一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法

专利名称：：一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用。
背景技术：
：哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等过敏性疾病，在过去的20年中该类疾病的发病率逐年上升。仅就哮喘而言全世界约有1.0-1.5亿人患有哮喘，该疾病严重影响患者的身心健康，每年可导致约18万人死亡。全球用于哮喘疾病的治疗费用超过了艾滋病和结核的总和。IgE分子是参与过敏性疾病的关键分子。过敏原与已结合于效应细胞膜表面的IgE结合，引起细胞表面IgE受体交联，使磷酸肌醇水解，胞浆C^+浓度增加，导致嗜碱性粒、肥大细胞等效应细胞脱颗粒，释放和合成组织胺、白细胞三烯和血小板活化因子等大量过敏介质，引起平滑肌收縮、腺体分泌增强，从而引发过敏症状。过敏性变态反应的治疗方案包括:避免接触过敏原、抗组胺治疗、脱敏疗法、免疫治疗、激素治疗等，但目前的治疗方法往往存在较严重的毒副反应和治疗效果不佳的问题。所以，研制高效药物用于此类疾病的治疗仍然是生物学家和医学家们面临的一个艰巨任务。IgE分子是参与过敏性疾病的关键分子，其生理作用必须与相应受体结合而发生。E受体(FcsR)可分为FcsRl和FcsRII两种受体，其分布、结构及介导的生物学作用有所不同。FceRI:为IgE高亲和力受体，亲和常数Kd为10义10"。M。FceRi型受体由两种形式存在，1、由四聚体(apY2)组成，主要表达于肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面。四个亚基为一个单链跨膜、直接与IgE结合的(X亚基，一个四次跨膜的P链以及两个以二硫键相连的Y亚基。a链直接与IgE结合，含222个氨基酸残基，分子量25kDa,p链含243个氨基酸残基，可能是把a链与y链相连接和信号放大的作用，两条Y链由二硫键连接组成同源二聚体，Y与FcsRI的表达的稳定性和信号的传导有关，(3和y链通过受体酪氨酸激活基序的磷酸化参与了早期相反应胞内信号级联的传导。lyn,src家族的PTK被激活,lyn的激活又使p链、y链及邻近的蛋白酪氨酸磷酸化,磷酸化的(3、Y亚基反过来再分别激活lyn、Syk。激活的lyn又磷酸化激活Btk、Emt,两者均是Tec家族分别引起胞内Ca外流及激活PKC的作用。PKC的激活和细胞外钙的增加是脱颗粒反应所必需。2、三聚体(aY2)形式的受体，主要表达于嗜酸性粒细胞、单核细胞、树突状细胞以及朗格汉氏细胞表面。IgE与FceRI的结合是以1:1比例结合，这样就避免了在没有过敏原存在时，1个lgE就可以结合2个相邻的FceRl发生交联，从而引起细胞内信号传导、活化免疫效应细胞。FcsRl(CD23):为IgE低亲和力受体，Kd为1(T7M。主要存在于B细胞、单核细胞以及嗜酸性粒细胞等炎症细胞表面,为II型整合素家族膜蛋白。其胞外区由3个含有C型凝集素样结构域的头部和1个含有多个蛋白酶切位点的柄部组成。FcsRlI可能以两个含凝集素样结构域的头部与IgE分子的两个结合位点相结合形成IgE-FcsRlI复合物,主要参与IgE的负反馈调节、增强IgE依赖的抗原呈递、引发炎症细胞介导的吞噬作用和细胞毒作用等。胞外C端被蛋白酶裂解的不同片段14kDa、25kDa禾卩33-37kDa均称为IgE结合因子(IgE-BF),亦称B细胞来源的B细胞生长因子(B-BCGF)，具有结合IgE和促进B细胞生长的作用。此外FcsRII可介导IgE依赖的ADCC和吞噬调理作用。FcsRI受体中a亚基可直接与IgE结合，并具有很高的亲和力。FcsRIa胞外区包括两个Ig样区——Domainl(Dl)禾PDomain2(D2)，Dl和D2以反向平行的方式存在。其中D2对结合IgE的贡献最大，FcsRIa通过D2与IgE分子Cs3区的凸面平行结合，从而形IgE-Fc/FceRI复合物。2000年，GarmanSC等(参见，Nature,2000,406(6793):259-266)利用X-射线晶体衍射技术解析了IgE-Fc/FceRI复合物的晶体结构(分辨率3.5-A)，晶体结构证实IgE-Fc与FcsRl间存在2个结合位点——IgE双链中链l的Cs3区存在"Tyr131口袋"，链2的Cs3区存在"Pro426位点"，分别与FcsRla上的"Tyrl31位点"和"Pro426口袋"结合，从而形成lgE-Fc/FcsRI复合物。FcsRlaD2区包括Tyrl31在内的八个残基与IgE-Fc直接作用，而Dl不和IgE-Fc直接结合。