专利名称：作为色素上皮移植基底的显微构建组织的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及眼睛失常的治疗领域，更具体地说是治疗视网膜疾病，如年龄相关性黄斑变性、视网膜色素变性(pigmenttosa)，和其他的视网膜疾病。另外，本发明还涉及用于修饰组织的方法和装置，并且涉及细胞和组织的移植的方法和装置。
背景技术：
视网膜疾病，如与年龄有关的黄斑变性(AMD)，视网膜色素变性(RP)和其他疾病，是工业化世界严重视力损伤或致盲的主要原因。
与年龄有关的斑底退化(AMD)的一个真质标记，就象在RP中的情况一样，就是视网膜色素上皮细胞(RPE)的细胞损失和退化。布鲁赫膜也是要被损伤的一个令人担心的部位；这样的损伤会成为视网膜光感受器的存活和维持其适当的功能来说是极其重要的，它是眼睛中唯一直接感受光亮的细胞。在视网膜疾病中，如AMD和RP中RPE的退化是与感光功能的丧失有关，并且视力的损伤是与这些疾病相关联的。
RPE是与神经视网膜相邻近的，直接与视网膜光感受器相对布置的。RPE细胞以在体内的形式形成一个细胞厚圆石块那样的组织，它们是通过紧密的接合处联接一起的，带有不同的顶端和基底膜。RPE细胞在体内以高密度形式紧密地聚集在一起生长，形成一紧密的上皮细胞，它起到一个屏障的作用，用来调节光感受器和在下的布鲁赫膜之间、脉络膜(choroid)和脉络膜的脉管系统之间的输送。RPE的顶端部分包围和吞没光感受器外部(外管节)，为了让它发挥吞灭和消化脱落光感受器顶端吸头(tips)的富有活力的功能和发挥使视网膜在光色素(photopigments)中再循环的功能。RPE的底部与布鲁赫膜相对布置，一个高度血管化(vascularized)的支持膜(它提供所需氧气和营养分给RPE和光感受器并且阻止二氧化碳和其它废物的积累，这些废物会损害视网膜的功能)。布鲁赫膜的损伤会起因于来自外段组织的代谢而生成的废物的积累，这种损害表现为例如阻止氧气、生长因子和废物生成物的代谢。这种受损的代谢的障碍导致光感受器中缺氧。造成的反应可以这样去想，存活信号被发送去引发新生血管生长，和产生湿性AMD。
虹膜色素上皮细胞(IPE)，它象RPE那样来源于胚胎的神经外胚层(neuroectoderm)，与眼球内与视网膜相对的那部分虹膜相毗连。这样，在完整的眼球中IPE细胞的位置是远离视网膜光感受器的。虽然，关于IPE细胞的生理学和功能方面尚有许多知识尚未弄清楚，象在培养基中的RPE细胞、IPE细胞已经显出能吞灭外光感受器外段的能力。
RPE细胞会在人工的基底上生长(Pfeffer、B、A第10章，“人和猴子视网膜色素上皮细胞的培养的改进方法”《Progress in Retinal Research》杂志，第10卷(1991年)版Osborn，N，和chader，J.；Lu及其它合著人，《Biomater.Sci.Polymer》第9版1187-1205(1998年)，和Lu及其他合著人，《Biomaterials》202351-2361(1999年)。另外，一直以来还有试图用晶状体囊组织作为一个供RPE和IPE细胞成长的培养基(Hartman及其他合著人，《Graefe′s Archiv clin Exp Ophthalmol》237940-945(1999)；Nicolini及其他合著人，《Acta Ophthalmol Scand》2000年10月；78(5)527-31)。
在退行性和进行性视网膜疾病的治疗中，许多方法已经被试验过。例如，曾经试图对AMD进行的治疗包括光动力治疗、辐射治疗和黄斑移位，来修复损伤、阻止进行性发展或对疾病的影响进行补偿。然而，这些方法一直没有重大突破。
因为RPE细胞损失在许多视网膜疾病中发生，细胞的移植作为对AMD和其他疾病的治疗及可能的治愈具有很大的吸引力。为了替换损失的RPE细胞，直接移植RPE细胞到视网膜已经被尝试过。然而，这样的方法在过去没有获得成功，部分原因是由于移植细胞功能丧失，部分原因是细胞被移植的动物所排斥(拒绝)。
