一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法
【专利摘要】一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，涉及一种菌株及制备木聚糖酶的方法，该菌株于2012年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCCNo.1734。本发明菌株具有良好的极端碱性环境耐受性，其中耐寡营养、pH、NaCl的能力极为突出。本发明菌株在最适条件下生产木聚糖酶，木聚糖酶酶活最高可达68.9U/ml。该菌株能降解多种半纤维素类农业废弃物，包括玉米秸秆、菊芋秸秆、稻草、海带纤维等，在生物质能源转化、农业废弃物利用方面具有广阔的应用前景。具有良好的pH稳定性、热稳定性，且可耐受高浓度盐等特性。做为一种新型的酶制剂，可广泛用于食品、饲料、酿酒、造纸、能源等工业生产中。
【专利说明】-种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种微生物菌株及制备木聚糖酶的方法，特别是涉及一种链霉菌株及 其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，随着全球经济的快速增长，资源能源危机已迫在眉睫，生物质能的可再生 利用备受关注，工农业废弃物的再生利用逐渐成为研究热点。木聚糖是自然界中一种丰富 的再生资源，是除纤维素外，自然界中最丰富的多糖。因此，如何利用木聚糖成为目前研究 的热点。
[0003] 木聚糖是由D-木糖主链（W目一1，4键相连）和心阿拉伯糖分枝（a-1,2和 a -1，3相连)所组成的聚合物，与木质素和纤维素W4-0-meth^-D-glucuronic acid键相 连，形成了交联复杂的结构。正是该种复杂的结构给半纤维素的降解利用带来了很大困难。 目前，工业降解木聚糖常用的方法有酸法、碱法和酶法，其中酸法、碱法应用较为广泛，但酸 \碱水解液中含有较多的有毒物质，对后期微生物发酵有很强地抑制作用；另外，采用酸法 或碱法生产木聚糖，环保压力很大，受到国家政策的限制，因此从长远角度来看，酶法降解 木聚糖将是未来木聚糖降解的主要的方式。
[0004] 木聚糖酶是木聚糖水解酶系中最关键的水解酶。木聚糖被降解时，起主要作用的 酶是目-1，4-内切木聚糖酶和目-D-木糖巧酶。目-1，4-内切木聚糖酶W内切方式作用 于木聚糖主链内部的目-1，4木糖巧键，其主要水解产物为低聚木糖、木寡糖、木二糖等； 目-D-木糖巧酶通过水解低聚木糖、木寡糖等的非还原性末端来催化释放木糖残基。
[0005] 木聚糖酶在造纸工业、食品工业、饲料工业、能源工业等众多领域具有巨大的应用 价值和广阔的应用前景。例如，在纸浆漂白的初始阶段，向纸浆中加入木聚糖酶可W增加 纸浆的光亮度和水解度，从而减少了在后期漂白中氯化物的用量，降低了对环境的污染；在 面包烘烤过程中，向面团中加入木聚糖酶，可缩短面团的发酵时间，改善面包也的弹性和硬 度，增加面包的体积和比容，有效地改善面包赔烤品质；向饲料中添加木聚糖酶可W显著提 高畜禽的品质性能。木聚糖酶可W通过破坏植物细胞壁结构，提高各种类型饲料的利用率， 减少畜禽肠道疾病，促进畜禽健康，提高畜禽成活率；减少粘粪，降低空气中氨气和硫化物 浓度，减少环境污染，减少粘粪排出和脏蛋，使畜禽体重均匀。因此，伴随着人类对于可持续 性发展和环境的重视，木聚糖酶在工业上的应用日益受到人们的重视。
[0006] 放线菌是自然界分布最广泛的微生物类群之一，自从Waksman和化nrici于1943 年建立链霉菌属W来，链霉菌已成为种的数量最大的一个属。目前，包括出现在专利中的 种已经超过3000个，至1996年已有效描述的种有464个和亚种45个。据统计，链霉菌产 生的抗生素占抗生素的70%左右，占放线菌产生抗生素的90% W上，如链霉素、新生霉素 等。而目前对链霉菌的研究热点主要集中于抗生素的生产，对其他代谢物的应用研究还较 少，例如用冰城链霉菌生产酶制剂一木聚糖酶的研究还未见报道。冰城链霉菌选自哈尔 滨化工厂内±壤，特殊的生长环境造就了其独特的代谢方式和代谢产物，该不仅确保其在 极端环境中生存，也提供了产生特殊代谢产物的潜力。其代谢生产的酶一般具有与其生存 环境相关的特性，例如，耐盐性，耐高温性，适冷性等，该些特性在工业极端条件下有广阔应 用前景。此外，由于放线菌的遗传操作简单，便于进行遗传改造。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供一种链霉菌株及其制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，本发明 菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏中也，菌株寡营养、pH、化Cl耐受性性质，耐碱耐盐 木聚糖酶，发酵方法制备的木聚糖酶在45C下长时间维持较高酶活，可降解农业废弃物中 的半纤维素为单糖，供下游工艺发酵利用，产生清洁可再生能源，在能源工业中应用潜力巨 大。
