专利名称：一种α-环糊精葡萄糖基转移酶基因的克隆与表达的制作方法
技术领域：
一种a-环糊精葡萄糖基转移酶(简称a-CGT酶)基因的克隆与表达，本发 明属于酶基因工程和酶工程领域。具体地说涉及一种编码软化类芽孢杆菌 CPeam'6^77/ws附acerara) JFB05-01 a-CGT酶的DNA序列及其表达。
背景技术：
CGT酶是一个多功能型的酶，它能催化四种不同的反应三种转糖基化反
应(歧化反应、环化反应和偶合反应)和水解反应。CGT酶通过环化反应能利用 淀粉生产环糊精，这是其工业应用的基础。除了通过环化反应生产环糊精，最 近也用CGT酶催化偶合和歧化反应，转移供体如淀粉或环糊精上的低聚糖到各 种受体分子上，得到各种特殊的低聚糖。通过催化不同受体分子的糖基化反应， 对诸如甜菊苷、橘皮苷、芸香苷、维生素C、鼠李糖、抗坏血酸等进行糖基化， 能显著提高受体分子的功能性、水溶性、对化学物质的稳定性。另外，CGT酶 极限糊精的应用也被发现，它可应用于造纸工业中的表面施胶和涂布，能改善 纸张的书写性能并具有光滑且适于印刷的表面。CGT酶也可用来处理生面团， 通过CGT酶的歧化反应，能增加该面团所制作的焙烤产品的体积。
生产CGT酶的微生物种类众多，有芽孢杆菌、放线菌、微球菌、短杆菌、 曲霉、古细菌等。现在工业上生产环糊精所使用的CGT酶主要来自芽孢杆菌属。 根据环化反应在起始阶段所生成环糊精的主要类型不同，CGT酶可分为ou卩和 Y型CGT酶，即a-、 P-和Y-CGT酶。大部分CGT酶为卩型。
目前，许多CGT酶已经得到了纯化，相应的CGT酶的编码基因(^基因) 得到了克隆。由于能分泌CGT酶的野生菌株的生产能力普遍较低，为了克服野 生菌株的低生产能力，重组大肠杆菌在工业化生产CGT酶中己经在国外得到了
极大的重视。目前，诱导型启动子P^、 Ptae、 Ptrp和PL已经广泛应用于在重组大
肠杆菌中过量生产CGT酶，但是有关利用适宜载体和宿主对CGT酶进行胞外 表达的报道不多，重组CGT酶大多是作为一种包涵体在细胞内部进行积累的， 因此，这种包涵体的活化需要复杂的变性和重折叠等关键过程，不利于工业化 生产。在国内，CGT酶的克隆与表达迄今为止鲜有报道，国内大部分研究者主 要致力于提高原始菌株的酶产量。
环糊精是由六个以上葡萄糖连结而成的具有环状疏水圆锥形结构的低聚糖 非还原性化合物系列，其中最常用的是a-、 P-、 Y-环糊精，它们分别由6、 7、 8 个葡萄糖单元构成。目前，环糊精的工业化生产均采用酶法合成，即在CGT酶催化作用下，通过环化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。由于环糊精能与 许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质如溶解度、稳
定性等，因此在食品、医药、农业、纺织、环保、化妆品、生物技术和分析化 学等领域具有广泛的应用。国际市场对环糊精的年需求已达到IO万吨以上，国 内也已接近万吨；仅制备医药片剂一项需求就达数千吨，而目前环糊精总产量 仅万吨左右，国内仅700余吨，而且绝大部分是P-环糊精，同时有少量的a-环 糊精和混合环糊精。随着应用领域的不断拓展，环糊精的需求量一直在逐年大 幅度增长，目前，环糊精的年增长率达到20% 30%。环糊精在各个工业领域中 的应用比例大致为食品工业80%、医药10%、农药5~10%。
和P-环糊精、Y-环糊精结构相比，ct-环糊精最大的特点是具有更小的环结构 和更小的空腔，因此具有独特的性质和特有的用途。 一般来说，a-环糊精可以复 合具有低分子量的分子或者包接脂肪族的侧链。在食品工业上，能作为天然色 素、香料和维生素等的载体；能稳定食品中的某些成分，防止其挥发，抗氧化、 抗光和热分解等；除去食品中的臭味和苦涩味；使某些食品形成长期稳定的乳 状液等。特别值得注意的是，a-环糊精具有抗过敏作用，可抑制IgE抗体， 一些 含(x-环糊精的保健食品已经面市。食用该类产品可消除过敏，预防支气管哮喘、 过敏性皮炎、鼻炎等症；(x-环糊精也是一种难消化膳食纤维，食后有降血糖的作 用。目前，由于P-环糊精的工业化生产比较成熟，价格较低，因此应用面最广， 但是，许多研究证实，在一些场合(x-环糊精的使用效果明显好于|3-环糊精。但 由于ct-环糊精的价格较高，限制了其广泛的应用。
为了降低a-环糊精的商业成本，首先必须降低cc-CGT酶的生产成本。 尸eam'^d〃ws maceraws是最常用于a-CGT酶的工业化生产，但同样存在生产能 力较低的缺陷。在以前的报道中，重组(x-CGT酶在大肠杆菌中一般定位于胞内 形成包涵体或存在于周质中，不利于重组a-CGT酶的回收与使用。因此，如何 使a-CGT酶基因在大肠杆菌中得到高效的胞外表达，对降低a-CGT酶的生产成 本显得非常重要。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种a-CGT酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨基 酸序列。本发明的另一个目的是提供一种编码该a-CGT酶的DNA分子，所述 的DNA分子具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。
