一种褐藻胶裂解酶Algb及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001] 本发明设计一种褐藻胶裂解酶基因 algb。本发明还提供了含有该基因的载体和大 肠杆菌重组菌株及其表达产物的生产方法和应用。
【背景技术】
[0002] 褐藻胶是由ct -L-古罗糖醛酸（G)和β -D-甘露糖醛酸（M)两种单糖醛酸组成的 线型酸性多糖，广泛地存在于海带、裙带菜等大型褐藻类植物细胞壁中。随着糖生物学与糖 化学研究的逐步深入，许多海洋寡糖，尤其是褐藻胶的降解产物-褐藻胶寡糖具有多种生 物学活性。例如，低聚合度的褐藻胶寡糖具有降血脂、抗病毒、抗肿瘤以及抗氧化等生物学 活性，有的已经开发为药品。以褐藻胶为原料制备褐藻胶寡糖有多种方法：酸解法、氧化降 解法、超声降解法和酶降解法。
[0003] 其中，酸解法和氧化降解法降解条件难以控制，操作较为复杂，耗时长。超声降解 法一般与其他降解法共同使用，降解产物聚合度高，不易制得寡糖；酶法降解相对于其他降 解方法具有降解条件温和，反应条件易于控制，产物特异性强，得率高等优点，因此成为制 备褐藻胶寡糖的首选方法。
[0004] 制备褐藻胶寡糖所使用的酶即褐藻胶裂解酶，属于多糖裂解酶家族成员，能够催 化糖醛酸单元之间的1，4糖苷键发生水解，在断裂后新形成的非还原端生成双键。按照其 底物特异性的差异，褐藻胶裂解酶可以分为三类：专一性降解聚甘露糖醛酸的聚甘露糖醛 酸裂解酶（EC4. 2. 2. 3)、专一性降解聚古罗糖醛酸的聚古罗糖醛酸裂解酶（EC4. 2. 2. 11)和 能降解上述两种片段的双功能褐藻胶裂解酶。由于其具有底物专一性，褐藻胶裂解酶主要 用于制备特异性结构的褐藻胶寡糖，研究褐藻胶的化学结构等方面；此外，褐藻胶裂解酶还 可以应用于治疗肺囊肿性纤维化，制备海带等大型褐藻的原生质体等。
[0005] 褐藻胶裂解酶主要来源于海洋动植物（包括海洋软体动物、海洋藻类）和多 种微生物（包括海洋细菌、土壤细菌和真菌）。根据其底物特异性不同，可分为两大类： 专一性降解聚甘露糖醛酸的裂解酶（EC4. 2. 2. 3)和专一性降解聚古罗糖醛酸的裂解酶 (EC4. 2. 2. 11);此外还有一些能够降解上述两种片段的双功能裂解酶，主要是来源于交替 假单胞菌勵272(?8611(1〇3]^61'01]101^3 3口.勵272)的褐藻胶裂解酶417;从交替假单胞菌 Pseudoaltermonas sp.SM0524 中分离得到的 AlySJ-〇2 ;从 Isoptericola halotolerans 分 离得到褐藻胶裂解酶以及从麦芽寡养单胞菌（Stenotrophomsa maltophilia KJ-2)克隆得 到的褐藻胶裂解酶；以上四种裂解酶均具有降解PM和PG的能力，降解产物多为DP2-6的 寡糖。双功能的褐藻胶裂解酶由于其广泛的底物特异性而在工业生产上具有重要的应用价 值，主要用于褐藻胶寡糖的生产。本发明所涉及的褐藻胶裂解酶具有降解两种片段的能力， 并且在广泛的pH范围内具有良好的活性与稳定性，具有重要的工业应用价值。
【发明内容】
[0006] 本发明的第一个目的是提供一种新型褐藻胶裂解酶Algb及其编码基因。
[0007] 本发明的第二个目的是提供一种制备新型褐藻胶裂解酶Algb的方法。
[0008] 本发明的第三个目的是提供新型褐藻胶裂解酶Algb基因重组表达质粒和重组基 因工程菌株。
[0009] 本发明的第四个目的是提供新型褐藻胶裂解酶Algb在褐藻胶降解中的应用。
[0010] 本发明所提供的褐藻胶裂解酶Algb,来源于弧菌菌株Vibrio alginolyticus 40B，其氨基酸序列具有如下特征之一：
[0011] 1)序列表中的SEQ ID N0. 2从氨基端开始的第1-478位氨基酸残基序列。
[0012] 2)将序列表中的SEQ ID N0. 2从氨基端开始的第1-478位氨基酸残基序列经过氨 基酸残基的取代和/或缺失和/或添加后具有降解褐藻胶活性的蛋白质。
[0013] 本发明提供了新型褐藻胶裂解酶Algb的编码基因（命名为algb)，具有下述核苷 酸序列特征之一：
[0014] 1)序列表中SEQ ID NO. 1的脱氧糖核酸（DNA)序列；
[0015] 2)编码序列表中SEQ ID NO. 1氨基酸序列的脱氧核糖核酸（DNA)序列；
[0016] 本发明的新型褐藻胶裂解酶Algb的氨基酸序列及其核苷酸编码序列也可以根据 预测的Algb的氨基酸序列及其核苷酸序列人工合成获得。
[0017] 制备重组酶Algb的方法，是将编码基因 algb克隆到重组表达载体，导入宿主细 胞，获得重组表达的褐藻胶裂解酶。
