能与NKp80受体结合的多肽及其应用的制作方法

专利名称：：能与NKp80受体结合的多肽及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及免疫学领域，特别涉及能与NKp80受体结合的多肽及其应用。
背景技术：
：天然免疫系统中最为重要的一类细胞是自然杀伤细胞(NaturalKiller，NK细胞)，它通过颗粒酶、分泌细胞因子、TRML、FasL等来杀伤机体中被感染的细胞和癌细胞。NK细胞表面分布着一系列活化性受体和抑制性受体，抑制性受体结合其配体后将向细胞内传递抑制信号，抑制NK细胞的活化。NK细胞表面表达的KIR受体是典型的抑制性受体，它能够识别MHC-I类分子，机体内正常细胞均表达MHC-I类分子，可通过KIR受体传递抑制信号，防止NK细胞被活化攻击正常细胞。被病菌感染的细胞和癌细胞由于丢失了MHC-I类分子，因此会被NK细胞杀伤。活化性受体结合其配体后将导致NK细胞活化，进而行使杀伤功能。但是过度的活化会导致NK细胞攻击机体内正常细胞，引发自身免疫性疾病。正常机体内，NK细胞的活化性受体和抑制性受体所传递的信号处于平衡状态，使得NK细胞既能行使免疫监视功能，又不会杀伤正常细胞。NKp80受体是新近发现的NK细胞上的活化性受体，它的配体是AICL。当AICL与NKp80结合后，就会向NK细胞内传递活化信号。当活化信号过强，则会打破NK细胞活化信号和抑制信号的平衡，导致NK细胞过度活化。NK细胞的过度活化会使其攻击正常细胞，导致自身免疫性疾病。目前治疗自身免疫性疾病的常规手段是使用免疫抑制剂，但常用的免疫抑制剂特异性差，在机体内所有部位都会抑制免疫应答，长期使用会导致机体免疫能力全面低下，易于发生继发性感染。目前已有实验室制备出重组表达的AICL分子胞外段蛋白，用此重组蛋白结合NK细胞表面的NKp80受体，可以抑制NK细胞的活化，降低NK细胞的细胞毒活性(Welte，S.，etal.,力/ai/^erac"'OT.NatImmunol,2006.7(12):p.1334-42.)。该方法具有一定的特异性，对NK细胞具有比较好的抑制效果，但是重组AICL胞外段蛋白的制备和纯化成本高，生产周期长；蛋白分子量大，氨基酸残基多，在机体内通透性低，难以有效地到达病灶部位；大分子蛋白容易诱发机体产生抗体，中和药物蛋白，降低疗效。
发明内容本发明的目的在于提供一种能与NKp80受体结合的多肽。本发明提供的多肽，是序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。该多肽是能与NKp80受体特异性结合的配体，可以用人工合成方法直接合成，也可以将这些多肽的编码基因融合或分别插入到表达载体，然后转染宿主细胞，用基因工程方法生产。上述的多肽在制备抑制PBMCs细胞毒活性的药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述的多肽在制备抑制M细胞毒活性的药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述的多肽在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用也属于本发明的保护范围之内。上述自身免疫性疾病是NK细胞介导的自身免疫性疾病。本发明的另一目的在于提供一种治疗自身免疫性疾病的药物。本发明提供的药物的活性成分是上述的多肽。上述自身免疫性疾病是NK细胞介导的自身免疫性疾病。上述药物可包括一种或多种药学上可接受的载体。上述载体可以是稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和/或润滑剂。上述药物还可包括香味剂或甜味剂。上述药物均可以按照药学领域的常规方法制备出以下剂型胶囊、注射液、软胶囊、片剂、滴丸、冻干粉针、口服液或分散片。NK细胞表达的NKp80和靶细胞表达的配体AICL结合后会活化NK细胞，加上其他NK细胞的活化因素很容易造成NK细胞的过度活化，导致病理损伤自身免疫性疾病。实验证实本发明多肽能与NKp80结合，可有效封闭NKp80与AICL的结合位点，抑制NK细胞的细胞毒活性，可作为NK细胞的抑制剂，用于治疗自身免疫性疾病。