ATCTG GGTGGTGGCATCATCAGCATCAAGGTTAACATAATCCTACACACGGTACTTGGGTATATTCTCACACACTCGATTGA TGTAAAGAATATTTAAAGACAACAACATAGGGCAACAGCGGTTAAAAAAACCACATGACGTATGAGCAAGTGGCAAA TCAATACTTTATCTAGTTATGTTAAGCAAAAAATAACAATAAATCAACTTTTTTTTGAAGGTTAAGAGTTTACGCAA TTTTCTTGAGCGGAAAAAGCGGAAAAAATGTAAGTATGCATAAATTCTAAATATATCAACAACTGTACATTTTCTGG AGTACTACTACCAGGCAAGAAAGTAGGTTGATAAAGCTATGCACAAGATCTTGTTTGGGTGCAGGGAAAGTTCAACT TAATCGCTCAATTTGAGATCGCCTGGTCGCTTGAGATTCGACTGTAATTGAAATTTTTGCTTTTGATCGGAGCCAGA CTTCAGACGGGGCAAACAAAAAGACTTTGTTGGTGGTAGGGTAGGATCCGTTGACCTGCAGGTCGACGAATTCAACC CCTTGTGTCATGTCGGCGACCCTACGCCCCCAACTGAGAGAACTCAAAGGTTACCCCAGTTGGGGCACTACTCCCGA AAACCGCTTCTGACCTGGGCCGCGGGGGAAATTAATTAAATTATTGTTTTAAGTATGATAGTAAATCACATTATTGA TAGCTAGCAGCAGCACTAGCCTCACTAGCACCACTGGCAACACATGGCTTTCAGGACCCGCTGGACCACACACACAC GGGCAATGGTATGACCTGCTTGCCACTTGTTGTGCGTCGGCTGACCTTTTGATATTGCCCAAGGAGACCAAGTTGGA GTGGGGGAGGATGACAGCAGGATCAAGGTTCATAGCCTGGCGGCTCCTTTCATAAGCAATTAGAATCAATGAGCAAG GACACTCGGCTCCGTTTCCTTTCCATCGCCCTTTTGTCCTGCCGCAATCTTTATGGGCCGCCACCAAAAGTCACAAT ATTGTGACTCGACTGCGTGTGTGGGAAAGAGGCGTGGCATCTTGTAATTGTAGATGGAAATTAAATGAACAACTGAC AGCCGGTCGCACCCAAAGTGTCTATCTGTCTGTATGTGTGGGAAACTTGAAAGGGAAAATCCCTCTAGAGCCGCTAA AGACATGCAAAAAAAAAAAAAACATGAACATGAAGAAAATGAAGTATGAAAAAGGAACCGAAGAGAGAGAGCAAATC TTGGCAAGAAAACTTAATTGTCTTGGCCCGTTTTGGTTGGCTGATCGGGCCAAAAGCATTTTCTTCTCGGTCTTTGG GGCAGTTTCGTTATGTTTCGGGGAAAACTGGTTGCTGGCCATAATGGCAGCTCACGGATACACACTTTGACGGCCAG GCTTGTCTTAACTGATGATGCTAACTTGCTGGCCGTTCAGTGTTTTTTTTTTTTTTCTTTTTTTCAATTAGGCCCGC GCTCAGGTTTTAGCCCGGCATTTAATTCATCTTTGCCAGTTTGCCTGTTGCCCGTTTGCCTGCTTCTCCAACAGTCT CGGCCAGTTTGTGCTGCCTGAGAAACGCTTTGGGTGTCGTATCATCAATTCGTTTAATTTGACAGGCGCAAACCTAA ACATGTCAAAACAACAGCCATGCGGTTAGTAGTGGTGGTTGCCGCCTCTGGAGCCGACTTTTCGGGTTC
[0238] 供体DNA构建：
[0239] lkb上游同源臂_CCCCGTAAT*+attPl+yellow基因调控区和编码区+attP2+PAM2位 点突变-lkb下游同源臂
[0240] 实施例3.制备重组酶复合物
[0241] 从DH5alpha菌株基因组中克隆来源于大肠杆菌（E. coli)的4种重组因子，合称 OFAR(Rec〇、RecF、RecA、ReCR)的读码框序列。测序验证后再经过哺乳动物密码子优化，分别 加入核序列（nucleus localization sequence)。然后于整段序列之上游加入SP6启动子 序列（ATTTA GGTGA CACTA TAGAA，SEQ ID N0:14)，利用体外转录试剂盒（mMESSAGEmMACHINE T7/SP6kit，Life Technologies)以及转录载体 pSP73(Promega，USA)得到加帽（capped) 及加 polyA的mRNA，混合后于-80°C冻存，工作浓度为100ng/ul。
