0 %，则 记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，得到代表原始DNA模板序列的新测序序 列；
[0049] 4)基于新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序 列；
[0050] 5)根据4)中得到的测序序列进行数据库比对确定已知RNA以及进行未知RNA的 软件预测，同时也进行相应的注释与统计定量；
[0051] 6)根据5)的结果进行表达谱差异、革巴基因预测、Passway以及Biomarker其他相 关分析。
[0052] 上述步骤2)所述的汉明距离值不超过3是本发明信息分析的一个关键点，因为 miRNA平均大小只有20_30bp，为了尽可能多得区分不同miRNA亚型（亚型间的差异往往只 是几个碱基的区别），需要尽量压缩汉明距离的容忍度，以得到更加全面的miRNA类型。由 此本发明根据成簇的唯一标签类型，确认不同的miRNA亚型，基于每个唯一标签对原始模 板的标记，统计每个亚型的个数。
[0053] 本发明提供了上述定量检测系统在小RNA定量检测中的应用。
[0054] 本发明提供了上述外泌体miRNA定量检测方法或miRNA定量检测系统在制备疾病 早期筛查试剂盒中的应用。
[0055] 优选地，上述制备试剂盒应用中所述的疾病为肿瘤、神经退行性疾病、心血管系统 疾病、生殖系统疾病。
[0056] 本发明继承并发展了高通量miRNA-seq技术，提出了一种全新的高精度的 exosomes miRNA定量检测方法。本发明在RNA的3'端和5'端连接特异性的唯一标签 (unique identifier，UID)接头，对每个原始模板进行区分，不仅避免了扩增时分子间存在 的偏好性，而且有效实现单个模板的精确计数，可以精确检测低于10个拷贝以下的miRNA 分子，从而可以更全面精准的检测所有miRNA的真实表达量以及表达谱。本发明通过唯一 标签形成的Dup簇，基于纠错算法的信息分析可以有效矫正相关测序错误，获得更准确的 分子序列，有利于相关未知RNA，miRNA家族以及Biomaker的发现。
[0057] 本发明的外泌体miRNA定量检测方法及其定量检测系统基于其高灵敏，高特异性 的检测特点，结合肿瘤源性的exosomes内的miRNA，可以结合微创（抽血）或无创（使用尿 液或唾液等）的检测手段为多种相关肿瘤（肺癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、胰腺癌、卵 巢癌、子宫内膜癌、甲状腺癌、宫颈癌、食管癌以及肝癌等）进行早期筛查提供检测手段；另 外还可拓展应用到相关神经退行性疾病、心血管疾病，生育健康等检测领域以及其他相关 small RNA(piRNA，snoRNA，siRNA等）的精准定量检测以及应用领域。
【附图说明】
[0058] 图1为本发明外泌体miRNA定量检测方法的流程图。
【具体实施方式】
[0059] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0060] 若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技 术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。本发明实施例中采用的测序装置为Illumina HiSeq2500,本发明测序步骤中，不限于该测序装置。
[0061] 实施例1外泌体miRNA定量检测方法的建立
[0062] 1、外泌体（exosomes) totalRNA 的提取：
[0063] 1.1抽取受检者外周血2管（5mL/管）于EDTA抗凝管中，轻柔上下颠倒（防止细 胞破裂），6-8次充分混匀，在采血当天4-6小时内进行以下处理；在4°C条件下1600g离心 10分钟，离心后将上清（血浆）分装到多个1. 5mL/2mL离心管中，在吸取过程中不能吸到中 间层白细胞；在4°C条件下16000g离心10分钟，去除残余细胞，将上清（血浆）转移到新 的1. 5mL/2mL离心管中，不能吸到管底白细胞，即得到分离后所需血浆；
[0064] 1. 2血衆样本处理完后，分离得到的全部血衆（约5ml左右）按照exoRNeasy Serum/Plasma Maxi Kit(Qiagen)提取试剂说明书，进行 exosomes 内的 total RNA 的提 取，回溶 14uL RNase-free water，之后基于 Qubit2.0(Invitrogen，Qubit RNA HS Assay Kits)进行初步定量。
[0065] 2、3 '端和5 '端特异性唯一标签接头连接
[0066] 2. 1 3'端特异性唯一标签接头连接：
[0067]
[0068] 将溶液混匀，置于PCR仪上，37 °C连接2h。
[0069] 上述 3' 端唯一标签接头的序列为：CGANNNNNNNNAGAUCGGAAGAGACACGUCUGAACUCCA ⑶CAC(SEQ ID NO. 1)。
[0070] 2. 2 5'端特异性唯一标签接头连接：
[0071]
[0072] 将溶液混匀，置于PCR仪上，20°C孵育过夜。
[0073]上述 5' 端唯一标签接头的序列为：UACACUCUUUCCCUACACGACNNNNNNNNCGA(SEQ ID NO.2)〇
[0074] 之后往反应体系中加入75 y L无水乙醇，-20°C放置10分钟，16000g离心10分钟， 去上清后冷冻干燥后，加入15 yL Rnase Free H20回溶，去除溶液中的连接缓冲液、多余的 盐离子等。
[0075] 3、反转录合成cDNA并进行PCR扩增
[0076] 3. 1反转录合成cDNA的方法为：
[0077]
[0078] 将溶淑混匀，置于PCR仪上，42°C孵育lh逆转录合成cDNA。之后向反转录产物中 加入4yL RNase H混合均匀，37°C孵育30min，以充分消化剩余的RNA。上述反转录体系中 所使用的反转录引物序列为：GTGACTGGAGTTCAGACGTGT(SEQ ID N0. 3)。
[0079] 3. 2PCR扩增PCR反应体系为
[0080]
[0081] 上述引物 Barcode Universal Primer 和 Barcode Primer 1 的序列分别为：
[0082] AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT ；
[0083] CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT ;其 中 xxxxxxxx 为 index 标签。
[0084] PCR反应条件为：
[0085]
[0086] 4、miRNA文库的筛选纯化与上机测序
[0087] 4. 1PCR产物在100V 15% TBE-PAGE胶，进行凝胶电泳分析。
[0088]4. 2 切取预期大小分子（150_170bp)，按照 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)试剂说明书进行产量回收，得到高通量测序miRNA seq文库。
[0089] 4. 3上机测序：采用Illumina HiSeq2500 PE101+8+101程序进行上机测序，测序 实验按照制造商提供的操作说明书（参见Illumina/Solexa官方公布cBot)进行上机测序 操作。
[0090] 5、纠错算法的信息分析：
[0091] 5. 1基于固定碱基CGA确定唯一标签位置，将成对测序序列的测序序列1和测序序 列2的唯一标签碱基序列首尾相连，形成16bp的一条索引，并且以这16bp作为成对测序序 列的索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目的。
[0092] 5. 2对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据插入序列之间的 汉明距离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序 列的汉明距离不超过3,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目 的?
[0093] 5. 3对于每个DNA模板的dup簇中的测序序列的每一个测序碱基进行互相比对，若 某种碱基型在测序序列中的一致率达到80%，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否 则记为N，这样便得到了代表原始DNA模板序列的新测序序列；
[0094] 5. 4基于新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序 列。
[0095] 5. 5根据5. 4中得到的测序序列进行数据库比对（Sanger miRBase ;ncRNA Database ;piRNA Database ;siRNA Database 等）确定已知 RNA 以及进行未知 RNA 的软件 预测，同时也进行相应的注释与统计定量.
[0096] 5. 6基于5. 5的结果进行其他相关分析，如表达谱差异、靶基因预测、Passway以及 Biomarker 等。
[0097] 6、测