菌超纯水对番石榴炭疽病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。使用本发明所述引物CGF/CGR对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，评估该引物对番石榴炭疽病菌基因组DNA检测的灵敏性，扩增反应体系和反应程序如下:PCR反应体系 25 41，包括2.5 μ? 10XPCR buffer(Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP,
1.0U 7?必NA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物CGF /CGR各0.4 Mmol/L,25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性I min、61°C退火45 S、72°C延伸I min，35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0021]巢式PCR扩增
用无菌超纯水对番石榴炭疽病菌基因组DNA进行稀释，配制成10倍数量级的系列浓度备用。以真菌核糖体基因转录间隔区(ITS)通用引物ITSl:5’-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’和ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’为外引物，本发明所述的特异引物CGF/CGR为外引物对番石榴炭疽病菌不同系列浓度的基因组DNA进行巢式PCR扩增，评估本发明所述引物CGF/CGR通过巢式PCR对番石榴炭疽病菌基因组DNA检测的灵敏性，第一轮PCR扩增:以ITS 通用引物 ITSl: 5’ -TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’ 和 ITS4:5’ -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’ 作为第一轮反应引物对不同系列浓度的基因组DNA进行PCR扩增，扩增反应体系和反应程序如下:PCR 反应体系 25 41，包括2.5 μ? 10XPCR buffer (Mg2+ free), 2.0 mmol/L MgCl2,
0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U 7?必NA聚合酶(Takara大连宝生物工程有限公司)，引物TISl /ITS4各0.4 Mmol/L, 25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性I min、55°C退火30 S、72°C延伸I min，35个循环，最后72°C延伸10min。第二轮PCR扩增:待第一轮PCR扩增结果后，取I μ L第一轮PCR产物为模板与引物CGF/CGR组合进行巢式PCR扩增。PCR反应体系25 μ?，包括2.5 μ? 10XPCR buffer (Mg2+free), 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U T^^DNA 聚合酶(Takara 大连宝生物工程有限公司)，引物CGF /CGR各0.4 Mmol/L, 25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足。扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性I min、61°C退火45 S、72°C延伸I min，35个循环，最后72°C延伸10 min。
[0022]常规PCR和巢式PCR灵敏度比较结果表明，当以本发明所述引物CGF /CGR进行常规PCR扩增时，反应灵敏度可以达到1pg DNA 25 μ L 1反应体系(图2中的a)。进一步以ITS基因通用引物ITS1/ITS4进行第一轮扩增得到的PCR产物作为模板，以CGF /CGR作为第二轮扩增引物进行巢式PCR扩增，从电泳图可以看出套式PCR的特异性扩增条带比常规PCR要亮得多，能够使原来看不到条带的的样品(lpg、lOOfg、10fg、lpg/25 μ L反应体系)产生可见条带(图2中的b)，灵敏度达到Ifg DNA 25 μ L1反应体系，比常规PCR要提高10000倍左右。
[0023]实施例3:发病果实中番石榴炭疽病菌的检测
发病果实中番石榴炭疽病菌DNA的提取:采用NaOH快速裂解法提取DNA，具体过程如下:向1.0 mg发病果实中加入0.5 mol/L NaOH 10 μ?，将组织充分磨碎成糊后转入1.5mL 离心管中，12，000 rpm 离心 6 min，取上清液 5 KL 加入 0.1 mol/L Tris-HCl (pH=8.0)495卜1^混合均匀，取1.0 PL作为PCR模板进行扩增。PCR扩增检测:利用本发明所述引物CGF/CGR 进行 PCR 扩增。PCR 反应体系 25 41^，包括2.5 μ? 10XPCR buffer (Mg2+ free)，
2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP, 1.0 U T1a^NA 聚合酶(Takara 大连宝生物工程有限公司)，引物CGF/CGR各0.4 Mmol/L, 25 ng DNA模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为:95 °C预变性5 min, 94 °C变性30 s，61 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，共35个循环，最后72 °C延伸10 min。结果检测:取PCR扩增产物5.0 μ?用1.5%琼脂糖电泳分离，电压为70-100V，电泳结束经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约390bp的产物，即可判断发病植物组织中带有番石榴炭疽病菌。检测结果(图3)表明，番石榴炭疽病发病症状典型的果实及人工接种的番石榴果实中均可检测出番石榴炭疽病菌，而健康植株组织及阴性对照则无特异性条带出现，说明该套技术能用于番石榴果实中番石榴炭疽病菌的快速分子检测。
[0024]以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
【主权项】
1.番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物，其特征在于:引物序列为:上游引物 CGF:5’ - CGGGTAGGGTCTCCGTGA -3’，下游引物 CGR: 5’- CCCAGTGCGAGACGTAAAGT -3’ ； 对番石榴炭疽病菌特异性扩增出390bp的产物。2.一种利用权利要求1所述引物的番石榴炭疽病菌检测方法，其特征在于:包括以下步骤: Cl)从感染番石榴炭疽病菌的植物组织中提取DNA ; (2)以步骤(I)提取的DNA为模板，利用CGF/CGR这一对引物进行PCR扩增，PCR扩增的条件为:PCR反应体系 25 μ?，包括 2.5μ? 1XPCR buffer, 2.0 mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTP，1.0 U TacMk 聚合酶，引物 CGF/CGR 各 0.4 Mmol/L, 25 ng DNA 模板，不足部分用无菌超纯水补足；扩增参数为95 °C预变性5 min，94 °C变性30 s，61 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，共35个循环，最后72 °C延伸10 min ; (3)取5.0 μ?步骤(2)的PCR扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电压为70-100V，40 min后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出390 bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在番石榴炭疽病菌。3.如权利要求1所述的引物在田间番石榴炭疽病的早期诊断和病菌的监测及鉴定上的应用。
【专利摘要】本发明提供番石榴炭疽病菌特异性PCR检测引物及其检测方法，所述引物包括上游引物CGF：5ˊ-？CGGGTAGGGTCTCCGTGA？-3ˊ和下游引物CGR：5ˊ-？CCCAGTGCGAGACGT？AAAGT？-3ˊ，在所述引物的基础上建立番石榴炭疽病菌PCR检测方法，经琼脂糖凝胶电泳，可在番石榴炭疽病菌纯DNA、带番石榴炭疽病菌的发病组织中特异性地扩增出片段大小为390？bp的扩增产物。本发明的检测引物和检测方法检测番石榴炭疽病菌具有准确性高、特异性强、灵敏度高、检测过程操作简便快速的优点，可用于田间番石榴炭疽病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为番石榴炭疽病的防治提供可靠的技术和理论依据。
【IPC分类】C12Q1/04, C12Q1/68, C12R1/645
【公开号】CN105063219
【申请号】CN201510512826
【发明人】兰成忠, 姚婂爱, 余德亿, 阮宏椿, 黄鹏
【申请人】福建省农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月20日