本发明的再一个目的是提供包含本发明基因的表达载体。 本发明的又一个目的是提供包含本发明表达载体的宿主细胞。 本发明的技术方案 一种a-环糊精葡萄糖基转移酶，縮写为a-CGT酶，其 氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
所述的a-环糊精葡萄糖基转移酶的基因，缩写为c^基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
所述的基因的表达方法由软化类芽孢杆菌CPeam'6ac/〃w wacerara) JFB05-01总DNA获得cgf基因SEQ ID NO:l ， eg/基因以质粒pET20b(+)为表达 载体，以￡. cc^BL21(DE3)为表达宿主，实现cg基因的高效表达；
(1 )软化类芽孢杆菌CPea"沾"c/〃usJFB05-01总DNA的提取。
P附acerara JFB05-01菌株在LB液体培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L， NaC110g/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬 浮于500pL Tris-EDTA (三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15pL 溶菌酶，37。C下保温30 min，再加入5^iL RNA酶，37。C下保温30 min，加入30pL 10%SDS (十二烷基硫酸钠)和15^L蛋白酶K, 37。C下保温60 min，加入100pL NaCl (5M)和80mLCTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，65。C下保温20 min，用 700(iL的酚氯仿异戊醇体积比25 : 24 : 1混合溶剂抽提，10000rpm离心， 上清液用700pL的氯仿异戊醇体积比24 : 1抽提，10000rpm离心，上清液用 1400nL体积的冰异戊醇混合，-2(TC沉淀30min， 10000rpm离心，沉淀加200pL 70%乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得到/1 macerara JFB05-01总DNA。
(2) a-CGT酶编码基因的克隆
以P wacerara JFB05-01总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下
划线为酶切位点7Vco I和￡coR I， PCR扩增cgf基因。
弓I物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC - 3'
引物2: 5 ， -CTCgAgAgAATTCggATTTTgCCAgTCCAC 一 3 ，
pcr反应在50pL体系中进行5xPCR缓冲液10 mL， 2.5 mmol/L dNTPs 4
^L， lOpmol/L上下游引物各lpL，模板DNAlpL， Taq酶0.5 (iL，加双蒸水
至总体系50pL;
反应条件为在94 'C变性4min后开始循环，然后94 'C变性lmin， 55 °C 退火lmin， 72。C延伸2min，共35个循环后，再于72 T延伸10min，扩增得到 2061 bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接 产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板， 经37"C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8 10h后提取质粒。命名 为cg/pMD18-Tsimple,将此质粒进行序列测定。
(3) c^基因的改造
以c^/pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，以消除基因内部的脸o I 位点，设计引物
引物3: 5 ， -C認gTgggTCCCAC認g四CCAgCC - 3 ， 弓I物4: 5 ， —ggCTggCCCATJg!gggACCCACATTg — 3'PCR反应在50^L体系中进行，5xPCR缓冲液10 fxL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 ^L， 10 pmol/L上下游引物各1 nL，模板cgf/pMD18-T simple 1 (iL，Taq酶0.5 (iL， 加双蒸水至总体系50pL;
反应条件为在94 'C变性4min后开始循环，然后94 'C变性lmin， 55 "C退 火lmin， 72 "C延伸5min，共35个循环后，再于72 t:延伸10min，将PCR产 物转化E.co// JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100 mg/L氨节青霉素LB 平板，培养挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基，经37'C培养 过夜，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定。
