专利名称：：一种含cmp激酶和cdp激酶的啤酒酵母菌的筛选及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的筛选以及该啤酒酵母菌在生产胞苷三磷酸中的应用，属于生物工程
技术领域：
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背景技术：
：胞苷三磷酸(简称CTP)是机体细胞内的一种正常成分，它在体内参与核酸和磷脂类的合成代谢，促进蛋白质的合成，并提供能量，还可以调节和促进神经细胞、神经胶质细胞及血管壁细胞膜性结构的合成与构建，能够对抗由兴奋性氨基酸、自由基引起的神经细胞损伤，从而起到抗血管硬化的作用。而胞苷一磷酸激酶(CMPkinase)和胞苷二磷酸激酶(CDPkinase)的主要作用是负责激活胞苷三磷酸合成酶(CTPsynthetase),激活胞苷三磷酸合成酶能降低胞苷一磷酸(简称CMP)水平，使CMP合成CTP。目前已有厂家生产CTP注射液制剂，临床上主要用于治疗多种原因引起的神经系统及心血管类疾病，如脑血管意外及其后遗症；脑震荡、外伤性昏迷、颅脑手术后功能障碍；神经官能症；脑血管硬化、老年性痴呆；外周神经损伤；儿童脑发育不全等。(IshigeKazuya，2002)枯草芽孢杆菌jofC编码CMP激酶，啤酒酵母中URA6编码CMP激酶(ShinyaKaneko，1998)。大肠杆菌中mssA基因编码CMP激酶已被Fricke等人证实，虽然CMP激酶不是大肠杆菌所必需，但CMP激酶在ATP提供磷酰基情况下，可逆催化CMP转化CDP,进而生成CTP:ATPMg2++CMP—ADPMg2++CDPATP-Mg2++CDP—ADPMg2++CTPCTP的合成工艺方法主要包括化学法、生物合成法、光合磷酸法等。由于底物价格的原因，国内外对CTP工业化生产的研究甚少，在我国真正生产CTP的企业基本上没有，但自发现可作为药物以后，市场需求逐年增大，随着CMP价格的逐年下降，生产前景十分看好。CTP在上世纪80年代国内的生产方法主要都是通过分离出酵母体内的自身酶系对CMP进行转化，生产工艺比较成熟，但该工艺不能完全分离出糖酵解系统中的所有酶，酶失活率高，转化率低，(EthanSSimon，1990)。应国清等人(2004)利用游离的啤酒酵母将CMP合成为CTP，CTP的转化率可维持在80。/。左右，詹谷字等人(1997)用菠菜叶绿体通过光合磷酸化反应将CMP合成为CTP,转化率为85%。
发明内容本发明的目的是公开一种含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌。本发明的另一个目的是提供筛选该啤酒酵母菌的方法。本发明的再一个目的是公开该啤酒酵母菌在生产胞苷三磷酸中的应用。本发明通过以下技术方案达到以上目的一种含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(^cc力"湖/cescei"en、/ae)菌才朱，菌落为乳白色，有光泽，平坦，边缘整齐，其在2008年4月IO日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号是CGMCCNO.2448。所述菌^^朱的筛选方法的步骤包括(1)制作酵母菌悬液，将酵母经培养基活化后放入摇床振荡培养到细胞处于对数生长期后离心回收菌体，加入磷酸盐缓冲液制成菌悬液；(2)将上述菌悬液与诱变剂按l:l容量比混合，3(TC恒温水浴10-50分钟后，混合液稀释至10—3倍-10—6后涂布平板，得到抗性菌抹；(3)将上述抗性菌抹经摇床培养24-36小时，用高效液相色谱法检测并筛选出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌抹；其中，摇床的温度为26-36°C，转速为160-300rpm，所述步骤(2)中的诱变剂是2mg/ml的亚硝基胍；所述平板中的培养基含有300]ug/ml胞苷三磷酸结构类似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌株为胞普二磷酸-乙醇胺抗性突变抹，。本发明的啤酒酵母菌菌抹在生产胞苷三磷酸中的应用包括利用包埋法以卡拉胶-魔芋多糖复配胶为载体将所述菌种制成固定化细胞后加入合成胞苦三磷酸的反应体系中，再利用离子交换分离纯化的方法分离纯化反应液，最后结晶得到胞苷三磷酸。