[0242] 实施例4.基因重组组合物导入昆虫细胞
[0243] 为方便起见，本实施例采用显微注射或电转法将本发明的基因重组组合物导入昆 虫细胞（受精卵）中。重组酶复合物终mRNA浓度为100ng/ul ;sgRNA终浓度为50ng/ul ; 切口酶mRNA100ng/ul ;cas9mRNA100ng/ul ;供体DNA300ng/ul。显微注射的幼虫存活率~ 10%，电转法的存活率为~30%。
[0244] 实施例5.制备转基因果蝇品系
[0245] 由昆虫细胞（受精卵）衍生发育成为个体、并与yellow缺陷型果蝇回交得到可以 稳定遗传的转基因果蝇品系F1代。
[0246] 实施例6.确定定点整合的效率
[0247] 组合物进入昆虫早期胚胎细胞（如受精卵）后，随着胚胎的发育，组合物被随机分 配入极少数生殖前体细胞引发基因重组，发育为F0个体；再通过遗传学回交一代，即F1代， 产生可能产生转基因阳性个体。该实例中，转基因整合率只计算发生在生殖细胞的基因重 组事件，即携带有发生基因重组事件的生殖细胞的个体的比例。发明人利用引入的整合 盒子上yellow标记基因对F1代果蝇进行阳性筛选，发生基因敲入整合的果蝇个体呈现黑 体性状（附图4)。
[0248] 发明人同时利用整合位点位于内源基因 Hh基因的5'引物与位于敲入基因 yellow 内的 3' 引物（正向引物：5' -AACAAAAGACAGCAGCAACATTGGTAAGAGC-3' - SEQ ID N0:15 ;反 向引物：5'-TGGTAATCGGGCGATAATCA?TTAATAGTCGA-3'-SEQIDN0:16)来PCR鉴定。取每 只Η)的后代果蝇F1代50~80只进行鉴定，鉴定出阳性条带为携带敲入基因的子代果蝇， 推导出F0的生殖细胞阳性基因整合效率，鉴定结果见表1。可见切口酶配合四个重组酶可 以实现很商的定点基因敲入效率。
[0249] 表1.基因敲入效率表，其中切口酶为：Cas9_D10A
[0251] 其中，"两个单链缺口 "表示利用基因工程突变的Cas9_D10A产生单链缺口，从 而诱发同源整合；"Cas9"表示利用野生型Cas9产生双链缺口（DSB)，从而诱发同源整合； "0FAR"表示利用4种重组因子，即，RecO、RecF、RecA、RecR的复合物；"RecA"表示单独利 用重组因子RecA。
[0252] 讨论：
[0253] 首先，本发明比较了利用野生型Cas9以及基因工程突变的Cas9_D10A诱发同源整 合的效率。从实施例的结果可以看出，利用野生型Cas9产生双链缺口以及两个单链缺口联 用几乎无法诱发同源整合。
[0254] 其次，从实施例的结果可以看出，0FAR酶与协同单链缺口联用诱发同源重组整合 的效率显著提高到25%之上，而0FAR酶与野生型Cas9制造的DSB联用效率低于2%，从而 证明0FAR酶与协同单链缺口联用可以诱发高效的同源重组敲入整合。
[0255] 第三，由此数据可以发现在没有完整的4个recOFAR组合，例如只有重组酶recA 存在的情况下，敲入效率明显下降。
[0256] 综上所述，本实施例证明，本发明的体系能实现的同源重组整合效率远高于包括 现有技术在内的其他组合。
[0257] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种用于昆虫定点基因敲入的重组因子组合物，所述重组因子组合物由重组因子 RecA、RecO、RecF和RecR中的一种或多种组成或由所述重组因子的编码多核苷酸中的一种 或多种组成， 其中，所述重组因子RecA是： ⑴氨基酸序列如SEQIDN0:3所示的蛋白；或 (ii)由SEQIDNO:3所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDN0:3所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋白；或 者 所述重组因子RecA的编码核苷酸序列是： (i) 如SEQIDN0:4所示的核苷酸序列；或 (ii) 由SEQIDNO:3所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的且具有氨1基酸序列如SEQIDN0:3所不蛋白功能的衍生蛋白的编码序列； 所述重组因子RecO是： ⑴氨基酸序列如SEQIDN0:5所示的蛋白；或 (ii)由SEQIDNO:5所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDN0:5所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋白；或 者 