(4) cg基因在表达载体上的构建 用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有评/B信号肽和His-tag标记，
将pET20b(+)质粒和扩增的基因进行iVco I和五coR I双酶切，酶切产物割胶 回收后，再用T4连接酶16。C连接过夜，连接产物转化五.co/z'JM109感受态细胞， 经37'C培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后 抽提质粒，得到富集的cg/pET20b(+)质粒(图l)。
(5) 大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌
将质粒cgf/pET20b(+)热击转化co//BL21 (DE3)宿主菌，再100 mg/L氨苄 青霉素-LB平板上经37。C培养过夜，挑选含质粒cgf/pET20b(+)的￡. co// BL21 (DE3)转化子在LB培养基中37'C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(甘 油5g/L，蛋白胨12g/L,酵母膏24g/L， K2HP04 12.54 g/L， KH2P042.31 g/L)， 3(TC培养至OD达0.6后用终浓度O.Ol一IPTG (异丙基硫代-(3-D-半乳糖苷)诱 导，降温至25。C培养，90h时产a-CGT酶达22.5U/mL。
(6) 重组a-CGT酶的纯化和特性。 将上述a-CGT酶发酵液于4 。C、 10000 rpm离心20min除菌体；上清液中
加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4 。C、 10000 rpm离心20min，取沉淀物用适量 含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH7.4的缓冲液A溶解，并在缓 冲液A中透析过夜后，通过0.22(im膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A 平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20-480mM 咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速l mL/min，检测波长为280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在50 mM磷酸钠缓冲液(p1^6) 中透析过夜后，得纯化a-CGT酶酶制品。纯化后重组a-CGT酶达到电泳纯，表观 分子量70000道尔顿。纯化过程电泳图见图2。
本发明的有益效果本发明提供了 基因的高效表达方法。提取P wacera"s JFB05-01总DNA，设计引物PCR得到编码a-CGT酶的基因，它具有 SEQIDNO:l所示的核苷酸序列，全长2061个核苷酸，编码687个氨基酸。以 质粒pET20b(+)为表达载体，以五.co/ZBL21(DE3)为表达宿主，可实现cgf基因的高效表达，重组酶具有环化活性。该a-CGT酶的最适温度为40~45°C，最适 pH5.5，在4(TC下具有较高的热稳定性，在5(TC以上热稳定性较差。此酶适合 食品、医药等工业应用的需要，能用于a-环糊精和卩-环糊精的工业生产。 生物材料样品保藏
软化类芽孢杆菌CPeam'Z)a"7/w wacerara) JFB05-01已保藏于中国典型培养 物保藏中心，简称CCTCC，保藏日期2008年4月24日，保藏编号CCTCCNO: M 208063 。
图1用于生产重组a-CGT酶的c^/pET20b(+)质粒。
图2重组a-CGT酶分离纯化SDS-PAGE图谱。
1、发酵上清液；M、标准蛋白分子量；2、通过Ni柱纯化后样品。
图3重组a-CGT酶最适温度(以可溶性淀粉为底物)。
图4重组a-CGT酶最适pH (以可溶性淀粉为底物)。
pH3-6，使用柠檬酸缓冲液；pH6-8，使用磷酸钠缓冲液；pH8-11,使用甘 氨酸/氢氧化钠缓冲液。
图5重组a-CGT酶在40°C ( )， 45°C O)和50°C (A)下的稳定性研究(以可 溶性淀粉为底物)。
具体实施例方式
实施例1
本实施例说明软化类芽孢杆菌(尸eam'k cz7/w macerara) JFB05-01总DNA的提取。
wacerara JFB05-01菌株在LB液体培养基(蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L， NaCUOg/L)中培养2天，10000rpm离心收集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬 浮于500nL Tris-EDTA (三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)缓冲液，加入15pL 溶菌酶，37。C下保温30 min，再加入5pLRNA酶，37匸下保温30 min，加入30pL 10%SDS (十二烷基硫酸钠)和15pL蛋白酶K， 37t:下保温60min，加入lOO^L NaCl (5M)和80^iLCTAB (十六烷基三甲基溴化铵)，65。C下保温20 min，用 700pL的酚氯仿异戊醇体积比25 : 24 : 1混合溶剂抽提，10000rpm离心， 上清液用700nL的氯仿异戊醇体积比24 : 1抽提，10000rpm离心，上清液用 1400nL体积的冰异戊醇混合，-20°(:沉淀301^11， 10000rpm离心，沉淀加200|iL 70%乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即为P JFB05-01总DNA。 实施例2