其具体步骤是(1)将卡拉胶钠盐和魔芋粉溶于去离子水中，蒸汽加热到121°C后保温4070分钟，倒入反应釜中自然冷却到40°C,胶液保温，其中k-卡拉胶钠盐与魔芋粉的重量比为2:1;(2)将生理盐水加入洗涤好的啤酒酵母湿菌体中搅拌均勻制成酵母悬液，35。C保温，其中生理盐水和啤酒酵母湿菌体的重量比为1:4;(3)将步骤(2)中的酵母悬液倒入步骤(1)的胶液中，于40°C下搅拌20~40分钟，使之混匀得到混合物；(4)在带搅拌的反应釜中加入溶剂预热至4(TC，将步骤(3)得到的混合物倒入反应蚤，搅拌2G~40分钟待混合物形成颗粒，过滤，其中搅拌速度为50-150rpm;(5)将步骤(4)中过滤后的颗粒在氯化钾溶液中浸泡30~90分钟，过滤，再用戊二醛浸泡30~90分钟，用筛网沥尽颗粒表面水分后，装袋至冰箱冷藏。其中步骤(4)中采用的溶剂为豆油，所述固定化细胞为球状。所述离子交换分离纯化的方法分离纯化反应液的步骤中釆用HZ-1离子交换树脂进行离子交换色谱，并用1.Omol/L氯化钠溶液每小时以0.2-0.5柱体积进行梯度洗脱，得到胞苷三磷酸洗脱液。所述结晶的步骤中将洗脱液在50-7(TC水浴下减压浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，于冰箱静置过夜后抽滤，将滤饼干燥得到胞苷三磷酸。本发明采用包埋法以卡拉胶为载体自动生成球形颗粒固定化细胞，可以方便的制备各种粒径的球形颗粒，与手工切割相比，细胞渗漏少，颗粒规则，强度高，劳动强度小，造粒程序简单，无须复杂的设备和仪器。其优点在于所使用的溶剂为豆油，安全无毒，获取方便，适合各种要求，并且易于回收；该工艺稳定，操作简便，产品后处理简单，易于工业化生产。应用本发明球形固定化酵母颗粒催化反应合成CTP，维持时间长，并可以方便固液快速分离，降低所生成的CTP进一步降解；球形颗粒可以反复使用十批以上且不降低CTP转化率，其反应液清亮，无须进一步复杂的颗粒回收操作，反应批次明显高于游离酵母和手工切割颗粒；反应液经离子交换分离，所得CTP浓溶液纯度达到94%以上，柱上收率均在80%以上；而游离酵母反应液所得的CTP离子交换液纯度差，收率低；结晶后，由于CTP浓溶液纯度高，所得晶体结晶容易，晶体纯度达到97%以上，晶体含量达到94%以上，明显高于游离酵母和手工切割的颗粒反应，CTP转化率可达到97%。以下结合附图对本发明作进一步的说明。图1为本发明啤酒酵母菌抹。图2为本发明制备的球形固定化颗粒的重复反应示意图，图中-令_表示球形颗粒；-〇-表示游离酵母；-a-表示手工切割。图3为CTP标准品的HPLC图谱。图4为CTP样品的HPLC图谱。具体实施方式材料和仪器市售的啤酒酵母、摇瓶培养基、斜面培养基、亚硝基胍(简称NTG)溶液、底物溶液、摇床、20L带搅拌反应釜、100L带搅拌反应釜、高效液相色谱仪。摇瓶培养基的配制40g葡萄糖、15g硫酸铵、9g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、3g七水硫酸镁、0.03g七水硫酸亚铁、3g酵母膏、3g玉米浆,溶于1000ml蒸馏水中，pH4.0-6.5,115。C灭菌20min。斜面培养基的配制40g葡萄糖、15g硫酸铵、9g磷酸二氢钾、3g磷酸氢二钾、3g七水硫S吏镁、0.03g七水硫酸亚铁、3g酵母膏、3g玉米浆、20琼脂，溶于1000ml蒸馏水中，pH4.0-6.5。实施例一(1)将待筛选的市售啤酒酵母经斜面培养基活化后转入摇床培养，摇床温度30°C，转速200rpm培养2化后，再取lml培养液转接于摇瓶培养基中，摇床培养至对数生长期，离心回收菌体，加入5ml、pH7.0的磷酸盐緩沖液，制成菌悬液。(2)称取20mg的NTG,用丙酮溶解后，加入蒸馏水定容至10ml，即为2mg/ml的NTG溶液，将lml菌悬液和lml亚硝基胍(NTG)溶液混合，振荡混匀后，在30。C恒温水浴锅水浴30min，然后将混合液稀释至10_3终止诱变。诱变终止后再将终止液稀释成l(T5、l(T后涂布加有胞苷三磷酸结构类似物胞苷二磷酸-乙醇胺(3GGng/ml)平板，筛选出胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突变株。(3)将筛选出的抗性突变株接入斜面培养基中，3(TC培养24h做为斜面活化种子。