[0008] 本发明的目的是通过W下技术方案实现的： 一种链霉菌株，所述菌株为链霉菌菌属中的冰城链霉菌 如'/?沪?编号226541,2012年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中也，保 藏号为CGMCC No. 1734 ;该菌株属于放线菌口，放线菌目，链霉菌属；菌落在Bennett培养基 平板，3(TC生长时开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，2-3天后从菌落表面产生白灰色 抱子，基底为墨绿色，并产生黑色色素，生长速度较快；该菌株筛选自哈尔滨太阳岛±壤样 品，对极端环境有较好的耐受性，包括营养耐受性，抑耐受性，化Cl耐受性；适用于耐碱、耐 盐木聚糖酶应用。
[0009] 所述的一种链霉菌株，所述该菌株所产木聚糖酶酶学性质如下：最适温度为 7〇°C，最适抑为6.0,最适底物为山毛棒木聚糖；6(TC水浴中赔育60min，酶活力残留75% W上；5(TC，抑5-9缓冲液中赔育30min，酶活力残留80% W上；当化Cl终浓度为Imol/L 时，木聚糖酶酶活维持在86. 6% ;当化Cl终浓度为2M时，残留酶活70. 4% ;当化Cl终浓度为 5mol/L时，残留酶活46. 8〇/〇。
[0010] 一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，所述方法包括；将来源于哈尔滨精 细化工厂±壤样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖平板上，3(TC培养5-6天，挑 取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮，使菌株纯化， 筛选到该分泌木聚糖酶的菌株，本菌株在Bennett平板上3(TC下培养7天，菌落呈圆形，直 径约为3-4畑1，基底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色抱子，释放大量黑色色素。
[0011] 所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，所述提取链霉菌226541基 因组DNA，及其ieSrDNA的获得： 提取链霉菌226541基因组DNA : 1) 将菌株226541接种于50mL的TSB液体培养基中，在30°C下转速17化pm培养72小 时，此时正处于对数生长期。收集发酵液1血，80(K)r/min离也5min后弃上清液，洗涂液清 洗菌体，离也后重复一次清洗； 2) 向洗涂后的菌体中加入100 U L裂解液，息浮菌体，IOOC煮沸15min后冷却至室 温； 3) 加入65C预热好的抽提液0. 5mL，轻微震荡； 4) 加等体积Tris饱和酷/氯仿溶液，强烈震荡Imin, lOOOOr/min离也5min，小也吸取 上清液，转移至干净的离也管； 5) 向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-2(TC静置2小时； 6) 12000;r/min离也5min，70%的己醇洗涂一次，lOOOOr/min离也5min,开口挥发至无 醇味，干燥后溶于20 y LTE缓冲液中，串幌粗DNA ; ieSrDNA序列的获得，ieSrDNA PCR引物如下： Pl ;5' 一 ATTCGGCACACAGAAAC - 3' ； P2 ;5' 一 AGAGGAGAACCGIAGAC - 3'。
[0012] 所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，所述方法包括；冰城链霉菌 226541在木聚糖酶产酶培养基中进行液体发酵，生产木聚糖酶； 首先，划线接种菌株226541于Bennett固体培养基上，在3(TC下培养3-5天，待抱子 生长良好时，用1000 U L的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于3(TC下转速 170rpm培养4她，进行种子培养，吸取培养好的种子培养基，W 5%的接种量接入50mL木聚 糖酶产酶培养基中，在转速为17化pm,温度为3(TC条件下培养，菌株226541液体发酵生产 木聚糖酶结果，发酵7天后木聚糖酶产量达到最高，酶活约为68. 9 U/mL。