RPE细胞的移植已经被建议作为一种治疗视网膜营养不良的方法(美国专利US5,962,027和US6,045,791)。所有专利和出版物在此被取名supra和infra，两个都作为一个整体收编参考。此外，实验证明，IPE细胞可以代替RPE细胞，它引出将IPE细胞移植进动物的初步尝试，为了改善AMD症候(Abe及其他著作者，Tohoku J.Exp.Med.189295-305(1999年)、Abe及其他著作，Cell Transplantation 8(5)501-10(1999年)；Schraermeyer及其他著者，Invest.Opth.Vis.Sci.40(7)1545-56(1999年)；Thumann及其他著者《Transplantation》68(2)195-201(1999年)；Abe及其他著者《Current EyeResearch》20(4)268-275(2000年)；Lappas及其他著者，Graefes′s Arch Clin ExpOphthalmol 238631-641(2000年)，Thumann及其他作者，Arch.Ophthalmol.1181350-1355(2000年)。
然而，对IPE和RPE两种细胞移植方法的挑战包括在修复疾病变性的布鲁赫膜上存在的困难，对新移植进的细胞的固定和定位的困难缺乏对胞外基质对分子发信号的控制能力，这些分子色素上皮细胞的结构、功能和存活来说是关键的。因为这个或别的一些原因，对于IPE和RPE移植的技术使用抗生素或者免疫抑制剂尚未获得成功。至今还没有用这些方法而产生的重大的可见的进步被展现出来，组织的重新整合仍然存在问题。因此，虽然细胞移植的方法貌似有希望成功，AMD和别的视网膜疾病尚无有效的治疗手术。
因此，我们需要创新的方法和设备，来制作和移植修饰组织，达到治疗视网膜疾病的目的。
发明内容
本发明主要是提供应用于移植中组织修饰和细胞生长所需的操作方法，设备及相关产品，尤其适用于视网膜组织细胞的移植，治疗老年黄斑变性和视网膜色素变性等一些视网膜疾病。本文提供的组织修饰新方法可称为组织显微构建，本发明包括眼球膜组织显微构建及其它膜组织的构建，眼部又可应用于晶状体囊膜，内界膜和Bruch氏膜等，本发明更可应用于移植的多个方面，如组织膜显微构建方法，组织膜显微构建利用方法，组织膜显微构建细胞生长方法，动物眼球细胞或组织显微构建移植方法。同样可应用于人类。
膜组织显微构建是本发明主要特点，它将利用磷酸盐缓冲液处理过的一些生物可吸收材料作为载体，贴附或包裹组织膜，达到修饰组织的目的。合适的生物可吸收材料有胶原(collagen)，葡糖胺基多糖类(glycosaminoglycans)，脱乙酰壳多糖(chitosan)；聚羟基链烷酸酯类(polyhydroxyalkanoates)，聚羟基酸(poly-hydroxyacids)，聚乙二醇酸(polyglycolic acid)聚乳酸(polylactic acid)，聚乙二醇酸和聚乳酸混合物(polylactide-polyglycolide)，合金或共聚合物，聚二氧六环酮(polydioxanones)，聚己内酯(poly caprolactone)，聚正酯类(polyortho esters)，聚酐类(polyanhydrides)；聚磷腈类(polyphosphazenes)，聚氨基酸类(poly amino acids)，其它化合物、聚合物、共聚合物、合金、混合物或上述化合物的组合。合适的组织膜包括晶状体囊膜，内界膜，Bruch氏膜，角膜，羊膜，绒毛膜，粘膜、神经组织及其它组织。
通过经磷酸盐缓冲液或其它生理溶液浸泡的底物与组织膜接触膜或包裹，修饰了组织膜，使诸如虹膜色素上皮细胞或视网膜色素上皮细胞等一些细胞在上面生长。另外，组织膜构建方法可以组织膜为模版，用部分覆盖的方法，使细胞生长于组织膜的暴露表面。
膜组织修饰方法可包括机械方法，如机械切除，机械接触。另外还有光切除方法。本发明的组织膜修饰方法可应用于各种组织，包括眼球组织膜。例如，人类晶状体囊膜组织和内界膜修饰。