本实施例说明a-CGT酶编码基因的克隆程序。
以P Amjrcerara JFB05-01总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点iVco I和￡coR I， PCR扩增eg基因。
引物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC - 3 ， 引物2: 5 ， "CTCgAgAgMEIQggATTTTgCCAgTCCAC — 3 ，
PCR反应在50^L体系中进行5xPCR缓冲液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 pL，
10 (imol/L上下游引物各1 pL,模板DNA 1 (iL， Taq酶0.5 pL，加双蒸水至总
体系50 ^L;
反应条件为在94'C变性4min后开始循环，然后94'C变性lmin， 55 "C退 火lmin， 72'C延伸2min，共35个循环后，再于72 。C延伸10min。扩增得到大 约2100bp的PCR片段，割胶回收。回收片断与pMD18-T simple载体连接，连 接产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨节青霉素的LB平板。 经37。C培养过夜，平板上长了大约十几个菌落，挑四个菌落，接入LB液体培 养基，10h后提取质粒。将此质粒进行序列测定，结果表明插入片段含有一个 长2061bp的开放阅读框(ORF)，编码一个由687个氨基酸编码的蛋白质。
实施例3
本实施例说明c^基因的改造程序。
由于在目标基因内部存在一个^co I酶切位点，而基因两端分别为iVco I和 五"RI位点，所以设计引物将iVcoI位点突变去除，以方便下步的克隆表达。 以连接了 c^基因的pMD18-T simple载体为模板进行定点突变PCR，设计引物
引物3: 5 ， ~CAATgTgggTCCCAQAATgggCCAgCC _ 3 ，
弓l物4: 5,-ggCTggCCCATIglgggACCCACATTg- 3'
PCR反应在50nL体系中进行，5xPCR缓冲液10|iL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 HL， 10 pmol/L上下游引物各1 &，模板cg/pMD18-T simple 1 |iL，Taq酶0.5 jiL， 加双蒸水至总体系50piL;
反应条件为在94。C变性4min后开始循环，然后94 。C变性lmin， 55 。C退 火lmin， 72。C延伸4min，共35个循环后，再于72"C延伸10min。将PCR产 物转化Eco// JM109感受态细胞。转化后的菌体涂布100 mg/L氨苄青霉素LB 平板，挑选单菌落接入100 mg/L氨苄青霉素LB液体培养基经37"C过夜培养， 抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定，结果正确，验证了已经成功突变去 除WcoI位点。
实施例4
本实施例说明cg基因在表达载体上的构建程序。
用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pe氾信号肽和His-tag标记。 将pET20b(+)质粒和cg 基因进行AAco I和&oR I双酶切，酶切产物割胶回收后， 再用T4连接酶16。C连接过夜，连接产物转化JM109感受态细胞，经37 'C培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后抽提质粒，得到富集的c^/pET20b(+)质粒(图l)。 实施例5
本实施例说明大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌的程序。
将质粒cg/pET20b(+)热击转化co// BL21 (DE3)宿主菌，再氨苄青霉素 (100 mg/L)-LB平板上经37。C培养过夜，挑选转化子(含c^/pET20b(+)的五.co// BL21 (DE3))在LB培养基中37'C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基(甘 油5g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏24g/L, K2HP04 12.54 g/L， KH2P042.31 g/L) 30。C培养至OD达0.6后用终浓度0.01 ^MIPTG (异丙基硫代-P-D-半乳糖苷) 诱导，降温至25-C培养，90h时产酶达22.5U/mL。
实施例6
本实施例说明a-CGT酶的纯化和特性。
