一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物发酵领域，具体的，涉及一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产 量的方法。
【背景技术】
[0002] 多杀菌素，是刺糖多孢菌有氧发酵产生的次级代谢产物，属于大环内酯类化合物， 其商业化产品中有效的活性组分为多杀菌素 A(85% -90% )和多杀菌素 D(10% -15% )。 多杀菌素没有抑菌活性，却有很好的杀虫活性，对鳞翅目和缨翅目害虫有较广的杀虫谱，对 双翅目、鞘翅目和膜翅目中某些大量吞食叶片的害虫种类有很好的防治作用，在防治鳞翅 目害虫上，多杀菌素是现有杀虫剂中选择性最高的化合物之一，其活性与氯氰菊酯相当。多 杀菌素具有高杀虫活性的同时，对非靶标生物则表现出低毒，它对哺乳动物、鸟类和有益昆 虫毒性较低，对水生动物只有轻微的毒性，而且对哺乳动物无致癌、致畸、致突变或神经毒 性的作用。与一般杀虫剂相比，多杀菌素具有见效快、无副作用、选择性高、对天敌安全、半 衰期短、易降解、不易产生药物抗性等优点，是理想的高效低毒绿色农药，是治理抗性害虫 的首选替代农药新品种。
[0003] 在实际生产中需要利用刺糖多孢菌通过发酵过程生产多杀菌素。在利用刺糖多孢 菌对多杀菌素进行发酵生产的过程中，淀粉因具有价格低，来源广，可解除葡萄糖效应等优 点，常作为迟效碳源添加到培养基中，在生产实践中，现有的用于生产多杀菌素的刺糖多孢 菌普遍存在对发酵培养基中的淀粉利用率低下的缺陷，发酵液中经常残留未被有效利用的 多糖物质，导致最终获得的发酵液非常粘稠，加大了后期多杀菌素提取的难度，增加了资源 的浪费。重要的是，淀粉利用率低下的菌株也伴随着多杀菌素发酵产量低的缺陷。
[0004] 因此有必要提供一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法。
[0006] 为了达到这一目的，本发明提供了一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方 法，所述方法通过诱变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀菌素高产突变株，其 中，所述诱变处理包括紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚 硝基胍复合链霉素诱变中的至少2种诱变方式；
[0007] 优选的，包括至少4种诱变方式；
[0008] 更为优选的，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链霉素诱变、5-氟 尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变。
[0009] 优选的，所述方法还包括在实施每一种诱变方式后利用淀粉水解培养基对诱变处 理后的菌株进行培养，再利用碘液筛选淀粉利用能力强的刺糖多孢菌突变菌株。
[0010] 优选的，所述紫外线复合链霉素诱变的步骤包括，利用20-40W的紫外照射仪在 20-40cm处对刺糖多孢菌的孢子悬液照射30s-60s后获得紫外诱变菌悬液，再将所述紫外 诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。
[0011] 优选的，所述5-氟尿嘧啶诱变的步骤包括，将菌株在无有机氮源的饥饿培养基中 培养8-12h后接种于5-氟尿嘧啶浓度为50-80 μ g/mL的培养基中培养8-12天。
[0012] 优选的，所述微波复合链霉素诱变的步骤包括，以脉冲频率为2400-2500MHZ、功率 为500-900W的微波对菌悬液进行60-120S辐照处理后获得微波诱变菌悬液，再将微波诱变 菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。
[0013] 优选的，所述亚硝基胍复合链霉素诱变的步骤包括，用含有浓度为2-8mg/mL的亚 硝基胍的磷酸盐缓冲液制备刺糖多孢菌孢子悬液，将所述孢子悬液在25-30°C下震荡处理 20-40min后进行洗涤和稀释获得亚硝基胍诱变菌悬液，再将亚硝基胍诱变菌悬液涂布在含 有链霉素的培养基中培养。
[0014] 优选的，所述含有链霉素的培养基中链霉素的浓度为0. 1-0. 2 μ g/mL。
[0015] 优选的，所述淀粉水解培养基的pH值为7. 0-7. 4,淀粉水解培养基中各组分的含 量为：