D1-D2连接(85-87)、D2BC环(110-113)以及D2FG环(156-158)形成"Pro426口袋"，IgE-Fc链2的Cs3区Pro426残基插入这一口袋中的Trp87和TrpllO残基之间，形成了疏水的"Trp-Pro-Trp"三明治结构；同时，IgE-Fc链1上的BC环(362-365)、FG环(424-427)以及Cs2-Cs3连接(334-336)形成了"Tyr131口袋"，FcsRIa的Tyrl31位点伸入这一口袋中，与IgE-Fc链lCs3区中的Pro333、Arg334和Arg427残基以氢键和极性作用直接结合，这一作用强于Pro426位点——"Pro426口袋"之间的疏水作用。IgE-Fc链2中的Pro333、Arg334和Arg427残基与FceRIa之间也存在弱的相互作用。尽管IgE在人体内含量极微(50~300ng/mL)，半衰期很短(约2.5d)，但由于IgE与FcsRI具有很高的亲和力，IgE的作用被明显放大。从理论上来说，阻止IgE分子与效应细胞表面的高亲和力受体FcsRI的结合便可以有效抑制过敏原诱导的过敏反应。目前，已相继出现了抗IgE抗体、抗IgE受体抗体以及依据抗IgE抗体效应部位设计的多肽等抑制性小分子，它们均显示了潜在的治疗过敏性疾病的能力。KimHM等(参见，KimHM等人，Immunology,1998;93:589-94)，通过合成FcsRIa亚基的反义寡核苷酸(ODN),使a亚基表达缺陷,从而抑制IgE介导的过敏反应,其良好的治疗效果已经在小鼠体内、体外得到证实。近十年人们重点开始转向能够阻断受体、配体相互作用的抗体,于是人们制备了许多针对IgE及FcsRl受体的单克隆及多克隆抗体。2004年重组人源抗IgE抗体奥马佐单抗(omalizumab,又称为E25或rhuMAb2E25)获FDA批准上市，商品名为Xolair,是基因泰克和诺华共同开发的单克隆抗体药物，为人源化抗IgE抗体。Xolair于2003年在美国上市，用于治疗成人和12岁以上青少年的严重哮喘，其2006年的销售额将近5亿美元。Xolair与循环IgE的Cs3区结合，并阻断IgE与效应细胞膜表面FcsRI和FcsRII受体的结合，从而抑制I型变态反应性疾病的发生。Xolair⑧因为其过敏反应发生率较高达2/1000，患者出现呼吸急促、气短和低血压等症状，甚至导致死亡。2007年，美国FDA决定给Xolair贴上最严重的安全警告标志"黑框"，"黑框"警告是美国处方药最严厉的安全警示标志。Xolair的销售市场使我们看到了治疗哮喘和过敏性鼻炎的市场前景。所以，患者急需治疗效果好毒副作用低的新产品提供给他们。sFcsRIa为细胞膜外区，仍然保留与IgE特异性结合的能力,与IgE亲和力与完整的受体基本一致，但丧失信号转导功能。sFcsRIa可与膜表面完整受体竞争IgE，从而发挥阻断效应，抑制过敏反应的发生。未糖基化的sFcsRIa其分子量预测大约28Kd,有7个潜在的N糖基化位点，在CHO表达的分子量58kD。实验结果表明(参见GavinAL等，Immunology.1995，86(3):392-8.Rac等，IntImmunol.1993，5(1):47-54.)，sFcsRIa可与IgE竞争结合FcsRI，阻止RBL-2H3细胞组胺的释放;被动皮肤过敏实验证实，sFcsRIa可抑制过敏反应的发生。说明sFcsRIa在治疗I型变态反应性疾病有很大的潜力。但是其半衰期较短11/2=15分钟，限制其在临床上的应用。HaakFM等(参见，HaakFM等，JImmunol,1993，151:351-58)构建了FcsRIa-IgG免疫融合蛋白。它是由FcsRla亚基的细胞外区和IgGl重链的CH2、CH3、铰链区相结合而组成的融合蛋白。该融合蛋白对游离的IgE具有高亲和力,但不能识别已结合到受体上的IgE,因此不会引起受体交联，无诱发变态反应的能力。融合蛋白通过FceRI的a亚基细胞外区识别游离的IgE,而IgGl的CH2、CH3可延长重构体在体内的循环时间,还有易提纯、易检测的优点,由于其组成部分均来源于人类,不会引起免疫排斥反应。但是，HaakFM在融合蛋白中采用的是IgGl的Fc结构，这样的融合蛋白结构在未来的使用中会带来毒副作用大的问题。众所周知，免疫球蛋白在发挥抗肿瘤和抗感染的功效中其重链恒定区Fc发挥重要的作用1、通过Fc与细胞表面的Fc受体(Fcr/Rs,即FcyRI、FcyRII和FcyRIII)的结合，介导抗体依赖的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞。此外，抗体与NK细胞、中性粒细胞和巨噬细胞等免疫效应细胞结合后诱发丝裂原活性，导致TNFa、IL-2、IFN-y、IL-6等大量炎性细胞因子的释放；2、通过Fc的CH2区的补体结合位点与补体C1结合，激活补体，引发补体依赖的细胞毒作用(CDC)。在应用Fc汰Ia/Ig类融合蛋白进行治疗时，必须力求避免在应用于人体后所诱发的ADCC、CDC和丝裂原活性，降低由此产生的毒副作用。在IgG的IgGl、IgG2、IgG3和IgG4四个亚类中，IgGl和lgG3能有效结合FcyRs，IgG4比IgGl、IgG低一个数量级，IgG2与FcyRs的结合能力低得难以测定。IgGl和IgG3能有效结合补体Clq,诱导补体经典激活途径，IgG2对补体的固定能力很弱。