将上述a-CGT酶发酵液于4 'C、 10000 rpm离心20 min除菌体；上清液中 加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4 °C、 10000 rpm离心20min,取沉淀物用适量 含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在缓 冲液A中透析过夜后，通过0.22pim膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓冲液A 平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含20-480mM 咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速l mL/min，检测波长为280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在50 mM磷酸钠缓冲液(p1^6) 中透析过夜后，得纯化a-CGT酶酶制品。纯化后重组a-CGT酶达到电泳纯，表观 分子量70000道尔顿。纯化过程电泳图见图2。
以可溶性淀粉为底物时，a-CGT酶的最适温度为40 45'C (图3)，最适pH 5.5 (图4),在4(TC下具有较高的热稳定性，在50°C以上热稳定性较差(图5)。序歹寸表
SEQIDNO: 1
tcacccgatacgagcgtggacaacaaggtc￡L￡LtttC￡Lgta<cggacgtcatctatcaigatt60
gtgaccgaccgcttcgcggacggggacaggacgaacaatccggcgggggatgcgttcagc120
ggcgaccgatcc犯tttgaagctctatttcggggg卿ctggcaggggattatcgacaag180
attaacgacggttatttgaccggcatgggcgtcaccgccctctggatatcccagcctgtg240
gaa犯t8tcEicctccgtcatcaagtattccggcgtt已已caatacgtcttatcacggttac300
tgggcgagggattttaagcagctttcggggattttgccgattttcaaaat360
ctgattgatacggctcacgctC3t犯C3tC卿gtcgtg已tcgacttcgcCCCC38CCEIC420
acgtctccggccgacagggacaaccccggcttcgccgagaacggtgcgctgtstgataac480
ggttcgctgctcggcgcctacagcaalgatacggccggccttttccatcataacgggggg540
accgatttttccacgattga3gacggtatttaca^gaacctctacgacctggcggacatc600
aaccataacaac犯cgctatggacgcttatttt犯a3gcgctatcgacctttggctcggc660
atgggtgtggacgggattcgttttgacgcggtg犯gcatatgcctttcggctggcaaaaa720
agcttcgtttcctcgatttacggcggcgatcatccggtatttacgttcggggaatggtat780
cttggcgcggatcaaaccga3tt犯attcgccaacgaaagcgggatgaac840
ctgctggactttgaatacgcgc已gg鄉tgcgcgaagtgttccgggacaaaacggaaeicg900
atgaaggatctctatgaggtgctggccagcacggagtcgcaatacgactscatcaacaat960
stggtgaccttcatcgscaaccatgatatggaccggttccaggttgccggttccggtacg1020
cgggcgaccgagcaagcgttggcgctgacgctgacttcccgcggcgtgccagccatctac1080
t￡lCggC3Cgg￡LgC￡LgtELC3tgaccggcgstggcgacccca3caaccgggcg3tg3tg3CC1140
tcgtttaataccgggacgacggctt3ta^gtgattcaggcattggcgccgctgcgtaaa1200
tccaatccggccatcgcttatgggacgacgacagagcgctgggttaacaacgatgtgttg1260
eittgittg^cgC肪3ttCggcagcagcgccgctttggtggcgattaatcgaaactcgtcc1320
gccgcttatccgatttcgggtctgttgagttcgctgccggcgggcacttattcggatgta1380
ttgaacggactctt犯eicggc已actccattaccgtgggcagcggcggcgccgtcaccaac1440
tttacgctggcggccggcggcacggcggtatggcagtacacagcgccggaaacgtcgccg1500
gcgatcggca3tgtgggtCCcaccatgggccagccggggaatateigtgacgattgacggc1560
cgcggctttggcggcacggcgggcacggtttatttcgggacgacggcggtgaccggctcc1620
