ET21a(+)同样用Bam HI和Xho I进行酶切后回收，将其与 上述所得目的基因连接后转化大肠杆菌DH5a中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用 质粒提取试剂盒抽提阳性转化子质粒，使用Bam HI和Xho I进行酶切验证，得到长度分别 为5. 5kb和1. 5kb左右两个片段，证明褐藻胶裂解酶基因已经克隆到表达载体pET21a(+) 上，将此重组质粒命名为pET21a_algb。
[0067] 实施例4褐藻胶裂解酶Algb基因在大肠杆菌中的重组表达与纯化制备
[0068] 将重组表达质粒pET21a_algb转化大肠杆菌菌株BL21 (DE3)(购自美国Novagen 公司），然后按照该公司提供的操作步骤进行褐藻胶裂解酶Algb诱导表达及纯化。用聚丙 烯酰胺凝胶电泳检测褐藻胶裂解酶Algb的纯化情况，结果如图2所示，纯化后的Algb在电 泳胶上呈现单一条带，且位置与预测的分子量相吻合。
[0069] 实施例5褐藻胶裂解酶Algb的酶学性质分析
[0070] (1) pH和温度对酶活性的影响
[0071] 将质量浓度为1 %褐藻酸钠底物、纯化的Algb酶液以及不同pH值的20mM Tris-HCl、磷酸盐、醋酸盐缓冲液（pH范围为2.0-11.0)按9:1:10(体积比）的比例混合 后，在30°C反应30分钟，按二硝基水杨酸法测酶活力。结果显示Algb在pH 8. 0时达到最 大活力，表明Algb的最适反应pH为7. 0(如图3)
[0072] 在最适pH下，将质量浓度为1 %褐藻酸钠底物、纯化的Algb酶液以及20mM Tris-HCl缓冲液（ρΗ7· 0)按9:1:10 (体积比）的比例混合，分别在不同温度（20°C -70°C ) 反应30分钟，按二硝基水杨酸法测酶活力。结果显示Algb在30°C时达到最大活力，表明 Algb的最适反应温度为30°C (如图4)。
[0073] 将质量浓度为1 %褐藻酸钠底物、纯化的Algb酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液按 9:1:10 (体积比）的比例混合后，在最适温度和最适pH下反应30分钟，按二硝基水杨酸法 测酶活力，接着用购于碧云天公司的蛋白质定量试剂盒测定Algb酶液的蛋白含量，结果表 明重组Algb对褐藻酸钠的比活为48. 79U/mg。
[0074] (2) pH和温度对酶稳定性的影响
[0075] 将在不同温度（20°C -80°C )下热处理30min后的Algb酶液与质量浓度为1%褐 藻酸钠底物溶液按1:9 (体积比）的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活， 以不经过热处理的酶液酶活定义为100%相对活力（relativie activity),结果表明Algb 在低于40°C的温度下具有较好的热稳定性（如图5)。
[0076] 将在30°C，不同的pH(pH4_10)预孵育24h后的Algb酶液与质量浓度为1%褐藻酸 钠底物溶液按1:9 (体积比）的比例混合，然后在最适温度和最适pH下测定剩余酶活，以不 经过pH处理的酶液酶活定义为100%相对活力（relativie activity),结果显示在pH6~ 10的范围内，Algb酶活仍保持70%以上，表明Algb对pH值耐受范围较广（如图6)。
[0077] (3) Algb的底物偏好性
[0078] 将纯化的Algb分别与质量浓度为0. 1 %的褐藻酸钠、聚甘露糖醛酸片段（polyM) 和聚古洛糖醛酸片段（P〇lyG)三种不同底物按1:9(体积比）的比例混合，然后在 30°C，pH7. 0条件下反应。取不同反应时间点的产物测其235nm紫外吸收值，发现随着酶 解时间延长，235nm吸收值逐渐增加，根据紫外法测褐藻胶裂解酶的原理（Qing-Da An et al. Process Biochemistry, 2008, 43:842 - 847)，证实 Algb 是裂解酶。另外，如图 7 所不， Algb对聚古洛糖醛酸片段、褐藻酸钠和聚甘露糖醛酸片段的降解均具有较好的降解活性， 表明Algb是一个双功能褐藻胶裂解酶。
[0079] 实施例6金属离子对Algb活性的影响
[0080] 将质量浓度为1 %褐藻酸钠底物、纯化的Algb酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液 (PH7.0)按8:2:10(体积比）的比例混合，接着向反应体系中添加不同的金属离子，添加的 离子终浓度为5mM，然后在30°C反应30分钟，按前述的二硝基水杨酸法测酶活力。对照组 为不加任何金属离子时Algb的活性（设定为100 % )，结果如下表所示。实验结果显示， Ca2+、Fe2+、Co2+能增加 Algb活性，Mg2++对Algb活性基本无影响，Cu2+、Zn2+等其他离子对酶 活呈现抑制作用。