膜组织修饰方法包括整体修饰法和表面修饰法。两种方法可以单独使用，也可同时应用于同一膜组织上，通过对膜组织的整体和表面特性的修饰，提高了移植的组织适应性。这种组织修饰可以改善细胞的贴附能力和生长能力，也能提高组织渗透性，这种营养物质，电解质和其它一些生理必需物质能更好地通过修饰组织。
不管是整体修饰或表面修饰，都需将膜组织进行游离，如将晶状体囊膜或内界膜从眼球内取出，然后将膜组织平铺在玻璃或塑料底物上进行磷酸盐缓冲液处理，为了外科移植的便利也可以将膜组织铺于临时性可溶性聚合物上修饰的组织给细胞提供一个合适的底物，使细胞进行接触并生长。已有细胞接触和生长的修饰组织以及多聚体将移植于动物体内的需要位置上。移植后聚合物将溶解并被动物体内被移植组织吸收，而移植组织或细胞则在原位上生长。
合适的可溶性聚合物包括聚乳酸；聚乙二醇酸；聚正酯类；聚酐类；聚瞵嗪类；聚乳酸聚乙二醇酸共聚合物(如1∶1或9∶1及其它比例的乳酸和乙二醇酸共聚合物)，聚乳酸聚合物(PLLA)，聚乙二醇酸聚乳酸共聚合物(PEG/PLA)，以及一些其它混合物和混合聚合物。
整体修饰方法是指修饰膜组织的实质部分，而不是局限于组织的表面部分。表面修饰方法是指修饰膜组织的表面和近表面，而组织的其它部分未作明显的修饰。
整体修饰方法可对晶状体囊膜组织和内界膜组织等眼球组织进行修饰，它可以修饰组织厚度，渗透性以及其它性状。整体修饰方法包括机械切除，如磨擦，刮除，切割，加压或用印记接触，从而使组织形成一个显微模板。整体修饰方法的一种具体操作法为，将膜组织取出并铺平，用激光束或离子束修饰膜组织表面，减少组织厚度。如晶状体囊膜的正常厚度可达8-14μm，可用激光切削至2-5μm，这样其厚度与Bruch氏膜厚度相接近。
整体修饰的另一具体方法包括使用激光切割，如激发准分子，钛兰宝石激光，或YAG激光或离子束处理。以在膜组织中产生显微孔或凹窝。显微孔的直径可以是几微米或者更小。经过这些处理可以制作出显微孔或凹窝的显微模型。
膜组织可以用已失去活性的胶原酶的浸泡处理，再通过激光照射来激活胶原酶，比如，很小区域的组织(其直径可以小于1微米)可以通过一种双光子同焦激光系统照射后被激活。
酶沉积于膜组织上，对膜组织的内部和表面产生生物浸蚀，从而产生了所要求的组织局部解剖学特性和表面粘连特性。这个方法具体为沉积的步骤包括通过一个接触表面与膜组织接触，如产生显微接触印记，所携带的酶可以产生膜组织表面和内部生物浸蚀作用。
处理方法也包括膜组织的表面修饰，如包括膜组织上的活质分子的沉积，经过激光或离子束处理的孔或凹等表面特征的产生。另外这种模型的直径可以是几微米或更小，再者，包括肽类和短链聚合物等生物分子，选择性地使定位于膜组织上的接触细胞失活。
表面修饰方法中的显微接触印刷技术用来制作膜组织上的活质分子的化学显微模型时膜表面也可以通过机械切割方法包括磨擦，刮除，切割和溶液冲刷的方法来加以修饰。
表面修饰方法的另一个具体方面，为组织膜表面覆盖部分，而非全部组织表层，然后经过紫外线照射使暴露组织的细胞外基质(ECM)产生变性。为了激活特定部分膜组织表面，一种灭活物质比如聚乙烯醇(PVA)或胶浆可应用于组织表面，通过一个辐射罩用激发二聚体激光在膜组织表面作显微模型切割。
遮盖步骤可以通过在膜组织表面放置一个滤线栅或者通过使用显微接触印刷技术提供给膜组织表面一种保护分子的模式，以阻止被保护细胞或滤线栅覆盖区域细胞外基质(ECM)产生变性。
细胞可以在修饰膜组织上生长，比如细胞可以在有模板的修饰膜组织的表面生长。具体地说，修饰膜可以是晶状体囊膜组织或内界膜组织，细胞可以是IPE细胞。本发明的另一方面，修饰膜或细胞可以从同一个动物中获取，在这一点上，修饰膜或细胞移植给这个动物将是自体移植，这将避开动物体内免疫系统的排异。
本发明也提供使用显微构建膜组织的方法，包括将显微构建膜组织移植入动物体内的外科方法。其中包括在动物眼内移植显微构建膜组织的方法，比如将显微构建的晶状体囊膜组织或内界膜组织移植于动物视网膜附近或视网膜内。移植组织包括生长于显微构建晶状体囊膜组织或显微构建内界膜组织上的IPE细胞，这将是自体的组织或细胞移植。