[0013] 本发明提供一种性质优良，适应多种工业极端环境，例如高温、高酸碱、高盐等 新的木聚糖酶。本发明人从哈尔滨化工厂样品中筛选到一种天然菌株，它所生产的木聚 糖酶适合于在造纸、饲料、食品、酿酒W及能源工业中使用。经ISSrDNA序列测定，其与 Str巧tomyces SP. A4R2 (S34)具有较高的相似性巧9. 52%)，因此确定该菌株为冰城链霉 菌。该菌株于2005年12月9日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中也(北 京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为；CGMCC No. 1734。
[0014] 本发明菌株226541在Bennett固体培养基上生长时，菌落为圆形，致密，经过2-3 天菌落表面生长出白灰色抱子，基底为墨绿色，产生黑色色素，生长速度较快。该菌株具有 较好的寡营养性、抑耐受性和化Cl耐受性，在抑11的极端碱性条件下，菌株依然生长良好； 在l%NaCl条件下，生长状况最佳。本发明菌株可在W木聚糖为唯一碳源的培养基中生长， 所产生的发酵液具有降解木聚糖的能力。发酵7天时发酵酶活最高，可达68. 9 U/ml。
[0015] 本发明菌株226541所生产的木聚糖酶同时具有较好的抑稳定性、化Cl耐受性和 热稳定性等特性。本发明筛选到的冰城链霉菌226541所生产的木聚糖酶，其最适抑值为 6.0,在抑5-9的范围内维持80% W上的酶活性；最适温度为7(TC，在45C下处理60min， 酶活性维持在88% W上；在6(TC下处理60min，酶活性维持在在75% W上；本发明中的木聚 糖酶最适底物为山毛棒木聚糖，无纤维素酶活性；该木聚糖酶具有很好的化Cl耐受性，当 化Cl终浓度为Imol/L时，木聚糖酶酶活维持在86. 6% ;当化Cl终浓度为2M时，残留酶活 70. 4% ;当化Cl终浓度为5mol/L时，残留酶活46. 8〇/〇。
[0016] 本发明中菌株226541所生产的木聚糖酶可降解多种农业废弃物，对菊芋枯杆的 降解效果最佳。此外，对海洋来源的海带纤维也具有较好的降解性能，表明该木聚糖酶在海 洋副产品加工生产方面有应用价值。
[0017] 本发明的木聚糖酶在抑为9时，残留酶活为最大酶活性的83. 3%，表现了较好的耐 碱性，且在6(TC下保持较高的酶活力，能够满足造纸中的生物漂白工艺，一定程度上水解纸 浆中的半纤维素，使纸张成色、硬度、质量有所提高。更重要的是，代替或部分降低了氯化物 的使用量，减少对环境的污染。本发明中木聚糖酶还可应用于酿酒工业，降低物料粘度，提 高淀粉的利用率，增加酒精的产率。本发明中的木聚糖酶在能源工业中也显示出巨大的应 用潜力，该酶在45°C下可长时间维持较高酶活，与目前同步糖化工艺温度一致，且可降解农 业废弃物中的半纤维素为单糖，供下游工艺发酵利用，产生清洁可再生能源。
[001引说明书附图 图1，本发明菌株226541寡营养耐受性结果； 图2,本发明菌株226541抑耐受性结果； 图3,本发明菌株22654WaCl耐受性结果； 图4,本发明菌株226541液体发酵生产木聚糖酶结果； 图5,本发明菌株226541木聚糖酶最适温度结果； 图6,本发明菌株226541木聚糖酶热稳定性结果； 图7,本发明菌株226541木聚糖酶最适抑结果； 图8,本发明菌株226541木聚糖酶抑稳定性结果； 图9,本发明菌株226541木聚糖酶NaCl耐受性结果。
【具体实施方式】
[0019] 实验材料和试剂： 1.菌株：菌株226541由本发明人从哈尔滨精细化工厂±壤样品中分离获得。
[0020] 2.生化试剂： 木聚糖；山毛棒木聚糖、禅木木聚糖、燕麦木聚糖(美国SIGMA公司）； 海带纤维购自（陕西慈缘生物技术有限公司） 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（Solarbio公司）； 测序由大连宝生物工程有限公司完成； TaKaRa r化q (大连宝生物工程有限公司）； IOxPCR Buffer (大连宝生物工程有限公司）； dNTP Mix化re (大连宝生物工程有限公司）。
[002。 提取菌株基因组DNA试剂： 洗涂液；50mmol/LTris，25mmol/L 邸TA, 0. 1%PVP, pH=8. 0。