[0081] 表1金属离子对Algb活性的影响
[0082]
[0083]
[0084] 实施例7褐藻胶裂解酶Algb对三种底物的降解产物的ESI-MS分析
[0085] 将质量浓度为0. 1%底物（褐藻酸钠、polyM和polyG)、纯化的Algb酶液以及50mM Tris-HCl缓冲液按9:1:10 (体积比）的比例混合后，在pH7. 0, 30°C条件下反应，对酶解 72小时后的产物进行电喷雾质谱分析。电喷雾质谱条件为采用正离子模式，离子源电压： 4. 5kV ;鞘气流速：30arb ;毛细管温度：275~300°C;管镜电压：250V ;扫描范围：150-2000。
[0086] 如图8所示，Algb对于三种不同底物的产物均以二到五糖为主要产物。因此，褐藻 胶裂解酶Algb可被用于褐藻酸钠寡糖的制备以及与褐藻酸钠降解相关的领域，包括化工、 农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等。
【主权项】
1. 褐藻胶裂解酶Algb，具有序列表中SEQ ID NO. 2从氨基端开始的第1-478位氨基酸 残基序列。2. -种权利要求1所述褐藻胶裂解酶Algb的编码基因，具有序列表中SEQ ID NO. 1的 脱氧核糖核酸（DNA)序列。3. -种权利要求1所述的褐藻胶裂解酶的制备方法，其特征在于：是将权利要求2所 述的褐藻胶裂解酶基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的褐藻胶裂解 酶； 所述的重组表达褐藻胶裂解酶的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯 草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、噬菌体载体、丝状真菌表达载体、植物 表达载体、昆虫表达载体、或哺乳动物细胞表达载体； 用于重组表达褐藻胶裂解酶的重组菌或转基因细胞系，是指大肠杆菌宿主细胞中的 Escherichia coli BL21、Escherichia coli JM109 或 Escherichia coli DH5a、酉孝母菌 宿主细胞中的Saccharomyces cerevisiae、Pichiapastoris 或 Kluyveromyces lactis、 枯草杆菌宿主细胞中的Bacillussubt il is R25或Bacillus subtil is 9920、乳酸菌宿主 细胞中的 Lactic acidbacteria C0CC101、放线菌宿主细胞中的 Streptomyces spp.、丝 状真菌宿主细胞中的 Trichoderma viride，Trichoderma reesei, Aspergillus niger 或 Aspergillus nidulans、昆虫细胞中的Bombyx mori 或Antharaeaeucalypti，哺乳动物细胞 中的中国仓鼠卵巢细胞CHO,幼小仓鼠肾脏细胞BHK或中国仓鼠肺细胞CHL中的一种。4. 一种权利要求1所述的褐藻胶裂解酶在褐藻酸盐降解中的应用。5. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的褐藻胶裂解酶具有如下用途之一或 二种以上； 1) 用于断裂褐藻酸盐（褐藻酸钠）的糖苷键，获得褐藻酸盐寡糖； 2) 用于降解红藻、或褐藻细胞壁中的褐藻酸盐（褐藻酸钠）组分，抽提原生质体，用于 食品及藻类研究； 或3)用于破坏致病菌铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)所形成的菌膜中褐藻 酸钠成分。6. 如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述褐藻胶裂解酶Alga与其他褐藻胶降解 酶混合后，用于协同断裂褐藻酸盐糖苷键。
【专利摘要】本发明公开了一种褐藻胶裂解酶Algb的基因序列及其制备方法与应用。本发明所涉及到的褐藻胶裂解酶Algb来源于来源于Vibrio？alginolyticus40B。本发明提供了制备该新型褐藻胶裂解酶的方法，即使用基因工程的方法，将该褐藻胶裂解酶的编码基因克隆到大肠杆菌表达载体上，从而获得可以异源表达该酶的大肠杆菌重组菌株，用该菌株异源表达制备的褐藻胶裂解酶Algb，具有降解褐藻酸钠制备褐藻酸钠寡糖的功能。本发明提供的褐藻胶裂解酶Algb可广泛应用于化工、农业、食品、饲料添加、医药及海藻遗传工程等领域。
【IPC分类】C12N15/60, C12N9/88, C12P19/00, C12N15/63
【公开号】CN105624137
【申请号】CN201410660235
【发明人】尹恒, 朱本伟, 王文霞, 谭海东, 李曙光
【申请人】中国科学院大连化学物理研究所
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2014年11月18日