[0016] 可溶性淀粉10_20g/L、磷酸氢二钾0. 3-0. 5g/L、碳酸镁0. 5-lg/L、氯化钠 0· 3-0. 6g/L、硝酸钾 0· 5-lg/L 和琼脂 15-20g/L。
[0017] 优选的，所述方法按照以下步骤进行：
[0018] 步骤一：对刺糖多孢菌出发菌株进行紫外线复合链霉素诱变后进行第一次淀粉利 用能力筛选，获得第一突变菌株；
[0019] 步骤二：对第一突变菌株进行5_氟尿嘧啶诱变后进行第二次淀粉利用能力筛选， 获得第二突变菌株；
[0020] 步骤三：对第二突变菌株进行微波复合链霉素诱变后进行第三次淀粉利用能力筛 选，获得第三突变菌株；
[0021] 步骤四：对第三突变菌株进行亚硝基胍复合链霉素诱变后进行第四次淀粉利用能 力筛选，获得多杀菌素1?广突变株。
[0022] 优选的，发酵过程包括将所述多杀菌素高产突变株接种在斜面培养基中培养后转 接到种子培养基中培养获得种子培养液，再将种子培养液接种到发酵培养基中进行发酵培 养得到发酵液。
[0023] 根据本发明所提供的方法获得的刺糖多孢菌高产突变株能够对发酵培养基中的 淀粉原料进行充分的利用，显著降低发酵培养基中的总糖和非还原糖含量，避免了发酵液 中大量未被有效利用的多糖物质残留所导致的发酵液非常粘稠的缺陷，降低了后期多杀菌 素提取的难度的同时也节省了资源，最主要的是，按照本发明所提供的方法筛选出的突变 株具有优异的多杀菌素高产性能，发酵获得的清液中多杀菌素效价更高。
【具体实施方式】
[0024] 下面将通过【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0025] 本发明提供了一种提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量的方法，所述方法通过诱 变处理筛选出淀粉利用能力强的刺糖多孢菌多杀菌素高产突变株，其中，所述诱变处理包 括紫外线复合链霉素诱变、5_氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素 诱变中的至少2种诱变方式；
[0026] 优选的情况下，所述诱变处理由紫外线复合链霉素诱变、5-氟尿嘧啶诱变、微波复 合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变组成。
[0027] 在本发明中，对于各种诱变方法在实施时的先后顺序没有特别的限制，只要能够 保证完成各个诱变过程即可。
[0028] 更为优选的情况下，所述诱变方式的实施顺序为依次进行紫外线复合链霉素诱 变、5_氟尿嘧啶诱变、微波复合链霉素诱变和亚硝基胍复合链霉素诱变。
[0029] 在本发明中，所述刺糖多孢菌的拉丁学名为Saccharopolyspora spinosa，属糖多 孢菌属，是一种好氧性革兰氏阳性的非抗酸性放线菌，具有多杀菌素生产功能。
[0030] 根据本发明，所述紫外线复合链霉素诱变的步骤包括，利用20-40W的紫外照射仪 在20-40cm处对刺糖多孢菌的孢子悬液进行照射后获得紫外诱变菌悬液，再将所述紫外诱 变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。其中，为了增加诱变的方式从而获得更好的 诱变效果，在进行紫外诱变的过程中，可以设置照射时间长短不同的梯度诱变组，例如，可 以设置照射时间30s、45s和60s的诱变组，并在紫外照射结束后分别将各个诱变组涂布在 含有链霉素的培养基中进行培养。
[0031] 根据本发明，所述5-氟尿嘧啶诱变的步骤包括，将菌株在无有机氮源的饥饿培养 基中培养8-12h后接种于5-氟尿嘧啶浓度为50-80 μ g/mL的培养基中培养。为了获得更 好的诱变效果，可以同时设置多个具有不同5-氟尿嘧啶浓度的培养基，将在饥饿培养基中 经过饥饿培养处理的菌株分别接种在含有不同浓度5-氟尿嘧啶的培养基中进行培养。在 含5-氟尿嘧啶的培养基中进行培养的条件还包括在25-30°C下培养8-12天。
[0032] 根据本发明，所述微波复合链霉素诱变的步骤包括，以脉冲频率为2400-2500MHZ、 功率为500-900W的微波对菌悬液进行60-120S辐照处理后获得微波诱变菌悬液，再将微 波诱变菌悬液涂布在含有链霉素的培养基中培养。所述辐照处理的具体步骤可以为每照 射5s后将菌悬液冷却至20-25°C后在继续进行辐照，累计各次的辐照时间。为了获得更好 的诱变效果，可以同时设置不同累计照射时间长度的辐照处理组，例如可以设置累计辐照 60s、90s、120s的辐照组，并将每个辐照组中的菌悬液分别涂布于含链霉素的培养基中进行 培养。
[0033] 根据本发明，所