专利名称：：一种近海环境微生物高纯度大片段基因组的制备方法
技术领域：
：本发明涉及构建宏基因组文库时大片段基因组的制备方法，特别涉及构建海洋微生物宏基因组文库时大片段基因组的制备方法，确切地说是一种近海微生物高纯度大片段基因组的制备方法。二
背景技术：
：BAC(细菌人工染色体)作为有效的克隆和表达载体，能携带很大的DNA片段(40~400kb)，有利于构建大容量的基因组文库，从而确保了取样环境的基因多样性和丰富性；能容纳整个基因簇和生物合成代谢途径，有利于新药物、新型生物催化剂和其他有价值的活性物质的开发和利用。使用BAC载体构建宏基因组文库，要求有大片段、高纯度、结构完整的基因组DNA.既要尽可能的提取环境样品中的基因组副A,又要保持片断的完整以获得完整的目的基因或基因簇，还要足够的纯度以保证与载体的连接效率和转化感受态细胞的效率。因此高质量的大片段基因组对于使用BAC载体构建高容量海洋微生物宏基因组文库至关重要，对于不同环境的样品所采取的抽提纯化大片段基因组的方法也各不相同，因此发展了多种方法抽提纯化基因组用于构建宏基因组文库。CN1511948A公开了一种构建基因文库的方法，通过该方法所构建的文库平均插入片段为19kb。CN182H02A公开了一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，按照此方法所提取的基因组大小在50kb左右。CN101148676A公开了一种构建红树林土壤大片段宏基因组文库的方法，按照这种方法制备的基因组多集中在2350kb。过小的片段不利于构建高容量的宏基因组文库，不利于新药物、新型生物催化剂和其他有价值的活性物质的筛选，大大限制了BAC载体作为大容量载体构建宏基因组文库进行功能筛选的优势。由于海洋环境的特殊性和生物多样性，海洋微生物具有不同于陆生微生物的独特代谢途径和遗传背景，必定蕴含着独特的遗传资源。然而在近海这个独特的生态环境中，微生物群体含量低而腐殖质相对含量高，直接提取基因组方法中所用的CTAB和PVPP的处理并不能完全除去腐殖质类物质，仍然存在的污染物会抑制限制性内切酶的活性(Zhou，J.,Bruns,M.A.，andTiedje，J".M.(1996)DNArecoveryfromsoilsofdiversecomposition.ApplEnvironMicrobiol62:316~322)。另外，虽然通过这种方法所获得的基因组DNA产量高，但是大片段基因组DNA在总基因组中的比率较低，片段大小低于100kb(Robe,P.，RNalin,R.，Capellano，C.,Vogel，T.，Simonet，T.(2003)ExtractionofDNAfromsoil39:183~190)。在后续的必需处理步骤中机械力的作用和部分酶切的作用使得大片段基因组DNA断裂变得更小，同时也使得大片段基因组DNA所占的比率更低，不利于构建大片段、高容量和高覆盖率的宏基因组文库。采用琼脂糖包埋微生物菌体原位裂解的方法，在包埋微生物细胞的同时，腐殖质与微生物细胞一起被包埋，在微生物细胞裂解后与基因组共结合，阻碍了后续部分酶切及与载体连接等必需分子生物学步骤。在接下来的基因组DNA部分酶切中，通常采用两种方法，一采用琼脂糖酶酶解低熔点琼脂糖包埋块后进行大片段基因组部分酶切，琼脂糖的酶解在65°C或更高的温度进行，大片段基因组DNA在高温下不稳定易断裂。低熔点琼脂糖和琼脂糖酶价格昂贵，目前国内并无企业生产，这种方案低熔点琼脂糖和琼脂糖酶用量大，增加了构建宏基因组文库的成本。另外，停留在包埋块中的腐殖质会抑制琼脂糖酶的活性，使得酶解琼脂糖发生困难。二采用限制性内切酶直接渗透进行酶切。