一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法
【专利摘要】本发明涉及一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，通过设计引物，构建重组表达载体pET-15b-hcGSN，利用IPTG诱导表达得到N端带有His标签的重组目的蛋白hcGSN，并经过镍离子亲和层析一步纯化可以得到纯度较高的重组蛋白hcGSN。本发明还在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点，需要时可以使用凝血酶去除His标签。本发明提供了一种生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化能够高效、简便、稳定地获得高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白hcGSN。该重组蛋白为相关科学研究提供物质基础，未来可能被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。
【专利说明】一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因工程【技术领域】,涉及一种人胞质凝溶胶蛋白(human cytoplasmicgelsolin，简称hcGSN)的表达纯化方法，包括其工程菌的构建、重组人胞质凝溶胶蛋白的表达和纯化。
【背景技术】
[0002]凝溶胶蛋白普遍存在于细胞、血液和脑脊液中，是一种多功能的肌动蛋白结合蛋白。凝溶胶蛋白的经典功能是调节肌动蛋白丝聚合、解聚和剪切，从而在细胞骨架结构重排和细胞运动等过程中发挥重要作用。同一个凝溶胶蛋白基因由于外显子的不同剪接方式，产生了两种形式的凝溶胶蛋白，包括胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白。血浆凝溶胶蛋白比胞质凝溶胶蛋白在N端多出25个氨基酸残基，其余氨基酸序列完全相同。大量研究证据表明凝溶胶蛋白与多种疾病的发生和发展密切相关。目前血浆凝溶胶蛋白被应用于治疗感染、急性损伤和胺毒症等。
[0003]最新的研究发现，胞质凝溶胶蛋白与肿瘤和阿尔茨海默症等疾病相关。与正常组织相比，胞质凝溶胶蛋白在多种癌变组织中的表达呈下降趋势，如乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肠癌及肺癌等。当癌细胞中过量表达胞质凝溶胶蛋白时，细胞集落的形成显著受到抑制。此外，胞质凝溶胶蛋白可能通过抑制癌细胞的生长来抑制机体内肿瘤的生长和转移等。阿尔茨海默症是一种以学习、记忆和认知障碍为主要特征的神经退行性疾病，其特征包括细胞外老年斑、细胞内神经纤维缠结和神经元丢失等。阿尔茨海默症患者脑中老年斑的主要成分是β_淀粉样肽。目前已有多个研究小组尝试使用凝溶胶蛋白来治疗阿尔茨海默症，并且一致发现胞质凝溶胶蛋白和血浆凝溶胶蛋白都能够清除阿尔茨海默症中的老年斑，降低淀粉样肽的水平。
[0004]未来胞质凝溶胶蛋白有望被应用于预防和治疗肿瘤与阿尔茨海默症等疾病。因此，在体外过量表达并大量纯化胞质凝溶胶蛋白将为相关研究奠定基础。但是目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。因此，需要对该蛋白的表达纯化方法做进一步的改进。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，解决目前存在胞质凝溶胶蛋白表达量低和纯化困难等问题。
[0006]本发明通过以下技术方案来实现:一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，该方法包括以下步骤:
(I)构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因(hcGSN)的重组表达载体pET-15b-hcGSN，主要是以人血浆凝溶胶蛋白cDNA (GenBank: X04412.1)为模板，通过设计上游引物FW(hcGSN):5' - CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC -3'和下游引物 RV (hcGSN): 5' -CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3'，PCR获取人血浆凝溶胶蛋白基因，构建入表达载体得pET-15b-hcGSN ；
(2)将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株；
(3)将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37°C诱导表达4小时；
(4)5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清；
(5)将上清上样于镍离子亲和层析柱NiSepharose 6 Fast Flow,纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。
[0007]进一步的，在所述的His标签与hcGSN的氨基酸序列之间还设计有凝血酶的切割位点，即 Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser。
