专利名称：测定烟草中p-香豆酸含量的方法
技术领域：
本发明涉及烟草的种植与栽培，具体来说，涉及测定烟草中P-香豆酸含量的方法。
背景技术：
p_香豆酸,又称对轻基肉桂酸，即3-(4-轻基苯基)-2丙烯酸(口-办￡//'<0^<^/7/7<3 /<^acid-,p-Coumaric acid),是植物次生代谢物质，多以束缚形式存在，一般以酯键、醚键和其他化合物连接在一起，它与对逆境的抗性以及作物的特色形成等生理活动有着密切的关系。烟草中P-香豆酸是苯丙烷代谢途径的中间产物，也是木质素合成途径代谢产物。因此，测定烟草中的P-香豆酸含量对于判断烟草的质量和风格特征有着重要的意义。经过检索，中国专利数据库中未发现关于烟草中P-香豆酸测定方法的专利，而现有的技术文献也没有相关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供测定烟草中P-香豆酸含量的方法，以为探明烟叶特色形成提供一些理论支持。本发明提供的测定烟草中P-香豆酸含量的方法包括以下步骤:
第一步制备P-香豆酸标准品
准确称取P-香豆酸标准品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用；
第二步制备供试样品溶液
(O鲜烟叶样品制备:液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉，备用；
(2)烤后烟叶样品制备:烤后烟叶粉碎过40目筛备用。(3)提取P-香豆酸:取烟叶粉末0.6g，精密称定，加入30mL的3mol/L的NaOH搅拌提取4h，抽滤后加入3mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(体积比)萃取5次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22 μ m的滤膜后进样；
第三步测定P-香豆酸含量
分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出P-香豆酸含量。上述P-香豆酸标准品购自Sigma公司，纯度彡98% ;上述乙腈为天地公司生产的色谱纯试剂，乙酸为Fisher公司生产的色谱纯试剂，氢氧化钠、盐酸、无水硫酸钠、乙醚、乙酸乙酯为国产分析纯。上述检测烟叶色谱的色谱条件是:色谱柱用Waters C18 0DS2色谱柱(4.6mmX250mm，5μπι);流动相为A (含2.5%乙酸的水)-B (乙腈)，梯度洗脱，柱温35°C，流速1.0mL.mirT1，检测波长310nm,进样量2 μ L。上述各步骤所用的仪器设备是:Waters ACQUITY UPLC超高效液相色谱仪，Waters2996 二极阵列管检测器(DAD)检测，Empower色谱工作站,万分之一电子天平,旋转蒸发仪，真空泵、磁力搅拌器等。本发明的测定烟草中P-香豆酸含量的方法具有灵敏度高、准确性强、重复性好、使用有机试剂少等诸多优点，可用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中P-香豆酸含量的测定。
图1为标准品与烟叶样品HPLC 图2为标准品标准曲线 图3为标准品色谱图。
具体实施例方式通过以下具体实施例对本发明进一步说明，但不作为对本发明的限制。实施例1测定方法实施例
首先进行标准品溶液的制备:准确称取P-香豆酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸I mL用乙臆定各至IOmL制成标准品溶液,备用；
接着制备供试样品溶液:
(1)制备鲜烟叶样品:液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重(无水分)，再将其研磨成粉，备用；
(2)烤后烟叶样品制备:烤后烟叶粉碎过40目筛，备用；
(3)提取P-香豆酸:取烟叶粉末0.6g，精密称定，加入30mL的3mol/L的NaOH搅拌提取4h，抽滤后加入3mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(V: V)萃取5次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22μ m的滤膜后进样；
最后进行P-香豆酸含量的测定:分别取标准品溶液配成浓度分别为0.5、1、2、3、5、10、20,30,50 μ m/mL的溶液取2 μ L注入超高效液相色谱仪，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出P-香豆酸含量；
其中，所述色谱条件为:色谱柱Waters C18色谱柱(4.6_X 250mm, 5 μ m);流动相A(含
2.5%乙酸的水)-B (乙腈)，柱温350C，流速1.0mL.min—1，检测波长310nm,进样量2 μ L。梯度条件:0-40min5%B — 30%B ;40_50min 30%B — 5%B。实施例2线性关系考察
