快速鉴定番石榴实蝇的ss-pcr特异性引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，具体涉及快速鉴定番石榴实蝇的SS-PCR特异性引 物及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 番石植实绳隶属双翅目（Diptera)、实绳科（Tephritidae)、寡毛实绳亚科 (Dacinae)、寡毛实绳族（Dacini)、果实绳属（Bactrocera)，目前主要分布在泰国、越南、緬 甸、尼泊尔、印度、巴基斯坦、斯里兰卡、中国的云南、台湾地区等地区。番石榴果实蝇寄主范 围广，危害性大，是果蔬生产中的重要害虫，受到国内外植物检疫的普遍关注。近几年，由于 国际贸易的日渐频繁，合作领域不断拓宽，在进出境的果蔬中经常截获番石榴实蝇等各种 不同的实蝇幼虫、卵或蛹，甚至为头、胸、翅、足等残体；对于幼虫的分类鉴定要比成虫困难 得多，为了保证鉴定的准确性通常是将幼虫在室内饲养为成虫，而这需要花费较长的时间， 严重影响了果蔬进出口贸易的通关速度；而对于残体则是无法对其进行正确的识别鉴定。 因此为了防止检疫性实蝇传入以及扩散，迫切需要开展关于实蝇的快速鉴定识别的技术。
[0003] 近年来，由于分子生物学技术能解决传统的形态学分类方法难以解决的问题 且不受虫态的影响，越来越多的分子生物学技术被运用于昆虫的鉴定中，种特异引物 PCR(Species-specificPCR，SS_PCR)技术，即在设计目标物种的引物时必须充分考虑引物 的特异性，使得在扩增未知模板时能够根据目标片段条带的有无就能把目标种类与其他种 类鉴别开来。本发明提供了一种采用特异性引物快速鉴定番石榴实蝇的方法，能够准确及 时对截获的疑似番石榴实蝇的卵、蛹、幼虫、成虫及残体等进行鉴定，建立了一种快速鉴定 番石榴实蝇的方法。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供快速鉴定番石榴实蝇的SS-PCR特异性引物。
[0005] 本发明的再一目的是提供快速鉴定番石榴实蝇的试剂盒。
[0006] 本发明的再一目的是提供快速鉴定番石榴实蝇的方法。
[0007] 根据本发明的快速鉴定锈实蝇的SS-PCR特异性引物，引物序列为：
[0008] FR447 :3,ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5,；
[0009] FF463-486 :3'CACAACCGTTATTAACATGCG5'。
[0010] 选择桔小实绳B.dorsalis，颜带实绳B.cilifer，锈实绳B.rubigina，瑞丽果实绳 B.ruiliensis，瘤腔实绳B.tuberculata，杨桃实绳B.carambolae，瓜实绳B.cucurbitae， 辣椒实绳B.latifrons，南瓜实绳B.tau，具条实绳B.scutellata，近黑颜实绳B.parater， 黑膝实绳B.scutellaris，滇寡鬃实绳B.modica，何氏华实绳B.hochii，率实绳Carpomya vesuviana，瓜棍腹实绳Dacuslongicornis，腿端黑实绳B.atrifemur，黑颜实绳 B.diaphora，五指山实绳B.wuzhishana作为阴性对照来证明本发明设计的引物的特异性， 大大缩短了锈实蝇的鉴定周期。
[0011] 上述引物对扩增得到的鉴定番石榴实蝇的特异性片段的序列为：番石榴实蝇 Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi),645bp：
[0012] 5 '-CACAACCGTTATTAACATGCGATCGACAGGAATTTCATTTGACCGAATACCTCTATTCGTTTGAGC AGTTGTATTAACAGCTTTATTACTTCTGTTATCACTACCAGTTTTAGCAGGAGCTATCACTATACTATTAACAGATC GAAACTTAAATACTTCCTTTTTTGACCCCGCAGGAGGAGGAGACCCTATTCTCTACCAACACTTATTTTGATTCTTT GGACACCCAGAAGTTTACATTTTAATTTTACCAGGATTCGGAATAATTTCTCATATTATTAGTCAAGAATCAGGAAA GAAGGAAACATTCGGATCTTTAGGAATAATTTATGCTATAATAGCAATTGGTCTCTTAGGATTCATTGTATGAGCTC