[0022] 裂解液：50mmol/L Tris, 25mmol/L EDTA, I. 2%PVP, 3%SDS。
[0023] 抽取液：10mmol/L Tris, Immol/L 邸TA, 0. 3mmol/L NaAC, pH=8. 0。
[0024] 提取液；苯酷；氯仿；异戊醇=25:24:1。
[00巧]TE 缓冲液：50mmol/L Tris, pH=8. 0。
[002引 DNS试剂配方： 甲液；溶解6. 9g结晶酷于15. 2血10%的NaOH中，用蒸觸水稀释至69血，再加入6. 9g NaHS03； 己液；称取255g酒石酸钟轴，加入至300血10%化OH中，再向其中加入880 mLl%3, 5-二硝基水杨酸溶液； 将甲己两液相混即得到黄色DNS试剂，胆存于踪色试剂瓶中。在常温下，放置7-10天 后使用，半年内有效。
[0027] 3.抬养基 Bennett固体培养基；葡萄糖lOg，蛋白腺2g，酵母粉Ig,牛肉膏Ig,琼脂20g, pH7. 0。
[002引木聚糖固体培养基；山毛棒木聚糖lOg，NH4NO3 4g，馬册04 ? 3&0 Ig，MgS04 ?%0 0. 5g，化Cl 0. 3g，琼脂 20g，P册.5-7. 0。
[0029] 富集培养基；（NH4)2S04 Sg, KH2PO4 Ig，M拆〇4.7&0 0. Sg, FeS〇4.7H2〇 0. Olg， CaCls 0. 2g，山毛棒木聚糖lOg，抑7. 0。
[0030] TSB液体培养基；膜蛋白腺17g，大豆蛋白腺3. Og,葡萄糖2. 5g，吃册〇4 ?抓2〇 2. 5g，NaCl 5g，地 7. 0。
[00引]木聚糖酶产酶培养基；馬册〇4 ? 3&0 1. Ilg, KH2PO4 3. 65g，（畑4)2側3 3g， M拆〇4'7&0 2. 2g，CaCl2 0. 3g，葡萄糖1.5g，蛋白腺2. 5g，牛肉膏3g，山毛棒木聚糖lOg，抑 6. 5。
[0032] 说明：W下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆实验 指南》（第H版）J.萨姆布鲁克一书所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进 行。
[0033] 实施例1 ;本发明菌株的获得。
[0034] 将来源于哈尔滨精细化工厂±壤样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖 平板上，3(TC培养5-6天，挑取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线 分离过程3轮，使菌株纯化。通过此方法筛选到该分泌木聚糖酶的菌株。
[00巧]本发明菌株在Bennett平板上3(TC下培养7天，菌落呈圆形，直径约为3-4畑1，基 底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色抱子，释放大量黑色色素。其最适pH为7. 0-9. 0,最 适温度为3(TC。该冰城链霉菌226541，于2005年12月9日保存于中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中也(北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，100101)，其保 藏号为；CGMCC No. 1734。
[0036] 实施例2 ;提取链霉菌226541基因组DNA，W及其ieSrDNA的获得。
[0037] 提取链霉菌226541基因组DNA : 1)将菌株226541接种于50mL的TSB液体培养基中，在30°C下转速17化pm培养72小 时，此时正处于对数生长期。收集发酵液1血，80(K)r/min离也5min后弃上清液，洗涂液清 洗菌体，离也后重复一次清洗。
[003引 2)向洗涂后的菌体中加入100 y L裂解液，息浮菌体，IOOC煮沸15min后冷却至 室温。
[003引如加入65C预热好的抽提液0. 5mL，轻微震荡。
[0040] 4)加等体积Tris饱和酷/氯仿溶液，强烈震荡Imin, lOOOOr/min离也5min，小也 吸取上清液，转移至干净的离也管。
[0041] 5)向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-2(TC静置2小时。
[0042] 6) 12000;r/min 离也 5min, 70% 的己醇洗涂一次，lOOOOr/min 离也 5min,开 口挥发 至无醇味，干燥后溶于20 y LTE缓冲液中，制得粗DNA。
