专利名称：测定烟草中咖啡酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及烟草的种植与栽培，具体来说，涉及测定烟草中咖啡酸含量的方法。
背景技术：
咖啡酸，又名3，4- 二羟基肉桂酸或3，4- 二羟基苯丙烯酸(3，4-dihydroxy-cinnamic acid),黄色结晶,是烟草中苯丙烧代谢途径的中间产物,也是木质素合成途径代谢产物，主要以葡萄糖苷和酯的形式存在，是烟草中的酚类物质。烟草酚类化合物是产生烟草香气的重要成分之一，不仅直接影响烟叶颜色，对烟气质量 和香吃味也有间接影响，其降解产物还可以改善烟草制品的吸味，是衡量烟叶品质的重要指标。因此，测定烟草中的咖啡酸含量对于判断烟叶的质量和风格特征有着重要的意义。经过检索，中国专利数据库中未发现关于烟草中咖啡酸测定方法的专利，而现有的技术文献也鲜有相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供测定烟草中咖啡酸含量的方法，以为探明烟叶特色形成提供一些理论支持。本发明提供的测定烟草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色谱法测定烟草中咖啡酸含量，包括以下步骤
第一步制备咖啡酸标准品
准确称取咖啡酸标准品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用；
第二步制备供试样品溶液
(1)制备鲜烟叶样品液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉，备用；
(2)制备烤后烟叶样品烤后烟叶粉碎过40目筛，备用；
(3)提取咖啡酸取鲜烟叶粉末0.6g或干烟叶粉末0. 05g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入4mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0. 22 m的滤膜后进样；
第三步测定咖啡酸含量
分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量。上述咖啡酸标准品购自Sigma公司，纯度彡98% ;上述乙腈、乙酸为天地公司生产的色谱纯试剂，氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠、乙醚、乙酸乙酯为国产分析纯。上述检测烟叶色谱的色谱条件是色谱柱用Waters C18 0DS2色谱柱(4. 6mmX 250mm, 5 u m);流动相A为水，B为乙腈，C为10%乙酸水溶液，梯度洗脱，柱温35°C，流速I. OmL. mirT1，检测波长310nm,进样量2 y L。上述梯度洗脱条件如下
权利要求
1.测定烟叶中P-香豆酸咖啡酸含量的方法，其特征是采用超高效液相色谱法测定烟叶中咖啡酸含量，包括以下步骤 第一步制备咖啡酸标准品 准确称取咖啡酸标准品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用； 第二步制备供试样品溶液 (1)制备鲜烟叶样品液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重即无水分时，再将其研磨成粉，备用； (2)制备烤后烟叶样品烤后烟叶粉碎过40目筛，备用； (3)提取咖啡酸取鲜烟叶粉末0.6g或干烤后烟叶粉末0. 05g，精密称定，加入30mL的4mol/L的NaOH在摇床上震摇4h，抽滤后加入64mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL乙酸乙酯萃取3次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0. 22 m的滤膜后进样； 第三步测定咖啡酸含量 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量； 包括 (1)制备P-香豆酸标准品 准确称取p-香豆酸标准品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用； (2)制备供试样品溶液 (1)鲜烟叶样品制备液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉备用； (2)烤后烟叶样品制备烤后烟叶粉碎过40目筛备用； (3)取烟叶粉末0.6g，精密称定，加入30mL的3mol/L的NaOH搅拌提取4h，抽滤后加入3mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用2OmL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(v: v)萃取5次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0. 22 y m的滤膜后进样； 取事先干燥、粉碎的烟叶粉末0. 5g，精密称定，加入30mL的80%的甲醇超声萃取lh，然后离心取上清液浓缩至5mL，过0. 22 y m有机滤膜后进样； (3)含量测定 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出P-香豆酸含量。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述P-香豆酸咖啡酸标准品的纯度≥989%。
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述检测烟叶色谱的色谱条件是色谱柱用Waters C18 0DS2色谱柱,柱的大小为4. 6mmX 250mm, 5 u m ;流动相A为水，B为乙腈,梯度洗脱，柱温35 0C，流速I. OmL. min-1，检测波长310nm,进样量2uL； 色谱柱用Waters C18 0DS2色谱柱(4. 6_X 250mm, 5 y m);流动相为A (含2. 5%乙酸的水)-B (乙腈)，梯度洗脱，柱温35 0C，流速I. OmL. min_l，检测波长310nm,进样量2uL0
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述梯度洗脱条件如下
全文摘要
本发明公开了测定烟草中咖啡酸含量的方法，是采用超高效液相色谱法测定烟草中咖啡酸含量，该方法是第一步，制备咖啡酸标准品，准确称取咖啡酸标准品，用乙腈定容，制成标准品溶液；第二步，制备供试样品溶液，包括(1)制备鲜烟叶样品，(2)制备烤后烟叶样品，烟叶粉碎过40目筛，(3)提取咖啡酸；最后测定咖啡酸含量分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出咖啡酸含量。本发明的方法具有操作简便、灵敏度高、准确性强、重复性好、测定快速等诸多优点，适用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中咖啡酸含量的测定。
文档编号G01N30/02GK102749399SQ201210257078
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者丁福章, 任竹, 张捷, 潘文杰, 罗宝昌, 赵会纳, 雷波 申请人:贵州省烟草科学研究所