ggcatcgtaagctgggaggacacgcagatt33ggCggtC3t3CCg33ggtcgcggcgggc1680
aa,gggcgtatcggtcaaaacgtcgtccggcaccgccagcaatacattcaaaagcttc1740
aatgtactgacgggggatcaggtcacggtgcgtttcctggtcaatcaagccaataccaat1800
tacggaacaaatgtttatcttgtcggcaacgccgccgagctcggctcctgggacccgaac1860
aaagcgattgggccgatgtacaatcaggtgatcgccaagtacccgtcctggtattacgat1920gtcagcgtgc cggcggggac aaagctggat gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg gtgacggtgg actggcaaaa t
tttaaattta ttaaaaaggg cggcggtacg 1980 tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040
2061
SEQ ID NO: 2
Ser Pro Asp Thr Ser 5
Val lie Tyr Gin lie 20
Thr Asn Asn Pro Ala 35
Leu Lys Leu Tyr Phe 50
lie Asn Asp Gly Tyr 65
lie Ser Gin Pro Val 80
Gly Val Asn Asn Thr 95
L>ys Gin Thr Asn Asp 110
Leu lie Asp Thr Ala 125
Phe Ala Pro Asn His 140
Phe Ala Glu Asn Gly 155
Ala Tyr Ser Asn Asp 170
Thr Asp Phe Ser Thr 185
Asp Leu Ala Asp lie 200
Phe Lys Ser Ala lie 215
Val Asp Asn Lys Val 10
Val Thr Asp Arg Phe 25
Gly Asp Ala Phe Ser 40
Gly Gly Asp Trp Gin 55
Leu Thr Gly Met Gly 70
Glu Asn lie Thr Ser 85
Ser Tyr His Gly Tyr 100
Ala Phe Gly Asp Phe 115
His Ala His Asn lie 130
Thr Ser Pro Ala Asp 145
Ala Leu Tyr Asp Asn 160
Thr Ala Gly Leu Phe 175
lie Glu Asp Gly lie 190
Asn His Asn Asn Asn 205
Asp. Leu Trp Leu Gly 220
Asn Phe Ser Thr Asp 15
Ala Asp Gly Asp Arg 30
Gly Asp Arg Ser Asn 45
Gly lie lie Asp Lys 60
Val Thr Ala Leu Trp 75
Val lie Lys Tyr Ser 90
Trp Ala Arg Asp Phe 105
Ala Asp Phe Gin Asn 120
Lys Val Val lie Asp 135
Arg Asp Asn Pro Gly 150
Gly Ser Leu Leu Gly 165
His His Asn Gly Gly 180
Tyr Lys Asn Leu Tyr 195
Ala Met Asp Ala Tyr 210
Met Gly Val Asp Gly 225
12lie Arg Phe Asp Ala 230Ser Phe Val Ser Ser 245Phe Gly Glu Trp Tyr 260lie Lys Phe Ala Asn 275Tyr Ala Gin Glu Val 290Met Lys Asp Leu Tyr 305Asp Tyr lie Asn Asn 320Asp Arg Phe Gin Val 335Ala Leu Ala Leu Thr 350Tyr Gly Thr Glu Gin 365Arg Ala Met Met Thr 380Val lie Gin Ala Leu 395Ala Tyr Gly Thr Thr 410lie lie Glu Arg Lys 425Asn Arg Asn Ser Ser 440Ser Leu Pro Ala Gly 455Asn Gly Asn Ser lie 470Val Lys His Met Pro 235lie Tyr Gly Gly Asp 250Leu Gly Ala Asp Gin 265Glu Ser Gly Met Asn 280Arg Glu Val Phe Arg 295Glu Val Leu Ala Ser 310Met Val Thr Phe lie 325Ala Gly Ser Gly Thr 340Leu Thr Ser Arg Gly 355Tyr Met Thr Gly Asp 370Ser Phe Asn Thr Gly 385Ala Pro Leu Arg Lys 