发明内容本发明的目的在于提供一种蛋白。本发明提供的一种蛋白，命名为FcsRIa/IgG2，是如下l)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能与IgE分子结合的由1)衍生的蛋白质。FcsRIa/IgG2是将sFceRIa与IgG2的铰链区、CH2和CH3进行融合表达。为进一步降低IgG2的CH2区可能具有的较弱的丝裂原活性，将IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala，以降低其与FqR11的结合活性。序列2的第1-20位是抗体轻链k信号肽，序列2的第21-199位是sFcsRIa，其余氨基酸序列为IgG2的铰链区、CH2和CH3区，IgG2中的Val234和Gly237突变为Ala。上述蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围之内。上述编码基因可以为如下1)或2)或3)的基因1)编码序列是序列表中序列1的自5'端第8位至1303位所示的基因；2)在严格条件下与l)限定的基因杂交且编码所述蛋白的基因；3)与l)限定的基因具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的基因。上述编码基因可以是序列1所示的基因。上述的严格条件是指，将杂交膜置于预杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS)中，65。C预杂交30min;弃预杂交液，加入杂交液(0.25mol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，7%SDS，同位素标记的核苷酸片段)，65t:杂交12hr;弃杂交液，加入洗膜液I(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，5%SDS)，65。C洗膜2次，每次30min;加入洗膜液II(20mmol/L磷酸钠缓冲液，pH7.2，1%SDS)，65°0冼膜3Omin。含有上述基因的重组载体或重组菌也属于本发明的保护范围之内。上述重组载体是在PCI/neo的多克隆位点插入上述基因得到的重组载体。含有上述基因的转基因细胞系也属于本发明的保护范围之内。上述转基因细胞系是含有上述基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO)。本发明的另一目的在于提供一种制备上述蛋白的方法，是培养上述转基因细胞系，得到所述蛋白。上述细胞培养的条件是35-39。C，3-8%(体积百分比)C02，8-12%(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基；优选是37。C，5%C02，10%胎牛血清的DMEM培养基中i肯养o本发明的又一目的在于提供上述的蛋白或上述的基因在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用；所述过敏性疾病是哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎或食物过敏。本发明提供的免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2保持了与IgE较高的亲和力；FcsRIa和IgG2均来自人源性蛋白，无抗原性，无需进行人源化改造；半衰期较长，分子量达170kDa，较sFcsRla大；低毒性，在融合蛋白中采用突变的人源IgG2的稳定区，IgG2不易与FcYRI、FqR11和FcyR11结合,无ADCC、CDC和丝裂原活性；易纯化和检测，IgG2的稳定区CH2和CH3仍保留与ProteinA的结合特性，为将来产品的纯化提供了便利。为将来产品的纯化提供了便利。本发明所研制的免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2对该类疾病的治疗具有广阔的临床应用前景，将来对其进一步开发可产生巨大的经济效益和社会效益。