0022] 实施例3.特异性结合DON多肽分子在ELISA中的应用 [0023] (1)样品提取
[0024] 称取5g待测样品，加入25ml PBS溶液，200rpm振荡5分钟；将提取液用whatmanl 号滤纸进行过滤后，取lml滤液加入lml PBS(磷酸盐缓冲液，pH = 7.2)混匀后，即为样品 提取液，待用。
[0025] (2)包被及封闭
[0026] 用10mM PBS(pH 7. 4)稀释的D0N-0VA(2 μ g/ml)，包被酶标板，4°C孵育过夜。第二 天用？83了（10禮？83,0.05%1'?6611-20^八)）洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的？83进行 封闭，37°C孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。
[0027] (3)标准曲线的建立
[0028] 取出经步骤（2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 1展示有特异性结合DON多肽 分子的噬菌体（1.0X1012pfu)和一系列不同浓度的50yL DON标准品（0-10,000ng/ml)， 37°C孵育20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育1小时。然后 用TMB底物显色，读取0D45。。以DON浓度对数为横坐标，结合率（加入DON的孔的0D45。/未 加入DON的孔的0D45(]X 100% )为纵坐标，建立间接竞争标准曲线。
[0029] (4)样品的检测
[0030] 取出经步骤（2)处理好的板条，每孔分别投入50 μ 1展示有特异性结合DON多肽 分子的噬菌体（1. 〇X l〇12pfu)和待测样品提取液，37°C孵育1小时。加入1:5000稀释HRP 标记的抗M13噬菌体二抗，37°C孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取0D45。，计算结合率， 并根据标准曲线，倒推出样品中DON的含量。
[0031] 实施例4与DON特异性结合多肽分子的的大量制备
[0032] 1)以噬菌体扩增的方式
[0033] 将与DON特异性结合的噬菌体加入至20ml接种有ER 2738的培养物中，37度 220rpm振荡培养4. 5h。将培养物转入另一离心管中，4°C lOOOOrpm离心10min，将上清的上 部80%转入一新鲜管中，加入1/6体积的PEG/NaCl，4°C下静置120min。4°C lOOOOrpm离心 PEG/NaCL静置溶液15min。弃上清，短暂离心后吸去残留上清液。加入lmL TBS进行重悬， 即为噬菌体扩增液。
[0034] 2)以多肽-融合蛋白的方式进行制备
[0035] A. PCR扩增多肽分子的外源编码基因
[0036] PCR 反应体系：（50 μ L)
[0038] PCR反应条件：
[0039]
[0040] 采用PCR产物回收试剂盒纯化PCR产物，微量核酸定量仪定量。多肽分子（含首 尾半胱氨酸）的编码基因序列为：TGT GCT CAT CAT GGT ATT CCG TAG TGT，
[0041] B.外源编码基因及表达载体的双酶切
[0042] 分别采用ACC65I和Eag I酶对外源编码基因和表达载体（pMAl-pIII，NEB公司， 可表达MBP融合蛋白）进行双酶切。
[0043] C.酶切后产物的连接及转化
[0044] 将质粒pMal-PIII和目的片段以1 : 15(摩尔比）混匀，于20°C水浴连接12h，取 15 μ L连接产物加至100 μ L感受态细胞DH5 α中，充分混匀。冰浴35min后，42°C水浴热 激60s，立即冰浴3min后补加800 μ L LB液体培养液，37°C，200rpm培养lh，8000rpm离心 5min，吸去上清留取约300 yL，涂布于LB-A固体（Amp)培养基中，37°C过夜培养，得到亚克 隆阳性克隆。
[0045] D.克隆转化
[0046] 将上述步骤得到的亚克隆用天根试剂盒提取目的质粒，取10 μ L至100 μ L感受态 细胞ΤΒ1中，充分混匀。冰浴20min后，45°C水浴热激60s，立即冰浴5min后补加800 μ L LB 液体培养液，37°C，200rpm培养45min，7000rpm离心6min，吸去上清留取约300 μ L，涂布于 LB-A固体（Amp)培养基中，37 °C过夜培养，得到阳性克隆。
[0047] E.多肽-MBP融合蛋白的表达
[0048] 将上述获得的阳性克隆子，从平板上挑一单菌落接种于5mL LB-A，0. 5%蔗糖中， 37°C，220r/min，振荡培养过夜，将过夜培养物按1%接种量（v/v)接种于50mL的LB-A， 0. 2%蔗糖培养基中，分别接种3瓶，37°C，220r/min振荡培养，当培养物细菌浓度0D600达 到0. 6时，向三瓶培养物中加入IPTG至终浓度为0. 3mmol/L，120r/min振荡培养，将诱导 物（IPEG溶液）于4°C，5000g，离心15min收集菌体沉淀，弃上清。重悬细胞于400mL 30mM Tris-HCl，25%蔗糖，pH 8. 0(80mL/g 细胞湿重），加入 EDTA 至 ImM，室温下震荡 5-10min， 8000g，4 °C离心15min，弃上清，沉淀重悬于400ml预冷的5mM MgS04,冰上震荡15min， 8000g，4°C，离心20min，保留上清，向上清液中加入8mL 1M Tris-HCl，pH 7. 4,获得多 肽-MBP融合蛋白。
[0049] 实施例5与DON特异性结合多肽分子的免疫学检测稳定性实验