所述重组因子RecO的编码核苷酸序列是： (i) 如SEQIDN0:6所示的核苷酸序列；或 (ii) 由SEQIDNO:5所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的且具有氨1基酸序列如SEQIDN0:5所不蛋白功能的衍生蛋白的编码序列； 所述重组因子是RecF是： ⑴氨基酸序列如SEQIDN0:7所示的蛋白；或 (ii)由SEQIDNO:7所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDN0:7所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋白；或 者 所述重组因子RecF的编码核苷酸序列是： (i) 如SEQIDN0:8所示的核苷酸序列；或 (ii) 由SEQIDNO:7所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的且具有氨1基酸序列如SEQIDN0:7所不蛋白功能的衍生蛋白的编码序列； 所述重组因子RecR是： ⑴氨基酸序列如SEQIDN0:9所示的蛋白；或 (ii)由SEQIDN0:9所示氨基酸序列经过一个或少数几个氨基酸残基的取代、缺失或 添加而形成的且具有氨基酸序列如SEQIDN0:9所示的蛋白功能的由（i)衍生的蛋白；或 者 所述重组因子RecR的编码核苷酸序列是： (i) 如SEQIDNO: 10所示的核苷酸序列；或 (ii) 由SEQIDN0:9所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加 而形成的且具有氨1基酸序列如SEQIDN0:9所不蛋白功能的衍生蛋白的编码序列。2. 如权利要求1所述的重组因子组合物，其特征在于，所述重组因子组合物由重组因 子RecA、RecO、RecF和RecR组成或由所述重组因子的编码多核苷酸组成。3. -种用于昆虫定点基因敲入的组合物，所述组合物包含以下组分： 1) .单切口酶或其编码多核苷酸； 2) .重组因子或其编码多核苷酸；和 3) .任选的，包含外源性基因的供体DNA。4. 如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述重组因子是RecA、RecO、RecF和RecR 中一种或多种的组合；优选地，所述重组因子是RecA、RecO、RecF和RecR的组合。5. 如权利要求2-4中任一项所述的组合物，其特征在于，所述组合物由以下部分组成： 1) .单切口酶Cas9-D10A或其编码多核苷酸； 2) .重组因子RecA、RecO、RecF和RecR的组合或所述重组因子的编码多核苷酸的组合 物； 3) .根据欲加以改造的昆虫DNA序列设计的两种或两种以上的sgRNA;和 4) .任选的，包含外源性基因的供体DNA。6. -种昆虫细胞定点基因敲入的方法，所述方法包括： 1) .利用单切口酶或其编码多核苷酸在欲加以改造的DNA序列上产生双重单链缺口或 多对双重单链缺口；和 2) .利用重组因子将外源性基因敲入昆虫细胞的基因组。7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述重组因子是RecA、RecO、RecF和RecR 中一种或多种的组合。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述重组因子是RecA、RecO、RecF和RecR 的组合。9. 一种制备转基因昆虫细胞或个体的方法，所述方法包括以下步骤： 1) .利用权利要求3-5中任一项所述的组合物将外源性基因导入昆虫细胞；和 2) .由得到的细胞衍生的昆虫个体或品系。10. 权利要求1-5中任一项所述的组合物在昆虫细胞定点基因敲入或制备转基因昆虫 动物中的用途。
【专利摘要】本发明提供了一种用于昆虫定点基因敲入的组合物，所述组合物包含单切口酶或其编码多核苷酸；重组因子或其编码多核苷酸；和任选的，包含外源性基因的供体DNA。本发明还提供了相应的基因敲入方法以及制备转基因昆虫的方法。本发明的组合物及方法能在昆虫细胞中实现高效的同源重组整合，同时又能够避免现有基因敲入技术中的种种缺点，还能在昆虫细胞中稳定、高效地同源重组整合长达10kb以上片段，从而能在昆虫细胞中移入遗传学筛选标记，优选可视性的遗传学筛选标记，从而便于转基因昆虫品系的确立。
【IPC分类】C07K14/245, C12N15/31, C12N5/10, A01K67/033
【公开号】CN105315352
【申请号】CN201410310822
【发明人】杨宇丰, 张西, 张敏杰, 陈文锋, 孙玲, 李江
【申请人】福州大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年7月1日