限制性内切酶渗透入低熔点琼脂糖包埋块中进行酶切，这种方法需要首先将琼脂糖块浸泡在无菌水中去除EDTA，接着放在酶切缓冲液中让酶切缓冲液在包埋块中平衡，然后转移到酶切体系中让限制性内切酶在缓冲液中和琼脂糖包埋块中达到平衡再进行酶切反应，最后加入EDTA并放置于冰上终止反应。该方法步骤多耗时长，所需限制性内切酶量大，对样品的纯度要求高，若包埋块中存在着与基因组DNA紧密结合的腐殖质将抑制限制性内切酶的活性，导致部分酶切失败。在包埋块中进行酶切时需要每一步平衡都要充分，否则部分酶切条件难以重复。总之通过原位裂解的方法存在三个问题，一包埋块中腐殖质污染的问题，腐殖质与基因组DNA共结合使得后续的琼脂糖酶消化、限制性内切酶酶切以及与BAC载体的连接效率低下甚至不能进行，导致构建文库失败。二制备大片段基因组使用的低熔点琼脂糖和酶解琼脂糖包埋块所用的琼脂糖酶价格都非常昂贵，使得构建文库成本高昂。三包埋块中低浓度的基因组DNA将使得后续的分子生物学步骤无法进行。
发明内容本发明针对现有技术的不足和实际需求，旨在提供一种制备近海环境微生物高纯度大片段基因组的方法，进而使用BAC载体构建近海海洋微生物的宏基因组文库，用于新药物、新型生物催化剂和其他有价值的活性物质的开发和利用。所要解决的技术问题是排除腐殖质的干扰和解决基因组DNA的低浓度。本发明的技术方案包括微生物菌体的分离、收集、包埋、裂解、消化、洗涤、纯化和浓縮，与现有技术的区别是所述的包埋是重悬于bufferl的微生物菌体和等体积的1~2%琼脂糖溶液混合形成包埋块，所述的bufferl是每升水中含0.15~0.25MNaCl、40~60mMEDTA、48~12mMTris，pH7.5~8.5;所述的琼脂糖为凝固温度为3640。C的分子生物学级琼脂糖；包埋块经裂解、消化后释放出基因组DNA，洗涤除去蛋白酶K后进行电洗脱去除腐殖质得到高纯度的基因组DNA，最后浓缩，所述的电洗脱在普通电泳槽中进行，4°C，4~6V/cm,2~4h，倒转电极12min，所述的浓缩是洗脱液置于0.025WI1的滤膜上，滤膜漂浮于浓度为8~12wt%PEG8000的液面上进行浓縮。具体操作过程如下1、收集微生物菌体使用8um的滤纸过滤海水除去沙粒及真核类生物，通过0.22nm的滤膜收集海水中的微生物细胞，使用刀片将微生物细胞从滤膜表面剥离，重悬于灭菌的海水中。离心收集微生物菌体。2、包埋微生物菌体微生物菌体重悬于buffer1(0.15~0.25MNaCl，40~60mMEDTA,8~12mMTris;pH7.5~8.5)，与保温在4246。C的浓度为1~2%(重量百分比)的琼脂糖溶液等体积充分混匀，注入包埋模具，冰上冷却形成包埋块。3、裂解微生物细胞将包埋块置于40mlbufferl(bufferl中含终浓度0.2%脱氧胆酸钠，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/ml溶菌酶)在37。C裂解28h。4、消化微生物细胞将包埋块转移到的buffer2(lmg/mlof蛋白酶K，1%十二烷基肌氨酸钠，50mM/LTris,0.5M/LEDTA;pH8.0)消化12~36h，然后更换新的buffer2再消化1236h，脉冲电泳检测制备的基因组DNA，结果见图l。5、洗包埋块裂解消化完毕后，在室温下用50ml含1mM苯甲基磺酰氟的TE50buffer(lOmMTris,50mMEDTA)洗涤包埋块去除残余的蛋白酶K活力。然后用50ml的TE50buffer洗涤三次。6、电洗脱为了去除抑制酶活性的腐殖质，将2~4个包埋块一起进行电洗脱，将带负电的基因组DNA洗脱，而腐殖质保留在包埋块中，制备出高纯度的基因组DNA。7、浓縮基因组DNA:在培养皿中加入812wt。/。的PEG8000,放置0.025nm的滤膜于液面，电洗脱液于滤膜上浓缩。8、经纯化、浓缩得到的基因组可用于构建基因文库。