分别取上述标准品溶液0.5、1、2、3、5、10、20、30、50 μ L，按实施例1中色谱条件测定，记录色谱图及峰面积。以各标准品的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标计算，得出P-香豆酸的回归方程为 y=l.48 X IO4X-L 45X 103，R2=0.9993，线性范围为 0.647 52.230μ g/mL。精密度试验:精密吸取供试样品溶液按上述色谱条件连续进样10次，进样量2 μ L，记录色谱图，测得P-香豆酸峰面积的RSD为0.16%，结果表明仪器精密度良好。重复性试验:取同一批样品，按供试品制备方法平行6次样品，连续进样，进样量2 μ L，记录色谱图，计算P-香豆酸含量的的RSD为4.76%，结果表明该实验重复性良好。稳定性试验:取同一份供试样品溶液，在0，4，12，24h进样，在上述色谱条件下测定，P-香豆酸峰面积的RSD为0.31%,结果表明样品在24h内稳定性良好。加标回收试验:称取已知量的烟草样品0.3g，精密称定，加入30mL的3mol/L的NaOH搅拌提取4h，抽滤后加入3moI/L的HCl调节pH至2，分别加入对照品，加入的对照品分另Ij为样品中P-香豆酸含量的0.8、1.0和1.2倍)，然后分别用20mL的1:1的乙醚/乙酸乙酯(体积比)萃取5次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22 μ m的滤膜后，在上述色谱条件下测定，计算回收率，结果P-香豆酸平均回收率为99.2%。实施例3 检测波长的选择
在对供试样品溶液进行色谱条件摸索时，在19(T400nm进行全波长扫描，其中在233和324nm处有最大吸收,但是在320nm处基线噪音影响较大,其中在310nm处分离度可以到达到指纹图谱要求的标准，因此选310nm为最大检测波长。实施例4流动相选择
本试验比较了乙腈-水、乙腈-0.05%乙酸水溶液和乙腈-2.5%乙酸水溶液3中不同的梯度洗脱溶剂系统，以乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脱溶剂系统所得图谱的峰形较好、分离度大，所以选用乙腈-2.5%乙酸水溶液梯度洗脱溶剂系统为本试验的流动相系统。
权利要求
1.测定烟草中P-香豆酸含量的方法，其特征包括: 第一步制备P-香豆酸标准品 准确称取P-香豆酸标准品IOmg,用乙腈定容至IOmL,然后吸I mL用乙腈定容至IOmL制成标准品溶液，备用； 第二步制备供试样品溶液 (1)制备鲜烟叶样品:液氮取样，然后将鲜烟样放入冷冻干燥仪中冷冻干燥直至恒重即无水分时，再将其研磨成粉，备用； (2)制备烤后烟叶样品:烤后烟叶粉碎过40目筛备用； (3)提取P-香豆酸:取烟叶粉末0.6g，精密称定，加入30mL的3mol/L的NaOH搅拌提取4h，抽滤后加入3mol/L的HCl调节pH至2，然后分别用20mL体积比为1:1的乙醚/乙酸乙酯萃取5次，合并有机相并用旋转蒸发仪蒸干，然后用流动相定容后过0.22 μ m的滤膜后进样； 第三步测定P-香豆酸含量 分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出P-香豆酸含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述P-香豆酸标准品的纯度>99%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述检测烟叶色谱的色谱条件是:色谱柱用Waters C18 0DS2色谱柱，规格为4.6mmX 250mm, 5 μ m ;流动相A为含2.5%乙酸的水-B为乙腈，梯度洗脱，柱温35°C，流速1.0mL.min—1，检测波长310nm，进样量2 μ L。
全文摘要
本发明公开了测定烟叶中p-香豆酸含量的方法，该方法包括第一步，制备p-香豆酸标准品准确称取p-香豆酸标准品10mg，用乙腈定容至10mL，然后吸1mL用乙腈定容至10mL制成标准品溶液，备用；第二步，制备供试样品溶液，包括制备鲜烟叶样品、制备烤后烟叶样品和提取p-香豆酸；第三步，测定p-香豆酸含量分别取不同浓度的标准品溶液注入超高效液相色谱仪，检测烟叶色谱，根据色谱图中峰面积计算出标准曲线，然后计算出p-香豆酸含量。本发明的方法具有操作简便、灵敏度高、准确性强、重复性好、测定快速等诸多优点，适用于烟草鲜烟叶和烤后烟叶中p-香豆酸含量的测定。
文档编号G01N30/02GK103149281SQ20121025638
公开日2013年6月12日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者赵会纳, 雷波, 张捷, 任竹, 丁福章, 罗宝昌 申请人:贵州省烟草科学研究所