ATCATATATTTACTGTAGGAATAGATGTAGACACTCGAGCTTATTTCACTTCAGCTACAATAATTATTGCTGTACCC ACAGGTATTAAAATTTTTAGTTGACTAGCCACATTACACGGTACACAATTAAATTACTCCCCAGCCATATTATGAGC CCTAGGGTTTGTATTCCTATTTACAGTAGGAGGATTAACAGGAGTTGTCCTAGCTAATTCATCTGTAGACATTATTC TTCATGACACATATTATGTTGTTGCTCATTTCCACTACGT-3'
[0013] 本发明具体提供了一种采用特异性引物快速鉴定番石榴实蝇的方法，具体方法如 下：
[0014] (1)通过种特异引物PCR(SS-PCR)和琼脂糖凝胶电泳技术，筛选出了 1对番石榴实 蝇的特异性引物FR447 :3'ACGTAGTGGAAATGAGCAACA5' ；
[0015] FF463-486 :3 'CACAACCGTTATTAACATGCG5 '。
[0016] (2)采用SSR-PCR引物的种特异性的检验：选用桔小实蝇B.dorsalis，颜带实蝇 B.cilifer，锈实绳B.rubigina，瑞丽果实绳B.ruiliensis，瘤腔实绳B.tuberculata，杨桃 实绳B.carambolae，瓜实绳B.cucurbitae，辣椒实绳B.latifrons，南瓜实绳B.tau，具条实 绳B.scutellata，近黑颜实绳B.parater，黑膝实绳B.scutellaris，滇寡鬃实绳B.modica， 何氏华实绳B.hochii，率实绳Carpomyavesuviana，瓜棍腹实绳Dacuslongicornis，腿端 黑实绳B.atrifemur，黑颜实绳B.diaphora，五指山实绳B.wuzhishana作为阴性对照，番石 榴实蝇为阳性对照，验证番石榴实蝇特异性引物的种特异性。结果表明，仅番石榴实蝇在 645bp处有一条特异性扩增的条带，阴性对照均无特异性目标片段，从而证明该引物在实验 涉及的这些实蝇种类范围内，能特异性的鉴定番石榴实蝇。
[0017] 一方面，引物的特异性是本实验成功的关键，特异性片段要有足够变异能够将不 同物种区分开。另一方面，当口岸仅发现卵或是残体时，即只能提取到微量DNA时，SS-PCR 检测鉴定方法的灵敏度就至关重要了。根据本发明的技术方案具有较高的灵敏度，能检测 到的DNA模板浓度可低至36. 24ng/uL，同时该SS-PCR特异性引物能够稳定区分近似物种， 因此，本发明的检测鉴定方法在实际检疫工作中也得到应用和验证。
[0018] 综上所述，本发明所建立的SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的方法具有快速简便、特 异性尚、灵敏度尚等优点，可以在8小时之内完成镑实绳的鉴定，能够满足口岸检验检疫快 速通关的要求。
【附图说明】
[0019] 图1显示引物FR447和FF463的种特异性验证，M :100bpDNALadder，1 :番石榴 实绳 B. correcta，2 :桔小实绳 B. dorsalis，3 :颜带实绳 B. cilifer，4 :锈实绳 B. rubigina， 5 :瑞丽果实绳 B. ruiliensis，6 :瘤腔实绳 B. tuberculata，7 :杨桃实绳 B. carambolae， 8:瓜实绳B. cucurbitae，9 :辣椒实绳B. latifrons，10 :南瓜实绳B. tau，11 :具条实绳 B. scutellata，12 :近黑颜实绳 B. parater，13 :黑膝实绳 B. scutellaris，14 :滇寡鬃实 绳 B. modica，15 :何氏华实绳 B. hochii，16 :率实绳 Carpomya vesuviana，17 :瓜棍腹实绳 Dacus longicornis，18 :腿端黑实绳 B. atrifemur，19 :黑颜实绳 B. diaphora，20 :五指山实 绳 B.wuzhishana，21 :空白对照 dd H20〇
[0020] 图2显示SS-PCR快速鉴定番石榴实蝇的应用与验证，M :100bp DNA Ladder，1-19 : 番石植实绳B. correcta，20 :空白对照dd H20。
[0021] 图 3 显示引物FR447 和 FF463 的灵敏度验证，M :100bp