4)、MTT 法
[0047] 取对数生长期的细胞制成悬液，接种至96孔板，每孔200 μ L，设5个平行孔，于 5% C02,37°C贴壁16-48h，倒置显微镜下观察，弃去培养液，同时将待测样品以不同浓度分 别溶于培养液中。然后分别加入每个孔，同时设不加样品的对照组，置5% C02、37°C培养箱 中孵育36h，用PBS冲洗2遍，加入含有MTT的营养液，继续培养4h。终止培养，小心吸去孔 内培养液。加入二甲基亚楓，置摇床上低速振荡l〇min，采用酶联免疫检测仪于490nm测吸 光度值（OD值）。计算细胞增殖抑制指数（IR，Inhibition rate)，即增殖抑制率，按下列公 式计算：
[0049] 2. 2. 3、碱性蛋白酶酶解正交结果如表2所示，可见实验号15时IR值最大，因此碱 性蛋白酶酶解得最佳条件为：酶解温度：50°C，酶解pH值：9. 6,料液比：1 :1，时间：8h，加酶 量：300U/g〇
[0050] 表2碱性蛋白酶酶解正交试验结果
[0051]
[0052] 3、超滤
[0053] 将酶解液加入超滤系统，用8KD、5KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8KD、 分子量为8~5KD和分子量小于5KD的酶解液组，冷冻干燥后分别配置成浓度为10mg/mL的 酶解溶液进行MTT试验，作用24h小时后，各酶解液组对前列腺癌PC-3的增殖抑制率分别 为34. 23%、46. 57%、67. 21 %，可见分子量小于5KD的酶解液组对PC-3的增殖抑制作用效 果比其他两个组分要好，因此将分子量小于5KD的酶解液组冷冻干燥后进行进一步纯化。
[0054] 4、G_25凝胶分离
[0055] 将上述分子量小于5KD的酶解样品用蒸馏水进行溶解，离心，取上清液，过 0. 45 μ m微孔滤膜得滤液，取1. 5ml滤液过Sephadex G-25 [90cmX 115cm(ID)]，用蒸馏水为 洗脱液，平衡和洗脱。每管收集3ml，于λ280ηπι处检测，收集各峰洗脱液。
[0056] 结果如图1所示，分子量小于5KD的酶解样品过G-25洗脱液得到6个峰，经上述 体外抗肿瘤实验筛选，峰6具有最高的抗肿瘤活性，因此收集峰6,冷冻干燥，通过反相高效 液相色谱（RT-HPLC)纯化。
[0057] 5、反相高效液相色谱（RT-HPLC)纯化及氨基酸序列检测
[0058] 将冷冻干燥好的酶解样品用0. 06 % TFA的水溶解到0. 6ml的离心管中，在 12000rpm，离心10min取上清液。反相高效液相条件：系统：Agilent 1260HPLC ;选用Zorbax SB-C18(4. 6X250,5um);柱温为 20°C;流动相 A 为 0. 06% TFA，B 为 0. 05% TFA 的乙腈，洗脱 程序：0%~0%B洗脱4分钟，0%~7% B洗脱25分钟，7%~100% B洗脱1分钟，100%~ 100% B洗脱5分钟；流速为1.0ml/min ;进样量为100ul ;检测波长为280nm/214nm。
[0059] RT-HPLC结果如图2所示，由图2可见，该分子段只有一个洗脱峰，收集该洗脱峰并 进行氨基酸序列检测，其氨基酸序列为Pro-Gly-Asp ;如图3所示，ESI/MS检测的分子分子 量为287. 3Da([M+H]+287. 3Da)，即得所需的竹蛏活性三肽。
[0060] 上述氨基酸序列检测采用采用N末端氨基酸降解检测方法测定：①建立标准氨基 酸图谱：利用混合氨基酸标准品（PTH-AA)，在常规条件下运行生成一张标准品色谱图，对 混合氨基酸标品的保留时间进行校正，生成标准方法文件。②样品前处理：将纯样品离心后 取上清液备用；将聚凝胺（P〇lybrene)15ul加到玻璃纤维膜（Glass Fiber Disk)上氮气 吹干；上机将玻璃纤维膜预处理，即运行5个循环将足量纯样品点加到预处理后的玻璃纤 维膜上，氮气吹干。③上机检测：将加好样品的玻璃纤维膜用PTFE滤膜封置于蛋白测序仪 PPSQ-31A的反应器里，设定检测氨基酸数及其他参数。
[0061 ] 实施例2 :竹蛏活性三肽抗PC-3细胞增殖活性研究
[0062] 以F12培养基为对照组，利用上述MTT法比较不同浓度、不同作用时间竹蛏活性三 肽对PC-3细胞增殖的影响，试验结果如图4所示，可见竹蛏活性三肽能有效抑制PC-3增 殖，且呈浓度和时间依赖性。
[0063] 上述各实施例中使用的主要材料与试剂：
[0064] 竹蛏购自浙江省舟山市南珍市场；前列腺癌细胞PC-3激素非依赖型细胞（原购自 中科院上海细胞库，由本实验室传代保存）；胎牛血清（FBS)，杭州四季青生物制品有限公 司；HamF12培养基，Gibco公司；碱性蛋白酶，美国SIGMA公司；青霉素、链霉素，山东鲁抗医 药股份有限公司；MTT购自美国Sigma公司；二甲基亚砜（DMS0)购自美国AMRESC0公司；其 余试剂均为分析纯。
[0065] 上述各实施例所使用的主要仪器：