[0008]采用上述技术方案的积极效果:本发明利用了基因工程的方法，诱导表达人胞质凝溶胶蛋白，并利用镍离子亲和层析一步纯化等简便技术，可以得到较高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白；本发明实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化后每升发酵液可以获得30mg带有His标签的重组蛋白hcGSN。在His标签与hcGSN的氨基酸序列之间设计有凝血酶的切割位点(Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser),需要时可以使用凝血酶去除His标签；该方法提供了一种高效生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，采用大肠杆菌表达系统，能够快速、简便、稳定地获得高纯度的人胞质凝溶胶蛋白。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1通过菌落PCR方法鉴定转化有重组质粒pET-15b_hcGSN的阳性克隆，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道I为阳性克隆的菌落PCR产物；
图2通过限制性内切酶酶切的方法鉴定重组质粒pET-15b-hcGSN，其中，DNA琼脂糖电泳中泳道M为DNA分子量标准；泳道I为重组质粒pET-15b-hcGSN的XhoI酶切产物；
图3通过SDS-PAGE凝胶电泳分析IPTG诱导下大肠杆菌BL21中重组蛋白hcGSN的表达情况，其中M代表蛋白分子量标准；泳道I为未经IPTG诱导的对照组；泳道2为0.4mMIPTG诱导组；
图4通过SDS-PAGE凝胶电泳分析大肠杆菌表达的重组蛋白hcGSN的可溶性，其中，M代表蛋白分子量标准；泳道I为诱导后细菌裂解液上清；泳道2为诱导后细菌裂解液沉淀；
图5通过SDS-PAGE凝胶电泳分析经亲和层析柱Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化的hcGSN蛋白，其中，M为蛋白分子量标准；泳道I为上样样品；泳道2-5为从亲和层析柱洗脱的hcGSN蛋白样品；
图6通过Western blot鉴定重组蛋白hcGSN，其中，M为蛋白分子量标准；泳道I为SHSY-5Y细胞的总蛋白；泳道2为纯化的hcGSN蛋白样品。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制:
实施例1
合成扩增人胞质凝溶胶蛋白hcGSN基因的引物，引物设计如下:上游引物 FW(hcGSN):5/ - CAGGCCTCGAGGTGGTGGAACACCCCGAGTTCCTC-3'；
下游引物 RV(hcGSN):5' -CACGCCTCGAGCTAGGCAGCCAGCTCAGCCATGG-3'；
其中上游引物和下游引物中都引入了的限制性内切酶通Ol的单酶切位点。
[0011]实施例2
本实施例说明pET-15b-hcGSN重组表达载体的构建。
[0012]以人血浆凝溶胶蛋白cDNA (GenBank: X04412.1)为模板，使用实施例1中的上游引物FW(hcGSN)和下游引物RV(hcGSN)，通过PCR扩增hcGSN基因。具体PCR程序如下:95°C预变性5分钟；95°C变性I分钟，64°C退火I分钟，72°C延伸2分钟，总循环数是25 ;最后72°C延伸10分钟。用限制性内切酶XhoI分别酶切PCR产物和原核表达载体pET15b。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，用胶回收试剂盒回收得到相应的DNA片段。利用T4 DNA连接酶在16°C进行过夜连接，并将连接产物转化于大肠杆菌DH5a感受态细胞，37°C培养。从转化平板上挑取单克隆，利用菌落PCR的方法来筛选含有pET-15b-hcGSN重组表达载体的阳性克隆。实验结果(见图1)显示，经菌落PCR得到分子量大约为2200 bp的PCR扩增产物(泳道1)，初步鉴定为阳性。从筛选出的阳性克隆中提取质粒，并进行XhoI单酶切鉴定。如图2中泳道I显示，重组质粒经XhoI单酶切得到分子量大约为2200 bp的hcGSN DNA片段。另一个分子量大约为5700bp的DNA片段为pET-15b载体的酶切片段。最后将重组质粒pET-15b-hcGSN进行DNA序列分析测定，测序结果完全正确，证明pET-15b_hcGSN表达载体构建成功。
[0013]实施例3
本实施例说明hcGSN重组蛋白的表达。
[0014]将实施例2构建好的pET-15b-hcGSN重组表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得含有重组质粒的工程菌株。挑取工程菌株的单菌落，接种于LB液体培养基，在37°C下培养过夜。第二天按照1%接种量转至新鲜LB培养基，37°C震荡培养至OD6tltlnm达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.4的IPTG诱导4小时。同时设置未加IPTG诱导的菌液作为对照。然后收集菌液，于5000rpm离心获得菌体沉淀。向沉淀中加入SDS-PAGE凝胶电泳的上样缓冲液 50mM Tris-HCl (含 2% SDS, 0.1% 溴酚蓝，10% 甘油，50 mM NaCl, 0.5 mM PMSF,IOOmM DTT, pH 6.8)，裂解大肠杆菌。然后进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测hcGSN重组蛋白的表达情况。如图3显示，未经IPTG诱导的对照组(泳道I)在90kD附近无蛋白条带出现。在