本发明以AICL分子为参考模板，设计、合成一组能与NKp80特异结合的小分子多肽，能选择性的抑制NK细胞过度活化，而不是全面降低机体的免疫应答能力，有利于避免长期使用免疫抑制剂所造成的副作用；所合成的多肽分子量小，极少引起机体的免疫反应，且溶解性好、通透性强，易于到达作用部位发挥作用；使用人PBMCs和NK细胞进行实验，多肽能实现和NKp80单抗及可溶性AICL胞外段蛋白相似的抑制作用，同时还避免了蛋白大分子的副作用；本发明的多肽可采用现有的常规方法制备得到，技术成熟，可用于治疗自身免疫性疾病。图1为本发明的多肽设计示意图，其中A为CD69分子三维空间结构示意图；B为AICL分子模拟三维空间结构示意图；C为本发明的多肽的参考模板在AICL分子模拟三维空间结构示意图中的位置。图2为本发明的多肽对NKp80单克隆抗体结合NKp80的抑制效应。图3为本发明的多肽对PBMCs杀伤U937细胞作用的抑制效应。图4为本发明的多肽对NK细胞杀伤U937细胞作用的抑制效应。具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。实施例所用仪器如下微量移液器购自法国Gilson公司，MACS磁性分选仪购自MiltemyiBiotec公司，离心机购自德国Hettich公司，净化工作台购自山东省济南市空气净化消毒设备厂，C02培养箱购自ThermoForma公司，流式细胞仪购自BD公司，Y计数仪购自中佳光电仪器公司。实施例l、本发明的多肽的合成及其功能检测一、NKp80受体的多肽配体的设计和合成1、NKp80受体的多肽配体的设计1)建立AICL的模拟三维结构AICL三维结构尚未解析，在蛋白数据库PDB中搜索发现已解析了三维结构的蛋白中，CD69与AICL同源性最高。以CD69的三维结构为基础(图1A)，根据Uniprot数据库提供的AICL氨基酸序列(数据库中序列号Q92478)，通过软件3D-JIGSAW计算模拟，构建出AICL的模拟三维结构(图1B)2)AICL保守性序列筛选将AICL氨基酸序列进行BLAST分析，获得与AICL具有同源性的所有蛋白信息。从中选出7个序列同源性较高的蛋白，用ClustalW2软件分析它们与AICL的氨基酸序列，最终在AICL氨基酸序列中找出7个保守性区域。3)确定AICL与NKp80相互作用的位点根据进化论，蛋白质的保守序列区域往往具有重要的生物学功能，否则其在进化过程中就会发生变化。AICL作为NKp80受体的配体，主要的生物学功能是与NKp80结合，活化NK细胞。配体-受体相互作用发生的位点通常位于蛋白空间结构的外表面，根据建立的AICL模拟空间结构，AICL的7个保守性序列区域中有3个位于AICL的外表面(图1C)。2、NKp80受体的多肽配体的合成因此根据这三个保守性序列区域为模板，设计氨基酸序列如序列表中序列1所示的多肽，命名为P1，其等电点为8.85，分子量为1128.31。另夕卜，设计HBsAg被小鼠TCR识别的核心多肽区的无关肽，作为阴性对照，命名为Px。氨基酸序列如序列2所示。设计的多肽Pl和Px由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，纯度>95%，用于如下实验。二、多肽的功能检测1、本发明多肽抑制NKp80单克隆抗体与NKp80的结合实验材料健康人外周血取自安徽省血液中心，淋巴细胞分离液购自Solarbio公司，APCRatanti-humanNKp80购自R&D公司(Cattt:FAB1900A)，PEMouseanti-humanCD56购自BD公司(Cat#:555516)，PerCP-CY5.5Mouseanti-humanCD3购自BD公司(Cat#:340949)，RPMI-1640培养基购自Invitrogen公司。1)健康人外周血单个核细胞(PBMCs)的分离获得用PBS(pH=7.2)稀释外周血浓縮白膜层后加至淋巴细胞分离液上进行密度梯度离心380g离心15分钟，20。C;吸取中界面层的单个核细胞，使用PBS(pH=7.2)洗涤2次，500g离心5分钟；细胞计数后，使用RPMI-1640完全培养基调整细胞浓度为1Xl(T细胞/ml，37°C，5%0)2培养，得到PBMCs细胞悬液。