本发明还提供构建技术中和使用微构建组织中的有用产品。这些产品包括制作眼显微构建膜组织(如显微构建晶状体囊膜和内界膜)的工具及产品，同时提供在动物眼内移植这些组织和细胞所使用的工具和产品。
本发明旨在提供治疗AMD、RP及其它视网膜疾病的方法和相关产品，比如，一种治疗AMD的方法是移植RPE细胞、IPE细胞、干细胞或另外细胞的悬浮液以挽救病变的视网膜，本发明提供新的组织工程技术，应用于精密的人体自体移植工程(如人类晶状体囊膜)作为一种细胞移植的底物来移植RPE细胞、IPE细胞、干细胞或另外细胞。移植的色素上皮细胞生长于修饰膜和底物上能生长得更多数量，同时表示出正常视网膜细胞固有的，不同的，重要的特征。另外，与先前的方法不同，这种修饰膜组织(包括眼部显微构建膜，如晶状体囊膜、内界膜和另外的底物如供上皮细胞生长的底物)可有效地代替Bruch氏膜的许多功能，而这些功能的损害将导致一些视网膜变性性疾病，所以目前这种色素上皮细胞移植的方法和设备提供了可以高密度生长的移植细胞，这些细胞将产生一些必需的生理功能，来代替变性视网膜的一些功能。
本发明提供一种为移植用的修饰组织和细胞的方法及其装置。本发明的为修饰组织的方法可以被应用于异种组织。以下的定义将有助于本发明的叙述。
述语“自身”在此被用来指取自于同一动物中的别的细胞或组织；相对组织而言，取自同一动物组织的细胞叫自身细胞；对细胞而言，同样叫自身组织。
术语“生物分子”在此被用来表示一个有生物活性分子，当它与细胞或组织接触时，能影响这些细胞或组织。
术语“整体修饰”被用来表示对组织的实质性部分进行修改，而不局限于组织的表面部分。
术语“表面修饰”被用来表示对组织的表面和近表面进行修饰。
术语“膜组织”在此被用来表示一种动物的任何组织，它形成一张薄膜；膜组织通常包封或定界一个组织，或者分离一器官或组织为单独的部分。“眼球膜组织”被用来表示取自动物眼睛的膜组织；晶状体囊组织和内界膜是眼球膜组织(Ocularmembranous tissue)的例子，它们是角膜，布鲁赫膜和别的眼睛的膜组织。
术语“摘除”(ablation)在此被用来表示组织的变化(alteration)，包括尺寸的减小或组织的移去。正如在此所用的，“机械的摘除(ablation)“表示用机械方法变化、减小、或者组织的移去，例如刮挖、刻痕(scoring)，用诸如一种印记(stamp)那样的接触表面去接触，施加张紧力或者别的机械方法。这里所用的“光切”(photoablaton)表示用紫外线、激光或者别的放射线进行辐照，譬如用准分子(excimer)、钛蓝宝石、钇铝石榴石激光器YAG或其它激光器用以改变表面或组织的整体性能。“离子分离”在此被用来指表面或整体修饰，是通过膜组织的离子束来处理来奏效的。
一种“蛋白酶”是一种分子，它用来使至少部分地消化(切成片)一种蛋白或肽分子。蛋白包括蛋白(水解)酶和蛋白酶、胶原酶(collagenase)，胰蛋白酶(trypsin)，胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、分散酶(dispase)，游离酶(liberase)，嗜热菌蛋白酶(thermolysin)，胃蛋白酶(pepsin)和木瓜蛋白酶。
术语“移植”在此被用来表示细胞或组织进入动物体内的插入、沉积和定位。生长在被修饰过的晶状体囊组织上的细胞的沉积进入视网膜下腔就是移植的一个例子。
术语“微接触印记”(microcontact printin)在此被用来表示所要分子沉着在模型的表面，模型的尺寸在几十微米或者更小。
术语“显微构建”在此被用来表示通过表面修饰、整体修饰或者两者一起的修饰方法产生(制出)被修饰的组织的方法。
术语“被显微构建的组织”在此被用来表示一种通过显微构建方法已经被修饰了的或者被改变了的组织。