图1是凝胶电泳图谱，其中A是PCR扩增FcsRIa/mlg基因；B是XhoI-EcoRI双酶切鉴定。图2是IgE蛋白标准曲线。图3是Fc汰Ia/IgG2融合蛋白Western-blot检测结果。图4是FcsRIa/IgG2纯化产物非还原电泳。图5是ELISA检测FceRIa/IgG2与鼠IgE结合活性。图6是竞争ELISA方法检测FcsRIa/IgG2与人IgE结合活性。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例1、免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2的获得及其功能分析一、免疫融合蛋白FcsRla/IgG2的获得1、免疫融合蛋白FceRIa/IgG2表达基因的优化及合成人工合成序列1所示的DNA片段，以该DNA片段为模板，用如下的引物进行PCR扩增上游弓l物:5-CCGCTCGAGCCGCCACCATGGAGAC-3;下游引物5-CCGGAATTCTTACTTTCCAGGAGACAGGGACAGG-3，其中下划线部分分别为Xhol和EcoRI的酶切位点，北京奥科生物技术有限责任公司合成。PCR扩增的反应条件为95"C预变性5分钟；以94"C变性45s，56"C退火45s，72"C延伸2min，扩增30个循环；再以72"C延伸10分钟。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，如图IA(I，FcsRIa/mlg基因；2，分子量标准DL2000)所示，得到大约1300bp的条带，命名为&^///^<^。然后将目的条带切下，用DNA试剂盒(北京天根生化科技有限公司产品)回收扩增产物。将回收的产物连接T载体，送奥科生物技术有限责任公司测序，测序结果表明该条带具有序列表中序列1所示的自5'端第1-1303位所示的核苷酸序列，该序列的编码基因如序列1的自5'端第8位至1303位所示。2、重组载体的构建纯化的PCR产物和载体PCI/neo(PromegaCorporation)用EcoRI和Xhol双酶切后，分别用DNA试剂盒回收纯化酶切产物，在；DNA连接酶作用下16°C连接过夜，将连接产物转入大肠杆菌DH5(x感受态细菌中，在LB(氨苄酶素抗性)培养基中筛选培养，挑取阳性克隆，培养后提取质粒，采用EcoRI和Xhol双酶切鉴定，结果如图1B(1，切出预期大小的片段；2，空载体；3，分子量标准DL2000)所示。鉴定正确后送奧科生物技术有限责任公司测序，将测序结果正确的重组载体命名为pCI/neo-Fcsi/o//gG2。3、免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2的表达及纯化1)免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2的表达A、将中国仓鼠卵巢细胞(CHO)培养于含10%(体积百分比)胎牛血清(FCS)的DMEM(购自Hyclone公司，Cat.No:Bl1000179)完全培养液中，转染前一天均匀铺于6孔板，每孔3xl05。细胞传代24h后，吸弃培养板中的培养液，用双无DMEM培养液(无血清无抗生素的DMEM培养液)轻轻洗两次，加入800pl双无DMEM培养液，得到含待转染CHO细胞的培养板。B、然后按照脂质体Lipofectamine-TM试剂说明书(Invitrogen公司产品，Cat.No:l1668-027)，将脂质体加入到100pl上述的无血清无抗生素的DMEM培养液中混匀，静置10min，同样将步骤2中口(:1/加0-/^(^加入到100pl无抗生素、无血清的DMEM培养液中混匀，静置10min。然后将两份静置10min中后的培养液混合，室温放置30min，得到脂质体/DNA混悬液。C、将步骤B的200^1脂质体/DNA混悬液逐滴加入步骤A得到的含有待转染CHO细胞的培养板，轻轻混匀，置于5%(体积百分比)C02、37i:孵育6h后，得到转染的细胞，然后将培养液换成含10%(体积百分比)FCS的DMEM完全培养液继续培养，即可得到免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2。2)ELISA检测表达量转染细胞培养48h后，采用夹心ELISA法检测融合蛋白的瞬时表达。96孔板包被3吗/ml抗人IgG(Sigma,，Cat.No:13382),50^d/孔，4。C过夜；0.25g/100mlBSA的PBST(0.05。/。(体积百分比)Tween-20)洗涤96孔板4次；lg/100ml的BSA-PBS封闭(50pl/孔)，37°C，封闭1小时；PBST(Ph7.4)洗涤4次后，加入0.25%BSA的PBST稀释转染细胞上清液，50^1/孔，37T:孵育lh，同时蛋白标准品(人IgG)也进行相同的操作，37-C孵育lh。