2)多肽与PBMCs共孵育及抗体标记向步骤1)得到的新鲜PBMCs细胞悬液中加入PBS(pH=7.2)溶解的PI至终浓度500nM，室温孵育2小时；阴性对照组是将PI换成Px，其它步骤相同；空白组直接加入等体积的PBS(pH=7.2)。多肽孵育后，按照流式细胞术的常规操作，加入PEmouseanti-humanCD56，PerCPCY5.5mouseanti-humanCD3，APCratanti-humanNKp80孵育(抗体的使用剂量严格按照抗体说明书执行，10uL/l(T个细胞)，进行流式细胞术检测。3)流式细胞术检测选取NK细胞(CD3-CD56+)分析APCratanti-humanNKp80的结合情况，实验重复3次，结果如图2(横坐标代表荧光强度、纵坐标代表细胞数)所示，PBS组NKp80阳性率为87.75%，阴性对照组(无关月太Px)NKp80阳性率为82.00%，PI实验组NKp80阳性率为73.30%。无关肽有轻微的抑制作用，属于非特异性结合，PI能显著抑制NKp80单克隆抗体结合NKp80。2、本发明多肽对PBMCs细胞毒活性的抑制作用实验材料健康人外周血取自安徽省血液中心，淋巴细胞分离液购自Solarbio公司，铬酸钠(51Cr)购自PerkinElmer公司，U937细胞系购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，产品目录号为CRL-1593.2,RPMI-1640培养基购自Invitrogen公司，新生牛血清(超级)购自上海依科赛生物制品有限公司。PBMCs表达NKp80，U937细胞表达AICL。本实验用PBMCs为效应细胞，U937细胞为靶细胞，加入肽段，用"Cr同位素释放法测定PBMCs的杀伤效率(在实施例中每实验组设平行对照3个)。1)多肽与效应细胞共孵育向96孔圆底板每个孔加入4X105个效应细胞PBMCs(PBMCs的获得步骤与步骤l相同)(效靶比40:1)，同时往不同的孔中加入PBS(pH二7.2)溶解的PI和Px，其中无关肽Px为阴性对照。效应细胞和多肽总体系为100uL，多肽终浓度均为10nM。空白对照组加入相同体积的PBS(PH=7.2)。37°C、5%(1)2孵育1小时，备用。2)510标记靶细胞(U937细胞)用200微居的铬酸钠(51Cr)标记106个耙细胞U937，37孵育1小时，每10分钟摇晃一次混匀细胞；RPMI-1640完全培养基洗涤细胞3次，3000rpm离心5分钟；用RPMI-1640完全培养基将细胞浓度调整为1X10s个/ml，备用。3)效应细胞杀伤耙细胞将靶细胞加至预先调好效应细胞数量的％孔圆底板，每孔加入100uL。实验中设定最大释放组(104个靶细胞加2%TritonX-100溶液，总体积200uL)和自然释放组(104个靶细胞，总体积200uL),完成后将培养板稍作离心，37°C、5%C02孵育4小时，取100"L上清进行y计数，按照如下公式计算杀伤率杀伤率=(实验组CPM值-自然释放组CPM值)/(最大释放组CPM值-自然释放组CPM值)X100%实验重复3次，CPM数值如表1所示，换算成杀伤率的结果如图3所示，Pl组的PBMCs对耙细胞的杀伤率为36.44%，阴性对照组(Px)的PBMCs对耙细胞的杀伤率为47.33%，空白对照组(PBS)的PBMCs对靶细胞的杀伤率为45.20%,肽段Pl能够抑制PBMCs杀伤靶细胞U937，空白对照(PBS)和无关肽阴性对照(Px)均没有抑制作用。表1.各实验组的CPM数值(括号里为标准差)实验组CPM值自然释放组CPM值最大释放组CPM值实验组(Pl)5518.00(461.04)1237.33(69.58)12986.00(262.52)空白对照实验组(PBS)6547.33(324.30)1237.33(69.58)12986.00(262.52)阴性对照实验组(Px)679謹(423.21)1237.33(69.58)12986.00(262.52)3、本发明多肽对NK细胞的细胞毒活性的抑制作用本实验用NK细胞为效应细胞，U937细胞为靶细胞，加入肽段，用，r同位素释放法测定NK细胞的杀伤效率(在实施例中每实验组设平行对照3个)。