲜膜盖好，暗培养两天，四天后揭掉保鲜膜正常培养。
[0032]④土稍干时可再浇一次营养液，以后浇水即可。若要做转化，待抽薹2到3cm时，剪除顶花序，用营养液再浇灌一次。
[0033]⑤种子的收集:拟南芥完全成熟后，停止浇水待植株干燥后将拟南芥剪下放在一张干净的光面纸上收集种子，尽量将杂物去干净，便于筛选。
[0034](2)拟南芥的转化和转化子的筛选
①制备好已转化了相应质粒的农杆菌菌液10 ml，在转化前一天晚上，转入大瓶培养过夜，第二天取出使用时农杆菌液0D600当在1.2到1.6之间。室温5，000 rpm离心10min。弃上清，将农杆菌沉淀悬浮于相应体积的渗透培养基里，使0D600在0.8左右。
[0035]②先将植株上已长出的果荚及开放的花剪掉，再将农杆菌悬浮液直接喷洒至整个植株，主要喷洒在花序上。盖上透明的塑料盖子以保持湿度，移入恒温室避光培养，第二天可开盖，正常光照培养。
[0036]③一周后再喷洒一次，收种子，在相应的抗性1/2 MS平板上筛选转化子。
[0037]④转化子的筛选:种子消毒，先用70%乙醇浸泡10 min，在上述处理时要不时地使种子悬浮，并换一次70%乙醇。最后用无菌水洗四次。
[0038]⑤处理后的种子用Top agar (0.1%琼脂水溶液)均匀涂布在相应的抗性固体筛选培养基表面，每块150 mm直径的平皿最多种1500棵。
[0039]⑥4°C春化2到3天，移入22°C恒温室培养。将筛选出的转化子长到合适的大小后移栽到土壤中。
[0040]实施例4:转基因植株的鉴定和分析 (I)拟南芥DNA的提取
将适量的经筛选的拟南芥叶片放入1.5 ml的离心管中，加入400 μ I的SDS抽提缓冲液，用蓝色小棒研磨成浆状，加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，猛烈摇匀，12，000rpm，离心10 min。取上清至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇和0.1倍体积的3M醋酸钠(PH5.2)，剧烈混匀使DNA成团，放入_20°C沉淀2hr以上。随后12，000 rpm,离心10 min。弃上清，沉淀用70%乙醇洗涤一次后室温晾干，加适量的TE或超纯水溶解。
[0041](2)转基因拟南芥植株的鉴定
以抽提的 DNA 为模板、使用引物 CsLOXl-Fl:CTGCAGTTCCTACTCCCGAAGTT GTC 和CsLOXl-Rl:TCTAGAAGAAGCAATGTTCTTGTGGC 进行 PCR 扩增 CsLOXl 片段，PCR 的 25 μ I 体系为:PCR 缓冲液(1X) 2.5 μ I, Taq 0.5 μ 1、cDNA 模板 2 μ 1、1mM dNTP 0.5 μ IUOyMCsLOXl-F引物I μ 1、10 μ M CsLOXl-R引物I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C 5min，35 个循环，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，72。。反应 1min0 检测结果如图5所示。抽提阳性植株花蕾的总RNA，反转录后合成cDNA第一链，以CsLOX1-FI和CsLOX1-RI为弓I物进行RT-PCR分析，反应体系和程序同上。内参为CsACTIN基因，弓丨物序列为:CsACTIN-F: GACATTCAATGTGCCTGCTATG, CsACTIN-R: CATACCGATGAGAGATGGCTG, PCR 的25 μ I 体系为:PCR 缓冲液(10Χ)2.5μ l、Taq 0.5 μ l、cDNA 模板 2μ IUOmM dNTP 0.5 μ 1、10 μ M CsACTIN-F引物I μ 1、10 μ M CsACTIN-R引物I μ 1、使用无菌水补足25 μ I。反应条件为:94°C 5min，26 个循环，94°C变性 30s，55°C退火 30s，72°C延伸 60s，72°C反应 lOmin。检测结果见图6所示。
[0042](3)转基因拟南芥植株表型分析
通过PCR和RT-PCR的结果，对获得的阳性植物进行观察，获得的CsLOXl转基因植株的花瓣呈封闭状、花瓣发育不完整或缺失、雄蕊退化，雌蕊的数目增加，不正常异位生长的胚珠和柱头明显可见(图7)。
【权利要求】
1.黄瓜CsLOXl基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID N01所示。
2.黄瓜CsLOXl基因花特异表达载体，其特征在于，所述表达载体为1301-AP3-CsL0Xl，含有来自黄瓜脂氧合酶CsLOXl，基因的上游连有拟南芥AP3花特异启动子。
3.根据权利要求2所述的黄瓜CsLOXl基因花特异表达载体，其特征在于，所述表达载体由下述方法构建而成: (1)设计拟南芥花特异性启动子AP3特异性引物，其中AP3-F引物引入了BamHI位点，AP3-R 引物引入了 PstI 位点:AP3-F: 5’ -aaaGGATCCAACTTGTGATTCCTTCTTAA_3’，AP3-R:5’ - aaaCTGCAGATTCTTCTCTCTTTGTTTAATC-3’，以拟南芥基因组为模板进行PCR扩增获得AP3启动子；回收并纯化AP3启动子，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-AP3 ； (2)使用BamHI和PstI酶切pMD18_AP3和表达载体1301，回收后进行连接、转化感受态细胞，获得中间表达载体1301-AP3 ； (3)根据NCBI上黄瓜CsLOXl的公布序列设计两端引物，其中CsL0Xl_F引物引入了PstI 位点，CsLOXl-R 引物引入了 BamHI 位点:CsLOXl-F:5’-aaaCTGCAGATGTTTGGAATTGGGAAG-3’，CsLOXl-R:5’ -aaaGGATCCTTAGATAGAAATACTATTAGG_3’，以黄瓜花蕾的 cDNA 第一链为模板进行PCR扩增，获得CsLOXl全长；回收CsLOXl的cDNA全长，将其连接到pMD18载体上，采用碱裂解法提取质粒DNA，通过PCR检测和酶切检测获得重组质粒pMD18-CsL0Xl ； (4)使用PstI 和 BamHI 酶切 pMD18_CsL0Xl，回收 CsLOXl 片段，使用 PstI 和 Bglll 酶切中间表达载体1301-AP3，回收大片段，将CsLOXl片段与载体1301-AP3大片段进行连接、转化感受态细胞，获得植物表达载体1301-AP3-CsL0Xl。
4.如权利要求2所述黄瓜CsLOXl基因花特异表达载体的应用，其特征在于，将植物表达载体1301-AP3-CsL0Xl导入植物以改变植物的花型。
5.如权利要求4所述黄瓜CsLOXl基因花特异表达载体的应用，其特征在于，将植物表达载体1301-AP3-CsL0Xl转入农杆菌GV3101，再转入到拟南芥中，收获植株的种子，晾干后通过潮霉素筛选获得抗性苗，再通过PCR鉴定和RT-PCR检测后获得转基因植株。
【文档编号】C12N15/82GK104450749SQ201410659267
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】胡丽芳, 刘世强, 贺浩华, 蒋伦伟, 黄长干, 肖伟 申请人:江西农业大学