0.25%BSA的PBST(0.05%Tween-20)洗板4次后，加入1:2000稀释碱性磷酸酶标记抗人IgG(Sigma，Cat.No:A3188)，50|iil/L;0.25%BSA的PBST(0.05%Tween-20)洗板4次后，加lmg/ml用二乙醇胺新鲜配制的对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)50^1/孔，避光反应30min;加终止液3MNaOH(50p1/孔)，405nm和490nm双波长读数。根据标准品的结果绘制标准曲线如图2所示，进行x(浓度)，y(吸光度)的直线拟合；求出细胞上清液中融合蛋白的浓度。实验重复三次。结果表明转染CHO细胞48h后，培养上清液中融合蛋白的瞬时表达量为72.3±5.779ng/ml。3)western-blot检测免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2的表达细胞转染48h后，吸弃培养液，用预冷的PBS(pH7.4)洗二次，每孔加入80pllxSDS上样缓冲液(50mmol/LTris，pH6.8，2g/100ml的SDS，10%(体积百分比)甘油，0.1%(体积百分比)溴酚蓝，临用前加入IOOmmol/LDTT)，刮下细胞，将细胞裂解液吸入EP管。IO(TC水浴3min。离心取上清进行10g/100mlSDS-PAGE电泳。电泳结束后将蛋白电转印至硝酸纤维素膜，转印结束后，将分子量标准位置的硝酸纤维素膜剪下。用含5g/100ml脱脂奶粉的TBS(150mmol/LNaCl，50mmol/LTris，pH7.5)室温封闭转印膜2h，然后加入1pg/ml抗FcsRIa单克隆抗体[UPSTATE，Cat.No:06-725用，5g/100ml脱脂奶TBS-T(50mmol/LNaCl，50匪ol/LTris，pH7.5，0.2%(体积百分比)Tween20)稀释]，室温下孵育3h。用TBS-T洗膜3次，每次10min。再加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(中杉金桥，Cat.No:2B-2305。用5g/100ml脱脂奶TBS-T1:5000稀释)，室温下孵育1h。TBS-T洗膜3次，每次10min。用增敏化学发光底物试剂(ECL，AmershamBiosciences公司)检测o结果如图3所示，细胞转染48h后，其培养上清表达免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2，并且在还原条件下单体Fc汰Ia/IgG2分子约为85kDa。4)亲和层析法纯化FcsRIa/IgG2融合蛋白以及非还原SDS-PAGE分析转染细胞24h后，换成无血清培养基CDCHOmedium(Invitrogen产品，Cat.No:10743-029)，5天后收集上清做纯化。用pH7.4的PBS溶液平衡HiTrapMabSelectSuRe1ml柱(GEHealthcareLifeSciences产品，Cat.Nol1-0034-93)10个床体积，流速为0.5ml/min;将经转染得到的60ml上清液用0.45pm滤膜过滤上样。流速为0.5ml/min;用pH7.4的PBS溶液再洗5-10个床体积，流速为0.5ml/min;用lOOmM柠檬酸缓冲液(pH4.0)洗脱，流速为0.5ml/min，收集洗脱峰。纯化收集的样品于EP管中，加入1/9体积的100%三氯乙酸(TCA)采用颠倒IO次混匀。样品置于冰浴中0.5小时。13000rpm,离心10分钟,可见有棕黑色沉淀，弃上清，将EP管倒扣在吸水纸上轻轻控几下，除去残余在管口的液体。加入预冷的40(^1丙酮，冲洗EP管壁，洗去管底和管壁残余的TCA。重悬沉淀，13000rpm,离心10分钟。弃上清，将EP管倒置于吸水纸，如果沉淀仍然有棕色可再用丙酮重新清洗一遍。加入20—50ul电泳上样缓冲液重悬沉淀，100。C煮沸5分钟。TCA(三氯乙酸)沉淀法对收集的纯化样品进行浓縮后，采用非还原SDS-PAGE法分析纯化产物，其中非还原SDS-PAGE法与步骤3)western-blot检测中SDS-PAGE法的区别在于未加DTT，其余步骤完全相同。结果如图4(l,FcsRla/IgG2.2,对照.3,蛋白分子量标准(Fermentas产品))所示，纯化蛋白的纯度达到95%以上，FcsRIa/IgG2的分子量达到170kDa，较免疫球蛋白IgG150kDa的分子量还大。