[0043] ieSrDNA序列的获得： ieSrDNA PCR引物如下： Pl ;5' 一 ATTCGGCACACAGAAAC - 3' P2 ;5' 一 AGAGGAGAACCGIAGAC - 3' PCR反应条件如表I所示： 表1 PCR反应条件
【权利要求】
1. 一种链霉菌株，其特征在于，所述菌株为链霉菌菌属中的冰城链霉菌 办编号226541,2012年12月9日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保 藏号为CGMCC No. 1734 ;该菌株属于放线菌门，放线菌目，链霉菌属；菌落在Bennett培养基 平板，30°C生长时开始时为白色，致密，圆形，向四周扩展，2-3天后从菌落表面产生白灰色 孢子，基底为墨绿色，并产生黑色色素，生长速度较快；该菌株筛选自哈尔滨太阳岛土壤样 品，对极端环境有较好的耐受性，包括营养耐受性，pH耐受性，NaCl耐受性；适用于耐碱、耐 盐木聚糖酶应用。
2. 根据权利要求1所述的一种链霉菌株，其特征在于，所述该菌株所产木聚糖酶酶学 性质如下：最适温度为70°C，最适pH为6. 0,最适底物为山毛榉木聚糖；60°C水浴中孵育 60min，酶活力残留75%以上；50°C，pH 5-9缓冲液中孵育30min，酶活力残留80%以上；当 NaCl终浓度为lmol/L时，木聚糖酶酶活维持在86. 6% ;当NaCl终浓度为2M时，残留酶活 70. 4% ;当NaCl终浓度为5mol/L时，残留酶活46. 8%。
3. -种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，其特征在于，所述方法包括：将来源 于哈尔滨精细化工厂土壤样品经富集培养后，按常规稀释后涂布于木聚糖平板上，30°C培 养5-6天，挑取产生透明圈菌落在木聚糖固体培养基上划线分离，重复划线分离过程3轮， 使菌株纯化，筛选到该分泌木聚糖酶的菌株，本菌株在Bennett平板上30°C下培养7天，菌 落呈圆形，直径约为3-4cm，基底为墨绿色，菌落表面突起，产生白灰色孢子，释放大量黑色 色素。
4. 根据权利要求3所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，其特征在于， 所述提取链霉菌226541基因组DNA，及其16SrDNA的获得： 提取链霉菌226541基因组DNA : 1) 将菌株226541接种于50mL的TSB液体培养基中，在30°C下转速170rpm培养72小 时，此时正处于对数生长期；收集发酵液lmL，8000r/min离心5min后弃上清液，洗涤液清洗 菌体，离心后重复一次清洗； 2) 向洗涤后的菌体中加入lOOuL裂解液，悬浮菌体，KKTC煮沸15min后冷却至室 温； 3) 加入65°C预热好的抽提液0. 5mL，轻微震荡； 4) 加等体积Tris饱和酚/氯仿溶液，强烈震荡lmin，10000r/min离心5min，小心吸取 上清液，转移至干净的离心管； 5) 向上清液中加入等体积的异丙醇，轻轻倒转混合两次，-20°C静置2小时； 6) 12000r/min离心5min，70%的乙醇洗漆一次，10000r/min离心5min，开口挥发至无 醇味，干燥后溶于20 y LTE缓冲液中，制得粗DNA ; 16SrDNA序列的获得，16SrDNA PCR引物如下： P1 :5, 一 ATTCGGCACACAGAAAC - 3,； P2 :5, 一 AGAGGAGAACCGIAGAC - 3,。
5. 根据权利要求3所述的一种链霉菌株制备耐碱耐盐木聚糖酶的方法，其特征在于， 所述方法包括：冰城链霉菌226541在木聚糖酶产酶培养基中进行液体发酵，生产木聚糖 酶； 首先，划线接种菌株226541于Bennett固体培养基上，在30°C下培养3-5天，待孢子 生长良好时，用1000 y L的枪头尾圆端取4块菌落接种于TSB液体培养基中，于30°C下转速 170rpm培养48h，进行种子培养，吸取培养好的种子培养基，以5%的接种量接入50mL木聚 糖酶产酶培养基中，在转速为170rpm，温度为30°C条件下培养，菌株226541液体发酵生产 木聚糖酶结果，发酵7天后木聚糖酶产量达到最高，酶活约为68. 9 U/mL。
【文档编号】C12N9/42GK104357364SQ201410659151
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月19日 优先权日:2014年11月19日
【发明者】郭锁莲, 赵鹏飞, 高爱丽, 向文胜, 张万忠 申请人:沈阳化工大学