400Thr Glu Arg Trp Val 415Phe Gly Ser Ser Ala 430Ala Ala Tyr Pro lie 445Thr Tyr Ser Asp Val 460Thr Val Gly Ser Gly 475Phe Gly Trp Gin Lys 240His Pro Val Phe Thr 255Thr Asp Gly Asp Asn 270Leu Leu Asp Phe Glu 285Asp Lys Thr Glu Thr 300Thr Glu Ser Gin Tyr 315Asp Asn His Asp Met 330Arg Ala Thr Glu Gin 345Val Pro Ala lie Tyr 360Gly Asp Pro Asn Asn 375Thr Thr Ala Tyr Lys 390Ser Asn Pro Ala lie 405Asn Asn Asp Val Leu 420Ala Leu Val Ala lie 435Ser Gly Leu Leu Ser 450Leu Asn Gly Leu Leu 465Gly Ala Val Thr Asn 480Phe Thr Leu Ala Ala 485Pro Glu Thr Ser Pro 500Gin Pro Gly Asn lie 515Thr Ala Gly Thr Val 530Gly lie Val Ser Trp 545Lys Val Ala Ala Gly 560Gly Thr Ala Ser Asn 575Asp Gin Val Thr Val 590Tyr Gly Thr Asn Val 605Ser Trp Asp Pro Asn 620lie Ala Lys Tyr Pro 635Gly Thr Lys Leu Asp 650Val Thr Trp Glu Gly 665Ser Gly Val Gly Thr 680Gly Gly Thr Ala Val 490Ala lie Gly Asn Val 505Val Thr lie Asp Gly 520Tyr Phe Gly Thr Thr 535Glu Asp Thr Gin lie 550Lys Thr Gly Val Ser 565Thr Phe Lys Ser Phe 580Arg Phe Leu Val Asn 695Tyr Leu Val Gly Asn 610Lys Ala lie Gly Pro 625Ser Trp Tyr Tyr Asp 640Phe Lys Phe lie Lys 655Gly Gly Asn His Thr 670Val Thr Val Asp Trp 685Trp Gin Tyr Thr Ala 495Gly Pro Thr Met Gly 510Arg Gly Phe Gly Gly 525Ala Val Thr Gly Ser 540Lys Ala Val lie Pro 555Val Lys Thr Ser Ser 570Asn Val Leu Thr Gly 585Gin Ala Asn Thr Asn 600Ala Ala Glu Leu Gly 615Met 'Tyr Asn Gin Val 630Val Ser Val Pro Ala 645Lys Gly Gly Gly Thr 660Tyr Thr Thr Pro Ala 675Gin Asn 68权利要求
1. 一种α-环糊精葡萄糖基转移酶，缩写为α-CGT酶，其氨基酸序列如SEQID NO2所示。
2、 一种编码权利要求1所述的a-环糊精葡萄糖基转移酶的基因，縮写为 基因，其核苷酸序列如SEQIDNO:l所示。
3、 一种如权利要求2所述的a-环糊精葡萄糖基转移酶基因的表达方法，其 特征是由软化类芽孢杆菌CPeam'6acz'〃w macerara) JFB05-01总DNA获得c^基 因SEQ ID NO: 1 ， 基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以co// BL21 (DE3) 为表达宿主，实现c^基因的高效表达；(1) 软化类芽孢杆菌CPeam'6a"7/w w"cerara) JFB05-01总DNA的提取尸macera似JFB05-01菌株在LB液体培养基中培养2天，10000rpm离心收 集菌体，无菌水洗涤，收集沉淀悬浮于50(HiLTris-EDTA缓冲液，加入15pL溶 菌酶，37。C下保温30min，再加入5^iLRNA酶，37。C下保温30 min，加入30pL 10%十二垸基硫酸钠溶液和15i!L蛋白酶K,37-C下保温60min，加入100pL5M 的NaCl溶液和80^L十六烷基三甲基溴化铵，65'C下保温20 min，用700pL的 酚氯仿异戊醇体积比25 : 24 : 1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用 700pL的氯仿异戊醇体积比24 : 1混合溶剂抽提，10000rpm离心，上清液用 1400pL体积的冰异戊醇混合，-20°(:沉淀301^11， 10000rpm离心，沉淀加200(iL 70%乙醇清洗，10000rpm离心，沉淀用Tris-EDTA缓冲液溶解，即得到P wacerara JFB05-01总DNA;(2) a-CGT酶编码基因的克隆以P macerara JFB05-01总DNA为模版，以下列核苷酸序列作为引物，下划线为酶切位点7Vco I和五coR I， PCR扩增cg基因；引物1: 5 ， -CCATATgTCCATggATTCACCCgATACgAgC — 3 ，引物2: 5 ， "CTCgAgAgMIICggATTTTgCCAgTCCAC - 3 ，PCR反应在50^L体系中进行5xPCR缓冲液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4HL， 10 ^irnol/L上下游引物各1 ^L，模板DNA 1 ^L， Taq酶0.5 pL，加双蒸水至总体系50 ^L;反应条件为在94。