可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇的多肽分子及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇 (Deoxynivalneol, DON)的多肽分子及其应用。
【背景技术】
[0002] 脱氧雪腐镰刀菌稀醇（Deoxynivalneol, DON)，又称为呕吐毒素（Vomitoxin)，属 单端孢烯族化合物，由于它可引起猪的呕吐而得名，对人体也具有一定的危害，欧盟分类标 准为三级致癌物。DON主要由镰刀菌产生，广泛存在于大麦、小麦、玉米、燕麦和大米等农作 物及其制品中。DON具有细胞毒性、胚胎毒性和免疫毒性等，可引起厌食、呕吐、腹泻、发烧 和生长缓慢等症状，严重威胁人类及动物的健康。由于DON的高污染率和高毒性，对食品中 DON的检测具有重要意义。
[0003] 目前比较常用的检测DON的方法主要包括：高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC)，气相色谱法（Gaschromatography，GC)，薄层层析法（Thin layer chromatography，TLC)，高效液相色谱-质谱联用法（High performance liquid chromatography-mass sepectrum，HPLC-MS)，微生物检测法和免疫检测法等，其中免疫学 分析方法以其灵敏度高、操作简单以及可实现规模化筛选等优点，在DON的快速检测领域 中得到了广泛的应用。
[0004] 免疫学分析方法的核心在于抗原-抗体间的特异性识别及结合，因此制备特异性 结合抗原的抗体就成为发展免疫学分析方法的前提与核心。抗体的研究近年来发展迅猛， 已经从传统的多克隆、单克隆抗体，发展至以单链抗体、噬菌体展示抗体、单域重链抗体、抗 独特型抗体等为代表的基因工程抗体领域。相比于传统抗体制备必须经历动物免疫、细胞 融合、阳性克隆筛选等复杂程序，基因工程抗体以其可定向改造、淘选方便等优点已成为目 前研究的热点。除此以外，近年来包括我国在内的众多学者已经开始着眼于不以免疫球蛋 白为主体组成结构的新型抗体研究，例如基于SELEX技术的核酸适配体、基于分子印迹聚 合体技术的人工抗体以及基于Lipocalin蛋白家族的抗体类似物等都取得了可喜的进展， 为传统抗体的替代性研究提供了扎实的理论和方法学基础。纵观抗体的发展动态，可以 看出新型抗体具有分子量小、结构简单、可自我进化、制备快捷的特点及发展趋势。例如， 单克隆抗体、单链抗体、单域重链抗体的分子量逐渐减少，分别为150、30-50、15-20kDa，以 Lipocal in为骨架蛋白的抗体类似物为18-20kDa，而核酸适配体则仅为一小段核酸序列。
[0005] 近年来人们热衷于研究发展肽模拟物（peptido-mimetics)，目的之一是将具有生 物活性的复杂分子逐步修饰、取代、改造、最终压缩至仅包含功能单位的小分子，称之为肽 模拟物的合理设计。因此，多肽分子可成为潜在的新型抗体分子。随着噬菌体展示多肽库技 术的迅速发展，通过噬菌体展示肽库的淘选，可快速、简单地获得与特定靶体分子特异性结 合的多肽分子。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的 噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活 性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛，但是上述 噬菌体展示多肽技术的应用大多局限于以大分子蛋白质为靶体分子进行亲和淘选。由于蛋 白质表面具有多个拷贝的表位，因此非常容易获得与之对应结合的多肽分子。目前的多肽 分子大多作为抗原的模拟表位（抗原替代物）应用于免疫学分析中，而将多肽分子作为小 分子物质抗体的替代物应用于免疫学分析的报道较少，其原因在于，小分子物质体积过小， 且表面没有丰富的氨基、羧基基团，难以与多肽分子结合，从而造成淘选困难。
[0006] 本发明通过噬菌体展示多肽库技术，采用亲和淘选的方式，从噬菌体展示多肽库 中快速筛选到能与DON特异性结合的多肽分子，该多肽分子具有与传统的DON多克隆、单克 隆抗体分子相似的免疫学检测特性，可作为传统DON抗体的替代物应用于DON的免疫学分 析体系。该方法避免了制备传统的单克隆抗体分子所需要的动物免疫、细胞融合、单克隆筛 选等流程，具有无需免疫过程、筛选方便、周期短、制备成本低等特点。
【发明内容】
[0007] 本发明以DON全抗原（DON与卵清白蛋白的偶联物DON-Ovalbumin)为靶分子，将 靶分子结合到酶标板载体上，投入噬菌体随机展示环七肽库，进行液相亲和淘选，获得了一 种可特异性结合DON的多肽分子，其氨基酸序列为：AHHGIPQ (在构建环七肽库的过程中，其 展示的七肽序列首尾还各有一个C残基，以成环状结构，若将首尾半胱氨酸残基也计入在 内，则其氨基酸序列为CAHHGIPQC)
[0008] 上述多肽分子结构中，大写英文字母分别代表已知天然L-型氨基酸残基或其 D-型异构体的一种，即A代表丙氨酸残基，Η代表组胺酸残基，P代表脯氨酸残基，G代表甘 氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，Q代表谷氨酰胺残基，C代表半胱氨酸残基。
[0009] 本发明还涉及编码上述多肽分子氨基酸序列（CAHHGIPQC)的核苷酸，其序列为：
[0010] TGT GCT CAT CAT GGT ATT CCG TAG TGT〇