将斜面活化种子接入摇瓶，3(TC，200rpm摇床培养至对数生长期，离心回收菌体，并将该菌抹转接斜面培养基，3(TC培养24小时后至4。C冰箱保存。在25g酵母量中加入20ml底物溶液，其中包括CMP60mmol/L、葡萄糖150mmol/L、磷酸盐緩冲液(钠盐)250mmol/L、氯化4美8mmol/L、pH为6.0，温度35。C，通过添加O.15ml吐温80，ATP浓度为3mmol/L，反应时间20h，在此反应体系下，筛选出含高活力CMP激酶、CDP激酶的啤酒酵母菌菌株，见图l，并用高效液相色谱法检测。其中，高效液相色谱法的色谱条件为色谱柱汉邦LichrospherO(250mmx4.6mmi.d.，5jum);流动相曱醇6%。(体积分数)，磷酸水溶液(用三乙胺调节pH值至6.6)(体积比为11:89);流速l.OmL/min;4企测波长271nm;柱温为室温；进样体积20)iL。实施例二(1)称取200gK-卡拉胶钠盐，100g精制魔芋粉，溶于5L去离子水中，通蒸汽加热至12rC,保温60min后，倒入20L带搅拌的反应釜中，自然冷即到40°C，胶液保温备用。(2)称取洗涤好的啤酒酵母湿菌体4kg并加入lkg生理盐水，搅拌均匀，35"C保温备用。(3)将保温好的酵母悬液倾入胶液中，于40。C搅拌半小时使混合均匀后备用。(4)在100L带搅拌的反应釜中加入60L大豆油，预热至4(TC,控制搅拌速度125rpm，将酵母与胶液的混合物倒入大豆油中，搅拌半小时待颗粒成形，过滤，豆油回收后静置，弃去下层水份后可重复使用。(5)将步骤(4)中过滤后的颗粒用3%的氯化钾溶液浸泡一小时，过滤，再用1%的戊二醛浸泡一小时，用筛网沥尽颗粒表面的水份，装袋置冰箱冷藏备用。本实施例可以根据需要控制搅拌转速制备各种粒径的球形颗粒，搅拌转速与球形颗粒直径关系见表1表l<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>其中，*表示要求的直径颗粒重量比上总颗粒重量不小于90%，由表1可知，该方法可以方^f更的制备颗并立直径l-5mm的J泉形颗粒，无需复杂的设备及操作条件。本发明造粒方法与手工切割方法形成颗粒的比较见表2表2<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>*表示颗粒与生理盐水的比例为1:1。由表2可知本发明造粒方法制得的颗粒球形均匀，强度高，细胞渗透少。实施例三固定化酵母合成CTP的反应体系中，除生成大量的CTP外，还存在未反应的CMP及副产物CDP、磷酸盐等杂质，为将CTP从反应液中分离，采用HZ-1离子交换树脂进行离子交换色谱，并先用0.4mol/L氯化钠，再用1.0mol/L氯化钠溶液每小时以0.2-0.5柱体积进行梯度洗脱。将洗脱液在506(TC水浴下减压浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，于水箱静置过夜，抽滤，滤饼干燥，成品用高效液相色谱法检测，色谱条件与实施例一相同。固定化酵母对CTP的连续反应情况见图2，由图可知应用固定化球形颗粒可以连续反应十批以上，反应液清亮，无明显的细月包脱漏现象；而应用同样方法手工切割的无定形小方块，虽然可以连续反应，但第4次以后，反应转化率明显降低，且反应液中酵母渗漏严重，溶液混浊；游离酵母只能反应一次，第二次以后反应转化率显著降低。本实施例中得到CTP的检测结果见图3、图4。离子交换法和结晶方法为实验室常规方法，此处不再赘述。CTP收率见表3。结晶数据见表4表3<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>其中，*表示游离细胞反应，**表示手工切割颗粒催化反应;表4<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>其中，*表示游离细胞反应，**表示手工切割颗粒催化反应;结果与讨论由表3可知，应用球形颗粒催化的反应，CMP和CDP杂质含量少，离子交换收率高，且洗脱液纯度很高；而采用游离细胞或手工切割颗粒催化的反应，收率低，且洗脱液纯度只有85%左右。由表4可知，应用球形颗粒催化的反应，结晶收率可在90%以上，且晶体的纯度高达94%以上，完全符合国家的要求；而采用游离细胞的反应，晶体收率低，结晶过程困难，有较多的油状物出现；手工切割颗粒催化的反应，虽然结晶不困难，但是因洗脱液中纯度本来就不高，造成晶体的纯度低下，需要反复结晶才能达到90%以上。