一种竹蛏活性三肽及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物活性肽领域，尤其涉及一种竹蛏活性三肽及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 竹蛏又名蛏子王，为海产双壳软体动物，体呈延长形，两壳合抱后呈竹筒状，故有 竹蛏之名。竹蛏贝壳光滑，呈黄褐色，有光泽，壳质脆薄，表面突出，背缘与腹缘平行，后端 纯圆，呈长方形，生长线明显，长约11厘米。我国南北沿海均有分布，肉味鲜美，鲜食、干制 均可。竹蛏肉味甘咸、性寒，入心、肝、肾经；具有补阴、清热、除烦，解酒毒等功效；对产后虚 阴、烦热口渴、湿热水肿、痢疾以及醉酒等有一定治疗作用。
[0003] 活性肽是由两个或两个以上的氨基酸以肽键相连的化合物，在人体内起重要生理 作用，发挥生理功能，如：调节体内的水分、电解质平衡；促进伤口愈合；修复细胞、改善细 胞代谢，能起到防癌作用等。活性肽一般通过酶解生物活性材料获得，郑惠娜等发现食物蛋 白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽（《海洋蛋白酶解制备生物活性肽的 研究进展》，郑惠娜、章超桦、曹文红，水产科学，2008, 27 (7)，370)。目前关于蛏类活性肽的 研究主要集中于缢蛏，如：雷晓凌等对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚 糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强（《缢蛏糖胺 聚糖的提取分离及其体外抗肿瘤活性的初步研究》，雷晓凌、吴红棉、范秀萍等，药物生物技 术，2004, 11(3) :146-149);张永娟等研究发现提取的缢蛏多肽能促进小鼠胸腺和脾脏发 育及迟发型变态反应的发生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平（《缢蛏多肽的免疫调 节及抗氧化作用》，张永娟、郑惠娜，时珍国医国药，2011，22 (5) :1076-1077)。
[0004] 竹蛏与缢蛏外形不同，食用时风味也稍有不同，目前关于竹蛏酶解多肽的研究还 未见报道，因此对竹蛏酶解多肽进行研究，对进一步研究和开发以竹蛏酶解多肽多基础的 功能性食品和药物，提高竹蛏的经济价值具有重大意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种具有抗肿瘤活性 的竹蛏活性三肽。
[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种上述竹蛏活性三 肽的制备方法。
[0007] 本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种上述竹蛏活性三 肽的应用。
[0008] 本发明解决上述第一个技术问题所采用的技术方案为：一种竹蛏活性三肽，其氨 基酸序列为：Pro-Gly-Asp，ESI/MS检测分子量为287. 3Da。
[0009] 本发明解决上述第二个技术问题所采用的技术方案为：上述竹蛏活性三肽的制备 方法，包括以下步骤：
[0010] (1)新鲜竹蛏去壳取肉，竹蛏肉洗净后捣碎，按料液比1:1~3加水进行组织匀浆， 匀浆后调节匀浆液pH值为8~10. 4备用；
[0011] (2)在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，酶解温度为35~ 50°C，加酶量为300~1200U/g竹蛏肉，酶解时间为2~8h，酶解完成后于95~100°C、10~ 15min进行灭酶；
[0012] (3)将上述酶解样品过5KD、8KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8KD、分子 量为8~5KD以及分子量小于5KD的酶解液组进行冷冻干燥；
[0013] (4)将步骤（3)中的各分子量段的酶解液组分别通过MTT法进行抗肿瘤活性检测， 取抗肿瘤活性最高的酶解液组进行G-25凝胶分离，收集相应的洗脱峰；
[0014] (5)对步骤（4)中收集的洗脱峰进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进 行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性三肽。
[0015] 作为优选，竹蛏活性三肽的制备方法为：（1)新鲜竹蛏去壳取肉，洗净后捣碎，按 料液比1:1加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值为9. 6备用；
[0016] (2)在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获得酶解样品，酶解温度为50°C， 加酶量为300U/g竹蛏肉，酶解时间为8h，酶解完成后于95~100°C、10~15min进行灭酶；
[0017] (3)将上述酶解样品过5KD超滤膜进行超滤，收集分子量小于5KD的酶解液进行冷 冻干燥；
[0018] (4)对步骤（3)中收集的酶解液进行G-25凝胶分离，收集洗脱峰6 ;
[0019] (5)对步骤（4)中收集的洗脱峰6进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进 行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性三肽；