二、免疫融合蛋白FcsRIa/IgG2的功能分析1、ELISA方法检测FcsRIa/IgG2融合蛋白与鼠IgE的结合能力1)ELISA方法检测融合蛋白与鼠IgE的结合本步骤的ELISA方法与步骤一的步骤3的步骤2)的区别在于一抗是10pg/ml的鼠IgE(BDPharmingen，CatNo:55381)，以及待测试样品是将步骤3的步骤2)中的转染CHO细胞48h后的上清液用0.25%BSA-PBST倍比稀释过的，稀释后的融合蛋白的浓度梯度是O、0.452、9.04、18.08、36.15和72.3lng/ml。其余步骤完全相同。结果如图5所示，IgG2能与鼠IgE结合，在包被10pg/ml的IgE的情况下，随着lgG2浓度的增加，结合量也逐渐增加，在浓度为36ng/ml左右时进入平台期。2)融合蛋白与鼠IgE亲和常数测定根据融合蛋白与鼠IgE结合曲线的结果，选择接近饱和(近平台期)的融合蛋白浓度进行亲和力的检测，即36ng/ml。将36ng/ml的融合蛋白与梯度浓度的鼠IgE(6.25ng/ml和12.5ng/ml)混匀，4。C过夜孵育，然后进行ELISA检测。ELI《A检测方法同步骤l)。使用如下公式计算亲和常数K、[Ao/(Ao-A)-l]其中，A指加入抗原后的吸光度值，ao指吸光度值为A时对应的抗原浓度，Aj旨预孵育时不加入鼠IgE的样品的吸光度值。计算不同鼠IgE浓度下的亲和常数(K)，求平均值从而确定二者的亲和常数。表1FcsRIa/IgG2融合蛋白与鼠IgE亲和力测定<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>在鼠IgE浓度分别为6.25ng/ml和12.5ng/ml时，所测得的FcsRIa/mlg(IgG2)融合蛋白与鼠IgE的亲和力分别为2.25x109M"和2.66x109M"，均值为2.42x109M"，属于高亲和力结合。HakimiJ等研究表明(参见，JBiolChem.，199025;265(36):22079-81)，鼠IgE与FcsRIa的结合力低于人IgE与FceRIa的结合力，所以，FcsRla/IgG2融合蛋白与人IgE的亲和力高于2.42xl(^M—、2、FcsRIa/IgG2融合蛋白与人IgE的结合能力分析1)10pg/ml鼠IgE包被96孔板，50^1/孔，4。C过夜；2)0.25%BSA的PBST稀释纯化人血清IgE(BIODESIGN,CatNo:A75320H)分别进行1:500;3:600;1:700;1:800;1:900;1:1000稀释，与4.5ng/mlFcsRIa/mlg混匀，4"C孵育过夜；3)用0.25%BSA的PBST(0.05%Tween-20)洗涤96孔板4次，用1%BSA-PBS封闭(每孔50nl)，37°C，l小时，用0.25%BSA的PBST(0.05%Tween-20)洗涤96孔板4次；4)将步骤2)得到的融合蛋白与人IgE的共同孵育物加入96孔板，50^1/孔，37。C孵育lh，用0.25%BSA的PBST(0.05%Tween-20)洗涤96孔板4次；5)加入1:2000稀释碱性磷酸酶标记抗人IgG，50^1/孔，避光反应30min，用0.25%BSA的PBST(0.05%Tween-20)洗涤96孔板4次；6)加底物NPP(用二乙醇胺新鲜配制，lmg/ml;每孔50^1)，避光反应30min;7)加终止液3MNaOH(每孔50pl)8)405nm和490nm双波长读数FceRIa/IgG2融合蛋白含有IgE高亲和力受体FcsRI的a亚单位完整的细胞外功能域，仍保留与IgE结合能力，并且与IgE亲和力与完整的受体基本一致。结果如图6所示，当人IgE与融合蛋白结合后，融合蛋白暴露出的与IgE的结合位点减少，从而抑制了融合蛋白与96孔板上包被的鼠IgE的结合。结果表明，随着人IgE浓度的增加，与鼠IgE结合的FcsRIa/IgG2融合蛋白量逐渐减少。FceRIa/IgG2融合蛋白高亲和力结合游离IgE(人IgE)，说明可用于治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等过敏性疾病的价值。