本发明的突出优点如下1、本方案不使用昂贵的低熔点琼脂糖和琼脂糖酶节省了构建文库的成本，在包埋微生物菌体和脉冲场凝胶电泳分离基因组DNA片段时使用分子生物学级的琼脂糖而不是低熔点琼脂糖，对大片段基因组DNA的酶切采用电洗脱后直接酶切的方式，避免了使用昂贵的琼脂糖酶，同时也节约了限制性内切酶的用量。2、由于海水中微生物群量低，相对之下腐殖质含量较高，为了收集足够的微生物群量通过滤膜过滤浓縮大量海水使得腐殖质的比率得以快速提高，而通过bufferl和buffer2裂解消化微生物细胞并不能去除腐殖质，制备的包埋块呈现腐殖质的典型黄褐色，腐殖质停留在包埋块中与基因组DNA共结合限制了后续的分子生物学操作。本方案采用电洗脱纯化基因组DNA的方案，将基因组从包埋块中洗脱，解决了腐殖质类物质与基因组DNA共结合的难题。获得高纯度的基因组DNA，避免了腐殖质在后续步骤中对限制性内切酶活性和T4连接酶活性的抑制，同时避免了机械力的损伤，保证了结构的完整性获得了大片段的基因组DNA，如图2中l所示回收的基因组大片段高达700kb，并且大片段比率很高。另外如图2中2所示，限制性内切酶2min即可将大片段基因组DNA部分酶切，说明了大片段基因组DNA纯度高，不含腐殖质类污染物。3、本方案针对海洋中包埋块中基因组的丰度低，采取电洗脱后滤膜浓縮基因组的方案，解决了海水中微生物群体少因而琼脂糖包埋块中基因组含量少而导致后续必需分子生物学步骤无法进行的问题，通过滤膜浓缩后能够获得高浓度、高纯度的大片段基因组DNA，满足了构建宏基因组文库的需要。4、由于本方案制备出的大片段基因组DNA具有高浓度、高纯度、结构完整的特征，因而与BAC载体连接效率高，转化感受态细胞效率极高，达到8X109克隆/nigpBeloBACllvector。2y1的连接产物转化即可获得20000个克隆，平均插入片段70kb，阳性率达到99%，获得了1.4Gbp的覆盖率。通过一次的转化即可获得高容量高覆盖率的宏基因组文库，大大减少了构建高覆盖率文库所需的转化次数因而节约了商品化感受态的用量，同时节约了构建文库的时间、成本和工作量。四图l:为本发明实施例的南海海洋微生物基因组制备结果。M:ADNAladder,l和2所示为制备的基因组DNA。图2:为本发明实施例的南海海洋微生物基因组部分酶切结果。M:入DNAladder,1~5分别为基因组DNA酶切O、2、4、6、8min的结果。图3:为本发明实施例的50ul电转化液涂氯霉素抗性LB平板结果。注释微距拍摄导致颜色部分失真显示培养皿边缘微红色，图中所标O为蓝斑，其余皆为白斑。图4:为本发明实施例的抽质粒酶切鉴定插入片段结果。M:ADNAladder,1~11分别为随即挑选的克隆插入片段电泳结果。五具体实施例方式1、南海海表采样收集微生物菌体距离厦门海岸10km的海表取水样，使用8um的滤纸(Whatman)过滤海水除去沙粒及真核类生物，通过0.22ym的滤膜(Millipore)收集海水中的微生物细胞，使用手术刀片将微生物细胞从滤膜表面剥离，重悬于灭菌的海水中。12000g，15min,4'C离心收集微生物菌体。2、包埋微生物菌体微生物菌体重悬于buffer1(0.2MNaCl，50mMEDTA，10mMTris;pH8.0)，与溶化的保温在45。C浓度为1.6y。的琼脂糖溶液(Biowest)等体积充分混匀，注入包埋模具(Biorad)，冰上冷却15min形成包埋块。3、裂解微生物细胞将包埋块置于40mlbufferl(bufferl中含终浓度0.2%脱氧胆酸钠，1%十二烷基肌氨酸钠，lmg/ml溶菌酶)在37'C裂解4h。4、消化微生物细胞将包埋块转移到40ml的buffer2(lmg/ml蛋白酶K，1%十二烷基肌氨酸钠，50mM/LTris，0.5M/LEDTA;pH8.0)消化24h，然后更换新的buffer2再消化24h。