C变性4min后开始循环，然后94 。C变性lmin， 55 °C 退火lmin， 72T:延伸2min,共35个循环后，再于72'C延伸10min，扩增得到 2061 bp的PCR片段，割胶回收，回收片断与pMD18-T simple载体连接，连接 产物转化大肠杆菌JM109，转化产物涂布含100 mg/L氨苄青霉素的LB平板， 经37'C培养过夜，挑选菌落，接入LB液体培养基，8 10h后提取质粒，命名 为cg/pMD18-T simple,将此质粒进行序列测定；(3) C^基因的改造以cg/pMD18-T simple为模板进行定点突变PCR，以消除基因内部的7Vco I位点，设计引物引物3: 5，—CAATgTgggTCCCACAATgggCCAgCC —3，弓l物4: 5， -ggCTggCCCATIglgggACCCACATTg- 3'PCR反应在50nL体系中进行，5xPCR缓冲液10 pL， 2.5 mmol/L dNTPs 4 ^iL， 10 )imol/L上下游引物各1〖iL，模板cgf/pMD18-T simple 1 |iL，Taq酶0.5 )iL， 加双蒸水至总体系50 ^L;反应条件为在94 。C变性4min后开始循环，然后94 。C变性lmin， 55 'C退 火lmin， 72 。C延伸5min，共35个循环后，再于72 。C延伸10min，将PCR产 物转化五.co" JM109感受态细胞，转化后的菌体涂布100 mg/L氨苄青霉素LB 平板，培养挑选单菌落接入100mg/L氨苄青霉素LB液体培养基，经37i:培养 过夜，抽提质粒，将突变后的质粒进行序列测定；(4) c-基因在表达载体上的构建 用于构建表达载体的质粒是pET20b(+)，带有pe/B信号肽和His-tag标记，将pET20b(+)质粒和扩增的基因进行7Vco I和￡coR I双酶切，酶切产物割胶 回收后，再用T4连接酶16"C连接过夜，连接产物转化五.co//JM109感受态细胞， 经37'C培养过夜，挑选转化子于100mg/L氨苄青霉素LB进行液体培养，然后 抽提质粒，得到富集的cg/pET20b(+)质粒；(5) 大肠杆菌宿主转化和筛选重组菌将质粒cg/pET20b(+)热击转化￡. co// BL21 (DE3)宿主菌，再100 mg/L氨苄 青霉素-LB平板上经37。C培养过夜，挑选含质粒crg/pET20b(+)的co// BL21 (DE3)转化子在LB培养基中37'C液体培养过夜，后接入TB发酵液体培养基， 3CTC培养至OD达0.6后用终浓度0.01 异丙基硫代-P-D-半乳糖苷诱导，降温 至25。C培养，90h时产a-CGT酶达22.5 U/mL;(6) 重组a-CGT酶的纯化和特性 将上述a-CGT酶发酵液于4。C、 10000 rpm离心20min除菌体；上清液中加入70%固体硫酸铵盐析过夜，4'C、 10000 rpm离心20min，取沉淀物用适量 含20mM磷酸钠、0.5M氯化钠、20mM咪唑、pH 7.4的缓冲液A溶解，并在 缓冲液A中透析过夜后，通过0.22pm膜过滤后制成上样样品；Ni亲和柱用缓 冲液A平衡后，将上样样品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分别用缓冲液A、含 20-480 mM咪唑的缓冲液A、含480mM咪唑的缓冲液A洗脱，流速1 mL/ min， 检测波长为280 nm，分部收集含a-CGT酶酶活的洗脱液；活力组分在pH-6、 50 mM磷酸钠缓冲液中透析过夜后，得纯化a-CGT酶酶制品。
全文摘要
一种α-环糊精葡萄糖基转移酶(简称α-CGT酶)基因的克隆与表达，属于酶基因工程和酶工程领域。本发明由软化类芽孢杆菌(Peanibacillus macerans)JFB05-01总DNA获得cgt基因SEQ ID NO1，cgt基因以质粒pET20b(+)为表达载体，以E.coli BL21(DE3)为表达宿主，实现cgt基因在胞外的高效表达；该cgt基因全长2061个核苷酸，编码687个氨基酸，构建了原核表达质粒，转化大肠杆菌表达α-CGT酶。重组酶具有环化活性，能转化淀粉及相关基质成环糊精。该重组α-CGT酶的最适温度为40～45℃，最适pH 5.5，在40℃下具有较高的热稳定性，在50℃以上热稳定性较差。此酶适合食品、医药等工业应用的需要，能用于α-环糊精和β-环糊精的工业生产。
文档编号C12N9/10GK101294149SQ20081002416
公开日2008年10月29日 申请日期2008年5月14日 优先权日2008年5月14日
发明者敬 吴, 成 成, 彬 李, 李兆丰, 坚 陈 申请人:江南大学