[0066] DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂；BSA124S型电子天平，德国Sartorius AG公司；SSW型微电脑电热恒温槽，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；超滤系统，美国密 理博公司；PHS-250pH计，上海理达仪器厂；CF16RXII高速冷冻离心机，日本HITACHI公司； ZHJH-C1209C型超净工作台，上海智诚分析仪器制造有限公司；Forma 3111型C02培养箱， 美国Thermo公司；酶标仪，美国Bio-Rad公司；LGJ-18冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展 有限公司；Agilent 1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；微量震荡器，上海精密仪 器有限公司。
【主权项】
1. 一种竹蛏活性三肽，其氨基酸序列为：Pr〇-Gly-Asp，ESI/MS检测分子量为287. 3Da。2. -种如权利要求1所述的竹蛏活性三肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 新鲜竹蛏去壳取肉，竹蛏肉洗净后捣碎，按料液比1:1~3加水进行组织匀浆，匀浆 后调节匀浆液pH值为8~10. 4备用； (2) 在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，酶解温度为35~50°C， 加酶量为300~1200U/g竹蛏肉，酶解时间为2~8h，酶解完成后于95~100°C、10~15min 进行灭酶； (3) 将上述酶解样品过5KD、8KD超滤膜进行超滤，分别收集分子量大于8KD、分子量为 8~5KD以及分子量小于5KD的酶解液组进行冷冻干燥； (4) 将步骤（3)中的各分子量段的酶解液组分别通过MTT法进行抗肿瘤活性检测，取抗 肿瘤活性最高的酶解液组进行G-25凝胶分离，收集相应的洗脱峰； (5) 对步骤（4)中收集的洗脱峰进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进行氨 基酸测序，获得所述竹蛏活性三肽。3. 如权利要求2所述的竹蛏活性三肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 新鲜竹蛏去壳取肉，洗净后捣碎，按料液比1:1加水进行组织匀浆，匀浆后调节匀 浆液pH值为9. 6备用； (2) 在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获得酶解样品，酶解温度为50°C，加酶 量为300U/g竹蛏肉，酶解时间为8h，酶解完成后于95~100°C、10~15min进行灭酶； (3) 将上述酶解样品过5KD超滤膜进行超滤，收集分子量小于5KD的酶解液进行冷冻干 燥； (4) 对步骤（3)中收集的酶解液进行G-25凝胶分离，收集洗脱峰6 ; (5) 对步骤（4)中收集的洗脱峰6进行反相高效液相色谱纯化，收集各峰组分并进行氨 基酸测序，获得所述竹蛏活性三肽； 前述反相高效液相色谱条件为：ZorbaxSB-C18色谱柱4. 6X250mm5um，检测波长 280nm/214nm，柱温为20°C，进样量为100ul，梯度洗脱，流速为1.Oml/min，流动相A为 0· 06%TFA，B为(λ05%TFA的乙腈，洗脱程序：0%~0%B洗脱4分钟，0%~7%B洗脱 25分钟，7 %~100 %Β洗脱1分钟，100 %~100 %Β洗脱5分钟。4. 一种如权利要求1所述的竹蛏活性三肽在制备抗肿瘤药物和食品中的应用。5. 如权利要求4所述的竹蛏活性三肽在制备抗肿瘤药物和食品中的应用，其特征在 于：所述抗肿瘤为抑制肿瘤细胞的增殖活性，所述肿瘤为人前列腺癌。6. 如权利要求5所述的竹蛏活性三肽在制备抗肿瘤药物和食品中的应用，其特征在 于：所述竹蛏活性三肽对人前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制率与浓度和作用时间呈依赖关 系。
【专利摘要】本发明涉及一种竹蛏活性三肽，其氨基酸序列为：Pro-Gly-Asp，ESI/MS检测分子量为287.3Da；通过以下步骤制得：新鲜竹蛏去壳取肉，竹蛏肉洗净后捣碎，进行组织匀浆，匀浆后调节匀浆液pH值备用；在上述匀浆液中加入碱性蛋白酶进行酶解，获取酶解样品，将所得酶解样品进行超滤、G-25凝胶分离反相高效液相色谱纯化，收集洗脱峰组分并进行氨基酸测序，获得所述竹蛏活性三肽。该竹蛏活性三肽对人前列腺癌PC-3细胞的最大增殖抑制率可达90％以上，可为抗前列腺癌药物的研究提供理论基础，该竹蛏活性三肽通过生物酶解方式获得，原料来源广泛，成本低，对进一步研究和开发以竹蛏为基础的药物和食品、提高竹蛏的经济价值具有重大意义。
【IPC分类】C07K1/34, A61P35/00, C07K5/097, C12P21/06, C07K1/16, C07K1/20, A61K38/06
【公开号】CN105315336
【申请号】CN201510322954
【发明人】黄芳芳, 丁国芳, 杨最素, 余方苗
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年6月12日