[0050] 1)耐酸碱性实验
[0051] 将可与DON特异性结合的多肽分子及DON单克隆抗体分别用pH = 4. 0,5.0， 6. 0, 7. 4,8. 0的缓冲液稀释成工作液，分别进行间接竞争ELISA测定，具体方法为：用10mM PBS(pH 7. 4)稀释的 0(^-〇￥4(2 4 8/1111)，包被酶标板，4°(：孵育过夜。第二天用？83了（1〇1111 PBS，0. 05 % Tween-20 (v/v))洗涤3次后，用含有3 %脱脂奶粉的PBS进行封闭，37 °C孵 育1小时后，用PBST洗板6次待用。取出处理好的板条，每孔分别投入50 μ 1可特异性结 合DON的多肽分子/DON单克隆抗体（20 μ g/ml)和一系列不同浓度的50 μ 1D0N标准品 (0-10,000ng/ml)，37°C孵育 20min。加入 1:5000 稀释 HRP 标记的抗 M13 噬菌体二抗/HRP 标记的羊抗鼠 IgG二抗，37°C孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取0D45。。以DON浓度对 数为横坐标，结合率（加入DON的孔的0D45。/未加入DON的孔的0D45QX 100% )为纵坐标， 建立间接竞争标准曲线。
[0052] 实验结果显示：以多肽分子作为DON识别元件的间接竞争ELISA，在pH = 4. 0， 5. 0,6. 0, 7. 4,8. 0 时，其 IC5。分别为 2100, 2300, 2290, 2180ng/ml ;以 DON 单克隆抗体为识别 元件的间接竞争ELISA，在pH = 4. 0, 5. 0,6. 0时未有良好的阻断效应，呈现平滑曲线，抗体 的免疫学分析性能受到显著影响，表明DON抗体替代物的多肽分子具有更好的酸碱耐性。
[0053] 2)高温耐受性实验
[0054] 将可与DON特异性结合的多肽分子及DON单克隆抗体分别置于温度为37°C， 45°C，50°C，60°C，70°C的水浴中孵育30min，取出后分别进行间接ELISA实验，具体方法为： 用10mM PBS(pH 7.4)稀释的D0N-0VA(2μg/ml)，包被酶标板，4°C孵育过夜。第二天用 ?83了（10禮？83,0.05%1'冊611-20^八)）洗涤3次后，用含有3%脱脂奶粉的？83进行封闭， 37°C孵育1小时后，用PBST洗板6次待用。取出处理好的板条，每孔分别投入经过不同温 度孵育过的50 μ 1可特异性结合DON的多肽分子/DON单克隆抗体（20 μ g/ml)，37°C孵育 20min。加入1:5000稀释HRP标记的抗Ml3噬菌体二抗/HRP标记的羊抗鼠 IgG二抗，37°C 孵育1小时。然后用TMB底物显色，读取0D45。，，以37°C时的0D值为100%，计算不同温度 下〇D45。值的稳定度
[0055] 实验结果显示：以多肽分子作为DON识别元件的间接ELISA，在温度为37°C， 45 °C，50 °C，60 °C，70 °C 时，其稳定度分别为 100 %，93 %，88 %，80 %，72 % ;以 DON 单克隆抗 体作为DON识别元件的间接ELISA，在温度为37°C，45°C，50°C，60°C，70°C时，其温度度分别 为100%，70%，50%，20%，10%，表明相比于传统的DON单克隆抗体，DON抗体替代物的多 肽分子具有更好的高温耐受性。
【主权项】
1. 可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌稀醇（(Deoxynivalneol，DON)的多肽分子，其特征在 于其氨基酸序列为为：CAHHGIPQC。2. 如权利要求1所述多肽分子制备方法，其特征在于通过噬菌体扩增、化学合成或基 因工程重组表达的方式进行大量制备；所述噬菌体扩增是指将展示多肽分子的噬菌体，通 过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇多肽分子的噬 菌体粒子；所述化学合成指依据多肽分子的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多 肽合成；所述基因工程重组表达的方式是指将编码多肽分子的基因，通过克隆至表达载体， 以多肽-融合蛋白的形式进行大量制备。3. 权利要求1所述多肽分子在非疾病诊断目的免疫学检测分析中的应用。4. 如权利要求3所述应用，其特征在于多肽分子替代传统的脱氧雪腐镰刀菌烯醇多克 隆、单克隆抗体在非疾病诊断目的免疫学检测分析中的应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及可特异性结合脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalneol,DON)的多肽分子及其应用，该多肽分子的氨基酸序列为CAHHGIPQC。本发明采用液相亲和淘选并结合DON抗体竞争性洗脱的方式，快速淘选获得可特异性结合DON的多肽分子，所述的多肽分子可以替代传统的DON抗体并应用于DON的免疫学分析体系中，并具有更好的酸碱耐受及热稳定性，该多肽分子的获得无需免疫过程、制备简单、成本低、周期短，该多肽分子既可通过生物培养的方式大量扩增，也可以通过化学合成或者基因工程的方法进行大量制备，为DON抗体的制备提供了新的路径，具有较好的应用价值。
【IPC分类】C07K7/06, G01N33/577, G01N33/68
【公开号】CN105315346
【申请号】CN201510780344
【发明人】何庆华
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月16日