脉冲电泳检测制备的基因组DNA,结果见图l。5、洗包埋块裂解消化完毕后，在室温下用50ml含1mM苯甲基磺酰氟的TE50buffer洗涤包埋块去除残余的蛋白酶K活力。然后用50ml的TE50buffer洗涤三次。6、电洗脱为了去除抑制酶活性的腐殖质，将3个包埋块一起进行电洗脱，将带负电的基因组DNA洗脱，而腐殖质保存在包埋块中，电洗脱在普通电泳槽中进行，条件为4'C，5V/cm，3h，然后反转电极电洗脱lmin，高纯度的基因组DNA就释放到透析袋的洗脱液中。7、浓縮基因组DNA:在90腿的培养皿中加入10。/。的PEG800020ml，放置0.025um的滤膜(Millipore)于液面，电洗脱液于滤膜上浓縮至lOOtx1。8、部分酶切使用HindIII(NEB)摸索部分酶切大片段基因组的最优条件(见表l)，37'C反应2min、4min、6min、8min，结果见图2。采用最优条件酶切大片段基因组。表1部分酶切体系(y1)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>9、电洗脱回收脉冲场凝胶电泳分离部分酶切产物，将大于50kb的区域切割，电洗脱回收，将电洗脱液通过0.025um的滤膜浓縮(方法同上)。10、连接将基因组DNA与BAC载体连接(见表2)，15°C，16h。将连接产物在0.025ym的滤膜上浓縮脱盐(方法同上)。表2连接体系(yl)_部分酶切的基因组DNA30pBeloBACllvector110XT4ligasebuffer10T4ligase3ddH205610011、取2y1连接产物转化50lil￡coiiEPI300细胞，电转化条件2.5kV，25uF，200Q，涂氯霉素抗性的LB培养板，每次转化能够获得约20000个克隆，结果见图3。12、挑单克隆于LB中培养，抽质粒、NotI酶切、脉冲场凝胶电泳检测，结果见图4，阳性率高于99%，片段大小均一，平均插入片段70kb.为一高质量的BAC文库，一次转化即可获得1.4Gbp的覆盖率。权利要求1、一种近海微生物高纯度大片段基因组的制备方法，包括微生物菌体的分离、收集、包埋、裂解、消化、洗涤、纯化和浓缩，其特征在于所述的包埋是重悬于bufferl的微生物菌体和等体积的1～2％琼脂糖溶液混合形成包埋块；所述的bufferl是每升水中含0.15～0.25MNaCl、40～60mMEDTA、8～12mMTris，pH7.5～8.5；所述的琼脂糖是凝固点为36～40℃的分子生物学级琼脂糖；所述的纯化是包埋块经裂解、消化和洗涤后进行电洗脱纯化，电洗脱在普通电泳槽中进行，条件为4℃，4～6V/cm，2～4h，然后反转电极洗脱1～2min；所述的浓缩是洗脱液置于0.025μm的滤膜上，滤膜漂浮于8～12wt％PEG8000的液面上进行浓缩。全文摘要一种近海微生物高纯度大片段基因组的制备方法，将分离、收集的近海微生物菌体重悬于buffer1中并和等体积的1～2％琼脂糖溶液混合形成包埋块，buffer1是每升水中含0.15～0.25MNaCl、40～60mMEDTA、8～12mMTris，pH7.5～8.5；琼脂糖是凝固点为36～40℃的分子生物学级琼脂糖；包埋块经裂解、消化和洗涤后进行电洗脱纯化和膜浓缩。得到高浓度、高纯度的大片段基因组DNA，满足了构建宏基因组文库的需要。本发明采用电洗脱纯化基因组的方案，解决腐殖质类物质与DNA共结合的难题，从而获得结构完整的大片段基因组DNA，也避免了腐殖质类物质在后续构建基因文库时的干扰。文档编号C12N15/10GK101314773SQ20081002434公开日2008年12月3日申请日期2008年5月21日优先权日2008年5月21日公开号200810024342.发明者储新民,孙宝林,峰朱申请人:中国科学技术大学被以下专利引用(1),