1)NK细胞的分离淋巴细胞分离液密度梯度离心获得的PBMCs(PBMCs的获得步骤与步骤1相同)后用MACSbuffer重悬，进行细胞计数，调整细胞浓度使40uL细胞悬液有2X107个细胞；用NKcellisolationkit(MiltemyiBiotec公司(Cat#130-092-657))中提供的抗体、磁珠试剂进行标记(参加Kit说明书)；用MACSbuffer润洗MACS分离柱，缓慢加入标记的细胞悬液，收集流出液，即为NK细胞。经流式细胞术分析鉴定，NK细胞纯度大于859L2)多肽孵育NK细胞向96孔圆底板每个实验孔加入5X104个效应细胞NK细胞，同时往不同的孔中加入PBS(pH=7.2)溶解的Pl和Px，其中无关肽Px为阴性对照。效应细胞和多肽总体系为100uL，多肽终浓度均为10nM。空白对照组加入相同体积的PBS(pb7.2)。37°C、5%0)2孵育1小时，备用。3)51Cr标记靶细胞U937用200微居的铬酸钠(5'Cr)标记106个靶细胞U937，37孵育1小时，每10分钟摇晃一次混匀细胞；RPMI-1640完全培养基洗漆细胞3次，3000rpm离心5分钟；用RPMI-1640完全培养基将细胞浓度调整为1x105个/ml，备用。4)效应细胞杀伤靶细胞将靶细胞加至预先调好效应细胞数量的96孔圆底板，每孔加入100uL。实验中设定最大释放组(104个靶细胞加2%TritonX-100溶液，总体积200nL)和自然释放组(104个靶细胞，总体积200uL)，完成后将培养板稍作离心，37°C、5%C02孵育4小时，取100uL上清进行y计数，按照如下公式计算杀伤率杀伤率=(实验组CPM值-自然释放组CPM值)/(最大释放组CPM值-自然释放组CPM值)X100%实验重复3次，CPM数值如表2所示，换算成杀伤率的结果如图4所示，Pl组的NK细胞对靶细胞的杀伤率为29.59%，阴性对照组(Px)的NK细胞对耙细胞的杀伤率为36.41%，空白对照组(PBS)的NK细胞对靶细胞的杀伤率为38.56。/c)，肽段P1能够抑制NK细胞杀伤靶细胞U937，空白对照和无关肽阴性对照均没有抑制作用。实验结果与PBMCs—致。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>序列表<110〉中国科学技术大学〈120〉能与NKp80受体结合的多肽及其应用<130〉CGGNA壯92519<160〉2〈210〉1<211〉8〈212>PRT<213>人工合成〈220〉〈230〉〈400>1GluMetAsnPheLeuArgArgTyr15〈210〉2〈211〉8〈212〉PRT〈213>人工合成〈220〉〈230〉〈400>2lieLeuSerProPheLeuProLeu1510权利要求1、一种多肽，是序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。2、权利要求1所述的多肽在制备抑制PBMCs细胞毒活性的药物中的应用。3、权利要求1所述的多肽在制备抑制NK细胞毒活性的药物中的应用。4、权利要求1所述的多肽在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。5、如权利要求4所述的应用，其特征在于所述自身免疫性疾病是NK细胞介导的自身免疫性疾病。6、一种治疗自身免疫性疾病的药物，其活性成分是权利要求1所述的多肽。7、如权利要求6所述的药物，其特征在于所述自身免疫性疾病是NK细胞介导的自身免疫性疾病。全文摘要本发明公开了一种多肽。本发明提供的多肽是序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的多肽。本发明的多肽能与NKp80结合，可有效封闭NKp80与AICL的结合位点，抑制NK细胞的细胞毒活性，可作为NK细胞的抑制剂，用于治疗自身免疫性疾病。并且该多肽分子量小，极少引起机体的免疫反应，且溶解性好、通透性强，易于到达作用部位发挥作用。文档编号C07K7/00GK101638431SQ20091009202公开日2010年2月3日申请日期2009年9月4日优先权日2009年9月4日发明者汭孙,田志刚,郑晓东,黄海华申请人:中国科学技术大学