0.4mM IPTG的诱导下(泳道2)，hcGSN重组蛋白有显著性表达，在90kD附近出现明显条带，与预期结果相符。这一结果说明hcGSN重组蛋白在大肠杆菌中得到有效的表达。
[0015]收集0.4mM IPTG诱导4h后的工程菌，加入裂解液(50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl，ImMPMSF，pH8.0)重悬菌体，并置于冰浴中超声波裂解。同时设置未加IPTG诱导的菌液作为对照。然后将细菌裂解液于15，000 rpm离心20分钟。分别获取上清和沉淀，利用SDS-PAGE凝胶电泳，分析目的hcGSN重组蛋白在大肠杆菌中是否为可溶性表达。从图4中可以看出，在0.4mM IPTG的诱导下，hcGSN重组蛋白主要在上清(泳道I)中表达，沉淀(泳道2)中表达量相对较低。说明在37 1:培养下，hcGSN重组蛋白主要以可溶形式存在。
[0016]实施例4
本实施例说明hcGSN重组蛋白的分离纯化。
[0017] 离心收集0.4 mM IPTG诱导4小时后的hcGSN表达菌。在冰上超声波破碎后，15, OOO rpm离心20分钟,收集上清。将上清上样于镍离子亲和层析柱Ni Sepharose 6 FastFlow (购自GE Healthcare公司)。分别用含IOmM咪唑和60mM咪唑的清洗缓冲液(50 mMTris-HCl, 50 mM NaCl, pH 8.0)清洗亲和层析柱，除去非特异性结合的杂蛋白。然后使用含有100 mM咪唑的洗脱缓冲液(50mMTris-HCl，50mMNaCl，pH 8.0)洗脱hcGSN蛋白，并利用SDS-PAGE凝胶电泳检测hcGSN蛋白的纯化效果。收集亲和层析柱的洗脱液，进行SDS-PAGE凝胶电泳，检测hcGSN蛋白的纯化效果，合并纯度较高的蛋白。如图5所示，与泳道I的上样样品相比，泳道2-5中经过亲和层析纯化的hcGSN蛋白的纯度达到90%以上。
[0018]使用超滤离心管浓缩经过亲和层析纯化的hcGSN蛋白样品，然后将其上样于用缓冲液(50mM Tris-HCl, 5OmM NaCl, pH 8.0)平衡好的凝胶过滤层析柱S印hadex G25 (购自GE Healthcare公司)进行脱盐处理。IL发酵液所得菌体经纯化后最终可以得到30mg纯度在90%以上的hcGSN蛋白。
[0019]实施例5
本实施例说明hcGSN重组蛋白的鉴定。
[0020]为了进一步鉴定纯化出的hcGSN重组蛋白，我们分别将人神经母细胞瘤SHSY-5Y细胞总蛋白和纯化的hcGSN蛋白制样进行Western blot。首先，将制备好的样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后将样品转移到硝酸纤维素膜上。用5%的脱脂牛奶封闭硝酸纤维素膜I小时后，按1:1000的比例加入抗凝溶胶蛋白的单克隆抗体。在37°C下孵育2小时，然后用含0.05% Tween-20的TBS缓冲液洗去一抗，再加入辣根过氧化物酶标记的IgG 二抗，孵育I小时后，洗去二抗，再利用ECL显色发光试剂盒并结合胶片显影观察实验结果。如图6所示，抗凝溶胶蛋 白的特异性抗体可以识别hcGSN重组蛋白(泳道2)，目的蛋白的条带出现在预期位置(90 kD附近)，与SHSY-5Y细胞表达的内源性hcGSN分子量相同(泳道I)。
[0021]本发明利用了基因工程的方法，诱导表达人胞质凝溶胶蛋白，并利用镍离子亲和层析一步纯化等简便技术，可以得到较高纯度的重组人胞质凝溶胶蛋白；本发明实现了人胞质凝溶胶蛋白在大肠杆菌中的大量可溶性表达，经镍离子亲和层析纯化后每升发酵液可以获得30mg带有His标签的重组蛋白hcGSN ;该方法提供了一种高效生产重组人胞质凝溶胶蛋白的方法，采用大肠杆菌表达系统，能够快速、简便、稳定地获得高纯度的人胞质凝溶胶蛋白。
【权利要求】
1.一种人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)构建含有人胞质凝溶胶蛋白基因(hcGSN)的重组表达载体pET-15b-hcGSN； (2)将重组表达载体pET-15b-hcGSN转化于大肠杆菌BL21(DE3)，得到含有重组质粒的工程菌株； (3)将工程菌接种于LB液体培养基中培养，加入终浓度为0.4mM的IPTG，于37°C诱导表达4小时； (4)5000rpm离心收集菌体并于冰浴中超声波裂解，然后15000rpm离心获取上清； (5)将上清上样于镍离子亲和层析柱NiSepharose 6 Fast Flow,纯化得到N端带有His标签的重组蛋白hcGSN。
2.根据权利要求1所述的人胞质凝溶胶蛋白的表达纯化方法，其特征在于:所述的His标签与hcGSN的氨基酸序列之间还设计有凝血酶的切割位点，即Leu-Val-Pro-A rg-Gly-Ser0
【文档编号】C12N15/70GK104004780SQ201410268959
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年6月17日 优先权日:2014年6月17日
【发明者】吉丽娜, 华子春, 赵熙 申请人:南京大学