除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。权利要求1.一种含有CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)菌株，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号是CGMCCNO.2448。2.才艮据权利要求1所述菌株的筛选方法，其特征是所述方法的步骤包括(l)制作酵母菌悬液，将酵母经培养基活化后放入摇床振荡培养到细胞处于对数生长期后离心回收菌体，加入磷酸盐缓冲液制成菌悬液；(2)将上述菌悬液与诱变剂按1:1容量比混合，3(rC恒温水浴10-50分钟后，混合液稀释至10—3倍~l(T后涂布平板，得到抗性菌抹；(3)将上述抗性菌株经摇床培养24-36小时，用高效液相色谱法检测并筛选出含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌抹。3.根据权利要求2所述菌林的筛选方法，其特征在于摇床的温度为26~36°C，转速为160-300rpm;所述步骤(2)中的诱变剂是2mg/ml的亚硝基胍；所述平板中的培养基含有300jug/ml胞苷三磷酸结构类似物胞苷二磷酸-乙醇胺，所述抗性菌林为胞苷二磷酸-乙醇胺抗性突变抹。4.根据权利要求1所述的菌林在生产胞苷三磷酸中的应用，其特征在于首先利用包埋法以卡拉胶-魔芋多糖复配胶为载体将所述菌种制成固定化细胞后加入合成胞苷三磷酸的反应体系中，再利用离子交换分离纯化的方法分离纯化反应液，结晶得到胞苷三磷酸。5.根据权利要求4所述的菌株在生产胞苷三磷酸中的应用，其特征在于所述包埋法以卡拉胶-魔芋多糖复配胶为载体将所述菌种制成固定化细胞的具体步骤是(i)将卡拉胶钠盐和魔芋粉溶于去离子水中，蒸汽加热到i2rc后保温40~70分钟，倒入反应蒼中自然冷却到40°C，胶液保温，其中k-卡拉胶钠盐与魔芋粉的重量比为2:1;(2)另将生理盐水加入洗涤好的哞酒酵母湿菌体中搅拌均匀制成酵母悬液，35。C保温，其中生理盐水和啤酒酵母湿菌体的重量比为1:4;(3)将步骤(2)中的酵母悬液倒入步骤(1)的胶液中，于40°C下搅拌20~40分钟，使之混勻得到混合物；(4)在带搅拌的反应釜中加入溶剂预热至4(TC,将步骤(3)得到的混合物倒入反应釜，搅拌20-40分钟待混合物形成颗粒，过滤，其中搅拌速度为50-150rpm;(5)将步骤(4)中过滤后的颗粒在氯化钾溶液中浸泡30~90分钟，过滤，再用戊二醛浸泡30-90分钟，用筛网沥尽颗粒表面水分后，装袋至水箱冷藏。6.根据权利要求5所述的菌抹在生产胞苷三磷酸中的应用，其特征在于所述步骤(4)中采用的溶剂为豆油，所述固定化细胞为球状。7.根据权利要求4所述的菌株在生产胞苷三磷酸中的应用，其特征在于所述离子交换分离纯化的方法分离纯化反应液的步骤中采用HZ-1离子交换树脂进行离子交换色谱，并用0.4~1.0mol/L氯化钠溶液每小时以G.2-0.5柱体积进行梯度洗脱，得到胞苷三磷酸洗脱液。8.根据权利要求7所述的菌抹在生产胞苷三磷酸中的应用，其特征在于所述结晶的步骤中将洗脱液在50-7(TC水浴下减压浓缩，加入3倍体积的95%乙醇，于水箱静置过夜后抽滤，将滤饼干燥得到胞苷三磷酸.全文摘要本发明涉及一种含高活力CMP激酶和CDP激酶的啤酒酵母菌的筛选以及该啤酒酵母菌在生产胞苷三磷酸中的应用，属于生物工程
技术领域：
。本发明啤酒酵母菌(Saccharomycescerevisiae)菌株，其在中国普通微生物菌种保藏管理中心的保藏号是CGMCCNO.2448。是利用亚硝基胍(NTG)诱变手段筛选出含高活力CMP激酶，CDP激酶的啤酒酵母菌菌株；在生产胞苷三磷酸的应用中，通过包埋法控制不同搅拌速度，制备各种粒径的以卡拉胶为载体的固定化细胞，与手工切割相比，细胞渗漏少，颗粒规则，强度高，劳动强度小，造粒程序简单，无须复杂的设备和仪器，所使用的豆油为安全无毒的溶剂，适合各种要求，易于回收，适合工业化生产。文档编号C12Q1/04GK101265453SQ20081002390公开日2008年9月17日申请日期2008年4月18日优先权日2008年4月18日发明者周长林,罗众球,邱蔚然,闫蓬勃申请人:中国药科大学;南通秋之友生物科技有限公司