[0020] 前述反相高效液相色谱条件为：Zorbax SB-C18色谱柱4. 6X250mm5um，检测波 长280nm/214nm，柱温为20°C，进样量为100ul，梯度洗脱，流速为1.0ml/min，流动相A为 0· 06% TFA，B为(λ 05% TFA的乙腈，洗脱程序：0%~0% B洗脱4分钟，0%~7% B洗脱 25分钟，7 %~100 % Β洗脱1分钟，100 %~100 % Β洗脱5分钟。
[0021] 本发明解决上述第三个技术问题所采用的技术方案为：一种上述竹蛏活性三肽在 制备抗肿瘤药物和食品中的应用。
[0022] 进一步，所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的增殖活性，所述肿瘤为人前列腺癌。
[0023] 再进一步，所述竹蛏活性三肽对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制率与浓度和作 用时间呈依赖关系。
[0024] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明提供了一种全新的竹蛏活性三肽，能 较好地抑制人前列腺癌细胞增殖活性，对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可高于 90%，体外抗前列腺癌效果显著，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础。该竹蛏活性三 肽通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，采用碱性蛋白酶进行酶解，酶解方式温 和，酶解产品贴合人体自然需要，对进一步研究和开发以竹蛏为基础的药物、提供竹蛏的经 济价值具有重大意义。
【附图说明】
[0025] 图1为本发明实施例1中分子量小于5KD的酶解液样品的G-25分离纯化图；
[0026] 图2为本发明实施例1峰6样品的反相高效液相色谱图；
[0027] 图3为本发明实施例1中竹蛏活性三肽（Pro-Gly-Asp)的质谱（ESI/MS)图；
[0028] 图4为本发明实施例2中竹蛏活性三肽（Pro-Gly-Asp)对PC-3细胞增殖活性的 影响。
【具体实施方式】
[0029] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0030] 实施例1 :竹蛏活性三肽的制备
[0031] 1、前处理：
[0032] 取新鲜竹蛏，去壳取竹蛏肉，洗净后沥干备用。
[0033] 2、碱性蛋白酶解
[0034] 2. 1用高速组织捣碎机将竹蛏肉捣碎，加入蒸馏水匀浆，料液比1:1~3,精密称取 匀浆液，用0. lmol/L的盐酸溶液和0. lmol/L的NaOH溶液调节匀浆液pH值，加入碱性蛋白 酶酶解数小时，酶解条件为：酶解温度35~50°C，pH为8~10. 4,酶解时间2~8h，加酶 量300~1200U/g竹蛏肉。酶解结束后于100°C下灭酶15min，4°C下离心15min(10000r/ min)，取上清液备用。
[0035] 2. 2碱性蛋白酶解工艺优化
[0036] 2. 2. 1选用碱性蛋白酶，以A (温度）、B (pH)、C (加酶量）、D (料液比）和E (时间）5 个因素，选4个水平进行L16(45)的正交实验，通过MTT法筛选在不同酶解条件下的酶解液 对前列腺癌细胞增殖抑制率最高的酶解条件，从而确定最佳水解条件，并进行大量酶解。碱 性蛋白酶因素和水平如表1所示：
[0037] 表1碱性蛋白酶的因素与水平
[0039] 2. 2. 2本实施例中选取前列腺癌细胞PC-3激素非依赖型细胞（原购自中科院上海 细胞库，由本实验室传代保存），细胞培养过程如下：
[0040] (1)、细胞复苏
[0041 ] 从液氮罐中取出存放的PC-3细胞株，快速的放入37 °C恒温水浴锅中进行融化，待 融化后进入无菌工作室进行操作，用灭菌好的吸管将细胞株吸入离心管，加入2mL的F12营 养液，lOOOrpm离心10min，去上清液，加入4ml的营养液，反复吹打使细胞成为单个细胞。 然后用吸管将细胞均匀的吸入到2个25mL的培养瓶中，放入5% C02、37°C的恒温培养箱培 养，次日换液倒掉未贴壁的死亡细胞。
[0042] (2)、细胞培养
[0043] 将人前列腺癌细胞PC-3接种到分别含有10 %胎牛血清（体积分数）FBS和双抗 (青霉素 G100IU/mL、链霉素100IU/mL)的F12和1640营养液中，放置于37°C、5% 0)2的恒 温培养箱中培养，细胞贴壁生长，每1天换液一次，待细胞长满培养瓶的80%左右时进行传 代。按照1 : 2的比例进行传代，收集对数生长期细胞进行实验。
[0044] (3)、细胞传代
[0045] 先将长满细胞的培养瓶从恒温培养箱中取出放到无菌操作台上。传代时，先倒掉 瓶中的营养液，去除不贴壁生长的死细胞，用〇. 25%胰蛋白酶/0. 02% EDTA消化液混合消 化，不同细胞消化的时间不同，一般消化时间为3-5min ;显微镜下观察细胞，当细胞间隙明 显变大且细胞变圆变亮时，说明细胞已经消化完毕，去掉消化酶液。在培养瓶中加入2. 5mL 左右的营养液，反复吹打消化好的贴壁细胞使之成为单个细胞，一般情况下一瓶细胞传2 瓶，将传代好的细胞置于37°C、5% 0)2的培养箱中进行培养。
[0046] (