[0011] 本发明提及多肽分子可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达的方式进 行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有多肽分子的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖 生产展示有多肽分子的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位的氨基酸序列，通 过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基 因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行多肽分子的大量制备。
[0012] 本发明还涉及所述多肽分子在非疾病诊断目的免疫学检测分析中的应用。免疫学 检测的类型包括酶联免疫吸附检测等基于抗原-抗体特异性反应的非疾病诊断目的免疫 学分析检测类型。
[0013] 本发明的有益效果是：本发明所提及的多肽分子可替代传统的DON抗体分子，作 为DON的结合分子直接应用于免疫学检测分析，该多肽分子具有结构稳定性好、耐酸碱、耐 高温，制备简单、快速等特点。
【附图说明】
[0014] 图1基于多肽分子的DON间接竞争ELISA标准曲线。
【具体实施方式】
[0015] 实施例1.与DON特异性结合多肽分子的亲和淘选及其鉴定
[0016] 1)亲和淘选与DON特异性结合多肽分子的具体方法为：取0. 5mg D0N-0VA全抗原 (偶联比为15:1)，包被于酶标板孔（100μL孔），37°C孵育2小时。用PBST(10mM PBS pH 7.4包含0· 1% Tween-20 (v/v))洗涤10次后，加入350 μ 1封闭液（5 %明胶溶液）37°C孵 育2小时。用PBST洗涤5次，每孔加入100 μ 1噬菌体肽库（噬菌体展示环七肽库，购自 ΝΕΒ公司，用PBS 10倍稀释噬菌体原液，约2. OX 10npfu)，37°C振荡反应2小时。弃去未结 合的噬菌体，用PBST洗涤15次，结合上的噬菌体用100ng溶于PBS的DON抗体进行竞争洗 脱。取10 μ 1洗脱噬菌体测滴度，其余的用于感染20mL生长至对数前期的E. coli ER2738 菌株进行扩增。第二天用PEG/NaCl沉淀纯化噬菌体，并测定扩增后噬菌体的滴度。
[0017] 然后依次进行第2轮和第3轮淘选，淘选步骤与第一轮大体相同，每次加入的噬菌 体量均为2X 10npfu，不同之处在于：第2、3轮筛选的噬菌体展示多肽与包被了 D0N-0VA的 板条孵育时间分别为60min、30min，竞争洗脱液（DON抗体）的浓度分别为75ng/mL，25ng/ mL〇
[0018] 2)阳性噬菌体克隆的鉴定：从第三轮淘选后测定噬菌体滴度的平板中随机挑 取70个噬菌体斑，进行噬菌体的扩增，采用间接酶联免疫吸附检测方法进行阳性噬菌体 克隆的鉴定，具体方法为：首先，用10mM PBS(pH 7.4)稀释D0N-0VA抗原，2yg/mL包被 96孔酶标板，4°C孵育过夜。第二天用PBST(10mM PBS，0. 05% Tween-20(v/v))洗涤3次 后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育1小时；投入100 μ 1噬菌体斑扩增液 (1. OX 1012pfu)，以原始噬菌体肽库作为阴性对照，37°C孵育1小时；加入1 :5000倍稀释的 HRP标记抗M13噬菌体二抗100 μ 1，37°C孵育1小时；加入100 μ 1 TMB底物液，避光显色 5min，酶标仪读取450nm处的吸收值。选取0D45。大于阴性对照2倍的噬菌体克隆为阳性克 隆。
[0019] 3)特异性结合DON多肽分子的鉴定：采用间接竞争ELISA的方法进行与DON特异 性结合噬菌体展示多肽的鉴定，具体方法为：用10mM PBS (pH 7. 4)稀释D0N-0VA，2 μ g/mL 包被酶标板 100 μ L，4°C孵育过夜；第二天用 PBST (10mM PBS, 0. 05 % Tween-20 (v/v))洗涤 3次后，用含有3%脱脂奶粉的PBS进行封闭，37°C孵育1小时；投入50 μ 1经间接ELISA鉴 定为阳性的噬菌体克隆（1. 〇X l〇npfu)和50 μ 1 DON标准品（浓度范围为0-1000ng/mL)， 37°C孵育1小时；加入1 :5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗100 μ 1，37°C孵育1小时； 加入100 μ 1 TMB底物液，避光显色5min，读取0D45。。若噬菌体展示的的多肽分子可特异性 结合D0N，则加入了 DON标准品的孔的0D值要低于对照孔（未加入DON标准品）。
[0020] 实施例2.与DON特异性结合的多肽分子编码基因的测序及其氨基酸序列的确定
[0021] 1.将经过间接竞争ELISA鉴定展示有特异性结合DON多肽分子的噬菌体进行 扩增，提取噬菌体的DNA测序模板。简要过程如下：进行噬菌体扩增，在第一步离心后，将 800 μ 1含噬菌体上清转入一新离心管。加入200 μ 1 PEG/NaCl沉淀噬菌体。离心后将沉淀 重悬于 100μ1 碘化物缓冲液（10mM Tris-HCl(pH 8.0)，lmM EDTA，4M Nal)，加入250 μ1无 水乙醇沉淀DNA，离心后再用70%乙醇洗涤沉淀（DNA测序模板）。沉淀最终重悬于20 μ 1 灭菌水，取2 μ 1进行琼脂糖凝胶电泳分析；取5 μ L噬菌体模板进行DNA测序，其-96gIII 测序引物为：5'-H°CCC TCA TAG TTA GCG TAA CGI^DNA测序核苷酸序列为：TGT GCT CAT CAT GGT ATT CCG TAG TGT依据DNA测序结果及密码子表可获得多肽分子（含首尾半胱氨 酸）的氨基酸序列：CAHHGIPQC。
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