[0018] 所述的重组表达内切褐藻胶裂解酶Algb的表达载体可以是大肠杆菌表达载体、 酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真 菌表达载体、植物表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体等。
[0019] 用于重组表达褐藻胶裂解酶Algb的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌宿 主细胞（如 Escherichia coli BL21>Escherichia coli JM109>Escherichia coli DH5 a 等）、酵母菌宿主细胞（如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis 等）、枯草杆菌宿主细胞（如 Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920 等）、乳酸菌宿主细胞（如Lactic acid bacteria C0CC101等）、放线菌宿主细胞（如 Streptomyces spp.等）、丝状真菌宿主细胞（如 Trichoderma viride，Trichoderma reesei, Aspergillus niger、Aspergillus nidulans 等）、昆虫细胞（如 Bombyx mori, Antharaea eucalypti等）或哺乳动物细胞（如中国仓鼠卵巢细胞CH0,幼小仓鼠肾脏细胞 BHK、中国仓鼠肺细胞CHL等）。
[0020] 本发明的新型褐藻胶裂解酶Algb来源于弧菌菌株Vibrio alginolyticus40B，通 过基因组挖掘技术，分析Vibrio alginolyticus40B基因组中可能的褐藻胶裂解酶基因，依 据同源序列通过设计特异性引物，克隆得到褐藻胶裂解酶Algb全长编码基因，该基因编码 区长1437bp，编码478个氨基酸，分子量约为54. 12kDa，属于多糖裂解酶家族7。大肠杆菌 表达获得重组酶Algb，以褐藻胶为底物时，在30°C、ρΗ8· 0条件下具有最高酶活力，比活力 达到 48. 79U/mg。
【附图说明】
[0021] 图1 :新型褐藻胶裂解酶Algb的蛋白质三维结构模型：整体结构为手套状_β -三 明治结构（glove-like-β-sandwich)，其中包含 3 个小螺旋结构（HI :22-26 ;H2 :76-79 ; H3 :185-189)以及2个反向平行的β-折叠片A和B，A包含8个β-strand结构，B包含7 个β -strand结构。
[0022] 图2 :新型褐藻胶裂解酶Algb表达及纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳图（SDS-PAGE)。 各泳道加入的样品分别是：M:蛋白标准分子量（marker)，条带自上到下顺序为：170kDa， 130kDa，110kDa，70kDa，55kDa，40kDa，35kDa，25kDa ;泳道 1 :重组菌体破碎后上清，上样量 为10 μ 1，泳道2 :重组菌破碎后上清经镍柱纯化的流出液，上样量10 μ 1 ;泳道3: lOmmol咪 唑洗脱液，上样量10 μ 1 ;泳道4 :20mmol咪唑洗脱液，上样量10 μ 1 ;泳道5 :50mmol咪唑洗 脱液，上样量10 μ 1 ;泳道6 :250mmol咪唑洗脱液，上样量10 μ 1。
[0023] 图3 :温度对于褐藻胶裂解酶Algb活性的影响。
[0024] 图4 :pH对于褐藻胶裂解酶Algb活性的影响。
[0025] 图5 :温度对于褐藻胶裂解酶Algb的稳定性的影响。
[0026] 图6 :pH对于褐藻胶裂解酶Algb的稳定性的影响。
[0027] 图7 :褐藻胶裂解酶Algb的底物偏好性曲线。
[0028] 图8 :褐藻胶裂解酶对于三种底物的降解产物ESI-MS图谱。A :褐藻胶底物的降解 产物的ESI-MS谱图，B :polyM底物的降解产物的ESI-MS谱图，C :polyG底物的降解产物的 ESI-MS 谱图。
【具体实施方式】
[0029] 实施例lVibrio alginolyticus 40B的培养及菌株基因组DNA提取
[0030] 所采用的菌种为弧菌Vibrio alginolyticus,挑取菌株的单克隆菌落接种到50ml 液体培养基中，接着放入温度为30°C、转数为220rpmin的摇床培养24小时后，将培养液离 心收集菌体并丢弃上清培养基。
[0031] 使用的液体培养基配方为（g/L):牛肉膏5g、葡萄糖15g、酵母浸粉1. 0g、NaCl 5. 0g