序列表〈110〉北京精益泰翔技术发展有限公司百泰生物药业有限公司<120〉一种免疫融合蛋白及其编码基因与应用<130〉CGGNARL92504〈160〉2<210>1<211>1303<212〉DNA<213〉人工合成<220〉〈223〉〈400〉1cgccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttc60cactggtgtgcctcagaaacctaaggtgtccctgaaccctcca_tgg33tcgcatctttaa120aggag卿atgtgactctgacctgtaatgggaacaatttctttgaagtgatgctccaccaa.180atggttxcacaatggcagcctgtccgasgagacaaattccagcctgaatattgtgaatgc240ca^atttgaagacagcggagagtacaaatgtcagcaccagceiggtgaatgagagcgaacc300tgtgtacctggaagtgttcagcgactggctgctgctgcaggcctctgctgaggtggtgat360gg鄉gccagcccctgttcctgaggtgcca"tggttggcgcaactgggatgtgtacaaggt420gatctattataaggatggcgaagctctcaagtactggtatgagaaccacaacatctccat480taccaatgccaccgtggaagacagcggaacctactactgtaccggcaaagtgtggcagct540ggactatgagtctgagcccctgaacattaccgtgatcaaggctcctcgggagaagtactg600gctggacaagaccgtggagcgcaagtgctgtgtggagtgccctccctgccctgctcctcc660tgctgccgctccttctgtgttcctgttcccccctaagcccaaggacaccctgatgatctc720ccggacccctgaggtgacctgcgtggtggtggacgtgagccacgaggaccccgaggtgca780gttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcacaatgccaagacaaagccacgggagga840gcagttcaacagcacgttccgtgtggtcagcgtcctcaccgttgtgcaccaggactggct900gaacggc犯gga_gtaca^gtgc犯ggtctcc犯c肌gggcctgcctgcccccatcgagaa960gaccatctccaagaccaagggacagccccgcgagcctcaggtgtacaccctgcccccttc1020ccgggaggagatgaccaagaaccaggtgagcctgacctgcctggtgaagggcttctaccc1080cagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatggccagcct1140ccctcccatgctggactccgacggctccttcttcctgtacagcaagctgaccgtggacaa1200gagccgctggcagcagggcEiacgtgttctcctgctccgtgatgcacgaggctctgcacaa1260ccax:tac3cccagaagagcctgtccctgtctcctggaaagt肌1303<210〉2<211〉431<212〉PRT<213〉人工合成〈220〉<223〉<400>2MetGluThrAspThrLeuLeuLeuTrpValLeuLeuLeuTrpValPro151015GlySerThrGlyValProGinLysProLysValSerLeuAsnProPro202530TrpAsnArgliePheLysGlyGluAsnValThrLeuThrCysAsnGly354045AsnAsnPhePheGluValSerSerThrLysTrpPheHisAsnGlySer505560LeuSerGluGluThrAsnSerSerLeuAsnlieValAsnAlaLysPhe65707580GluAspSerGlyGluTyrLysCysGinHisGinGinValAsnGluSer859095GluProValTyrLeuGluValPheSerAspTrpLeuLeuLeuGinAla100ValValMetGluSerAlaGlu115ArgAsnTrpAsp105GinProLeuPheGlyTrp130GluAlaLeuLys145AlaThrValGluGinLeuAspTyr180LysTrpTyrAsp165GluTyrGly120TyrLysVallieProArgGlu195ValGluCysProPro210PheLeuPheProPro225ProGluValThrTrp150SerSerTrpCysVal135TyrGluAsnHisLeu125Tyr110ArgLysTyr140lieSerlieGlyThrTyrGluProTyr170AsnAsn155CysThrGlyLyslieThrValLeuPro215ProLeu185LysThrValGluCysHisAspGlyThrAsn160ValTrp175LysAlaAsp200AlaProProAlalie190LysCysCysArg205AlaProSerValLysLys230ValValValCys245TrpTyrValAspAspAspAla220MetlieSerThrLeu235SerHisGluAspValGinPheAsn260ArgGluGluGinVal250ValGluValHisThrLysPro275ValLeuThrValValHis290CysLysValSerAsnLys305310SerLysThrLysGlyGin325ProSerArgGluGluMetThrGly265AsnSerThrPheArgThr240ProGlu255AlaLysPhe280AspTrpLeuAsnAsn270ValValSerGin295GlyLeuProAlaArg285LysGluTyrLysGly300lieGluLysProArgLysGluAsnPro330GinPro315GinValTyrThrThrlie320LeuPro335ValSerLeuThrCysLeu340345350ValLysGlyPheTyrProSerAsplieAlaValGluTrpGluSerAsn355360365GlyGinProGluAsnAsnTyrLysThrThrProProMetLeuAspSer370375380AspGlySerPhePheLeuTyrSerLysLeuThrValAspLysSerArg385390395400TrpGinGinGlyAsnValPheSerCysSerValMetHisGluAlaLeu405410415HisAsnHisTyrThrGinLysSerLeuSerLeuSerProGlyLys420425430权利要求1、一种蛋白，是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能与IgE分子结合的由1)衍生的蛋白质。2、权利要求l所述蛋白的编码基因。3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于所述编码基因为如下l)或2)或3)的基因1)编码序列是序列表中序列1的自5'端第8位至1303位所示的基因；2)在严格条件下与1)限定的基因杂交且编码权利要求1所述蛋白的基因；3)与1)限定的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。4、含有权利要求2或3所述基因的重组载体或重组菌。5、根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体是在PCI/neo的多克隆位点插入权利要求2或3所述基因得到的重组载体。6、含有权利要求2或3所述基因的转基因细胞系。7、根据权利要求6所述的转基因细胞系，其特征在于所述转基因细胞系是含有权利要求2或3所述基因的中国仓鼠卵巢细胞。8、一种制备权利要求1所述蛋白的方法，是培养权利要求6或7所述转基因细胞系，得到所述蛋白。9、根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述细胞培养的条件是35-39'C，3-8%(体积百分比)C02，8-12%(体积百分比)胎牛血清的DMEM培养基；优选是37°C，5%C02，10%胎牛血清的DMEM培养基中培养。10、权利要求1所述的蛋白或权利要求2或3所述的基因在制备治疗过敏性疾病的药物中的应用；所述过敏性疾病是哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎或食物过敏。全文摘要本发明公开了一种蛋白。本发明提供的蛋白是如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且能与IgE分子结合的由1)衍生的蛋白质。该蛋白与IgE较高的亲和力；FcεRIα和IgG2均来自人源性蛋白，无抗原性，无需进行人源化改造；半衰期较长，分子量达170kDa，较sFcεRIα大。具有潜在的治疗哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎及食物过敏等过敏性疾病的价值。文档编号C07K19/00GK101633698SQ20091009182公开日2010年1月27日申请日期2009年8月26日优先权日2009年8月26日发明者何丽华,喻志爱,扈艳红,李先钟,峰林,白先宏,红程,胡品良,褚学者,赵天贵,马金伟申请人:北京精益泰翔技术发展有限公司;百泰生物药业有限公司