序结果分析
[0098] 采用本发明的上述步骤5中的唯一标签-纠错信息分析与常规信息分析统计结果 进行对比，见表1。其中不同种类的RNA分子所占比例统计结果，如表2、表3所示。
[0099] 表1唯一标签-纠错信息分析与常规信息分析统计结果对比
[0100]
[0101] 注：总测序测序序列：总的原始下机测序量；有效比对测序序列数：有效高可信比 对测序序列，常规分析对于低copy簇进行过滤处理。
[0102] 在已知miRNA以及未知miRNA统计中，本发明的唯一标签-纠错信息分析比常规 信息分析分别多检出89种和76种。而且6个不同丰度的已知miRNA与QPCR定量的比较 显示：高丰度时，常规纠错方法与唯一标签-纠错均与QPCR定量结果一致性好，低丰度时， 只有唯一标签-纠错信息分析继续与QPCR结果显示较好的一致性。
[0103] 表2两种信息分析方法的结果比较
[0104]
[0105] 表3两种信息分析方法分析不同种类RNA分子所占比例的统计结果
[0106]
[0107] 以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进 行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方 案做出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
【主权项】
1. 一种外泌体miRNA的定量检测方法，包括以下步骤： (1) 外泌体总RNA的提取； (2) 3'端和5'端特异性唯一标签接头连接； (3) 反转录合成cDNA并进行PCR扩增； (4) miRNA文库的筛选纯化与上机测序； (5) 纠错算法的信息分析。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)所述的特异性唯一标签接头连接 是指在常规miRNA接头的基础上添加了 8个随机的碱基N以及3个固定碱基CGA。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（2)在RNA的3'端连接特异性唯一 标签接头的序列为：CGANNNNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUCAC ;在 5' 端连接特异 性唯一标签接头的序列为：UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2)特异性唯一标签接头连接完成 后，去除溶液中的连接缓冲液、多余的盐离子及其他杂质，得到与5'端和3'端连接唯一标 签接头的RNA。5. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3)是将5'端和3'端连接唯一标签 接头的RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，加入测序引物进行PCR ;反转录引物序列 为 GTGACTGGAGTTCAGACGTGT。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR所用的测序引物序列为： 上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ; 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGITCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CT ； 其中xxxxxxxx为index标签。7. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤⑷miRNA文库的筛选的方法是将步 骤（3)中的PCR产物中片段大小为150-170bp的cDNA片段回收，即得到主要成分为miRNA 的文库。8. 根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，步骤（5)纠错算法的信息分析包括 以下步骤： 1) 基于固定喊基CGA确定唯一标签位置，将成对测序序列的测序序列一和测序序列^. 的唯一标签碱基序列首尾相连，形成16bp的一条索引，并且以这16bp作为成对测序序列的 索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的； 2) 对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉明距 离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉 明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的； 3) 对于每个DNA模板的dup簇中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种 碱基型在测序序列中的一致率达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记 为N，得到代表原始DNA模板序列的新测序序列； 4) 基于新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列； 5) 根据4)中得到的测序序列进行数据库比对确定已知RNA以及进行未知RNA的软件 预测，同时也进行相应的注释与统计定量； 6)根据5)的结果进行表达谱差异、革El基因预测、Passway以及Biomarker其他相关分 析。9. 一种miRNA定量检测系统，包括以下操作单元： (1) 总RNA的提取单元； (2) 3'端和5'端特异性唯一标签接头连接单元； (3) 反转录合成cDNA并进行PCR扩增单元； (4) miRNA文库的筛选纯化与上机测序单元； (5) 纠错算法的信息分析单元。10. 如权利要求9所述的miRNA定量检测系统，其特征在于，所述总RNA为外泌体总 RNA011. 如权利要求9所述的miRNA定量检测系统，其特征在于，所述单元⑵在RNA的 3 ' 端连接特异性唯一标签接头的序列为：CGANNNNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCAGUC AC ;在5'端连接特异性唯一标签接头的序列为：UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA。12. 如权利要求9所述的miRNA定量检测系统，其特征在于，单元（3)中是将5'端和3' 端连接唯一标签接头的RNA反转录合成cDNA，然后以cDNA为模板，加入测序引物进行PCR ; 反转录引物序列为GTGACTGGAGTTCAGACGTGT ;PCR所用的测序引物序列为： 上游引物：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ; 下游引物：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGITCAGACGTGTGCTCTTCCGAT CT ； 其中xxxxxxxx为index标签。13. 如权利要求9所述的miRNA定量检测系统，其特征在于， 单元（4)miRNA文库的筛选的方法是将单元（3)中的PCR产物中片段大小为150-170bp 的cDNA片段回收，即得到主要成分为miRNA的文库。14. 如权利要求9-13任一所述的miRNA定量检测系统，其特征在于，单元（5)纠错算法 的信息分析包括以下步骤： 1) 基于固定喊基CGA确定唯一标签位置，将成对测序序列的测序序列一和测序序列^. 的唯一标签碱基序列首尾相连，形成16bp的一条索引，并且以这16bp作为成对测序序列的 索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的； 2) 对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的汉明距 离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉 明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的； 3) 对于每个DNA模板的dup簇中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若某种 碱基型在测序序列中的一致率达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记 为N，得到代表原始DNA模板序列的新测序序列； 4) 基于新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列； 5) 根据4)中得到的测序序列进行数据库比对确定已知RNA以及进行未知RNA的软件 预测，同时也进行相应的注释与统计定量； 6) 根据5)的结果进行表达谱差异、革El基因预测、Passway以及Biomarker其他相关分 析。15. 权利要求1-8任一所述的方法或权利要求9-14任一所述的定量检测系统在小RNA 定量检测中的应用。16. 权利要求1-8任一所述的方法或权利要求9-14任一所述的定量检测系统在制备疾 病早期筛查试剂盒中的应用。17. 如权利要求16所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肿瘤、神经退行性疾病、心 血管系统疾病、生殖系统疾病。
【专利摘要】本发明提供了一种外泌体miRNA的定量检测方法，包括外泌体总RNA提取、3’端和5’端特异性唯一标签接头连接、反转录合成cDNA并进行PCR扩增、miRNA文库的筛选纯化与上机测序、纠错算法的信息分析等步骤。本发明方法基于特异性的唯一标签接头的标记，对每个原始模板进行区分，避免了扩增时分子间存在的偏好性，可以精确检测低于10拷贝以下的miRNA分子，且特异性高，可用于肿瘤源性的外泌体miRNA的检测，神经退行性疾病、心血管疾病，生育健康等领域的检测，可为疾病的早期筛查提供依据，还可应用于其他小RNA精准定量检测领域。具有广阔的应用前景和市场价值。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105063209
【申请号】CN201510488030
【发明人】赵美茹, 吕小星, 易鑫, 管彦芳, 刘涛, 杨玲
【申请人】北京吉因加科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月10日