一种“接触表面”是一个用于与一个第二表面接触的表面，也是用于使起初出现在所述接触表面上的分子沉积到第二表面上去的一个表面。一个“印记”，“显微构建的印记”，“微接触加印的印记”，“微接触印记”或“显微构建加印的印记”是一接触表面，并且术语“印记”、“显微构建印记”、“微接触加印的印记”、“微接触印记”和显微构建加印的印记”在此被用来表示一个装置，它适用于将所要的分子在一个几十微米或者更小级别的模型中沉积。
术语“微模型”(或称微型模格)在此被用来表示一个模型(pattern)、诸如一个有序的阵列(an ordered array)、一个设计或者一个尺寸在几十微米或者更小级别的形体(contour)。
By“可溶性的聚合物”是表示一种可生物降解的聚合物，一旦进入动物体就会至少是部分游离和散布进入动物的液体和组织。
一种“激光”可以是一种准分子激光器、一种钛蓝宝石激光器、一种钇铝石榴石激光器YAG、或者别种激光器。一种激光器能够发射由光放大器在激光腔或激光晶体里产生的相干光的强光束来。
在此使用的“准分子激光器”表示一个激光源，它提供波长低于大约400纳米的激光。准分子激光器可以是氙、氪(krypton)、或者氟(fluorine)激光器或者最好是一种氟化氩激光器。一个氟化氩激光器提供紫外激光、常规波长约193纳米，适合于对上皮组织、结缔组织(connective)和别的组织的摘除(ablation)。如用于组织修饰，脉冲为1-50HZ，每一个脉冲持续1-200纳秒，最好为10-20纳秒，氟化氩激光束为几毫米至几十毫米。
一种钛蓝宝石(Tis)激光器是一种调谐激光器，它可以发射远红外激光，波长约为700到1100纳米。
一种钇-铝石榴石激光器(YAG)，诸如一种钕YAG，一种horonium YAG，或者一种铒YAG激光器，是一种发射微米级波长的固态激光器。水分了吸收能在微米波长段；水优先吸收波长接近3μm能量，掺铒YAG激光器发射波长为2.94μm，使它们特别适合于快速光剥离中使用，在细胞和组织中呈现水的局部蒸发，引起组织的快速膨胀和剥离。
一种离子光束是一种离子气体分子光束，是典型地由无线电频率能量被激发直接指向靶的。用在本发明中实际应用的离子束源，可以是任何种类的；在美国专利US5,216,330中叙述过一种离子束。离子束可以被用来在材料上加工成形孔。美国专利6,093,445中叙述了一种用于做出方形和圆形孔(尺寸在10nm至大约2μm)的离子束方法。
一种组织植入物10，它具有显微构建的晶状体囊组织12、带有附加的细胞14和可溶性基底16，在图1A中显示了其横截面。细胞14被附加在显微构建的晶状体囊组织12上，并在其上表层上生长，显微构建的晶状体囊组织12的下表层20处在与可溶性基质层16相接触的状态。细胞14是虹膜色素上皮细胞(iris pigment epithelial cell)，它有顶端24和底端22膜，底端膜22处于与显微构建晶状体囊12的上表层18相接触的状态。细胞14是虹膜色素上皮细胞，它具有顶端24和底端22膜，底端膜22与晶状体囊12的上表层18相接触。特有的细胞分化进入基端(底端)膜22和顶端膜24的表达显示了生长在显微构建晶状体囊上的上皮细胞的本征功能(proper functioning)，这和在体内的色素上皮细胞中被发现一样。
图1B描述一个哺乳动物的眼球的横截面，组织10植入体已经被手术置入。图1C反映一个在眼球26包括神经视网膜28和组织植入体10的圈33内的详细情况。在图1B和1C中所显示的是神经视网膜28、虹膜色素上皮(IPE)30，视网膜色素上层(RPE)32，它生长在布鲁赫膜34上，而布鲁赫膜34将脉络膜(choroid)36与RPE的底膜38相分离。RPE的顶端40具有许多程序，它在神经视网膜28的感光分子层42中将感光分子的光敏部分包围。在RPE40的顶端膜和感光分子42之间的空间是视网膜下腔44。脉络膜36用于维持一种环境，它能支持感光分子层42的(特定的)和神经视网膜28(一般的)较高的代谢(metabolic)要求，做法是，允许营养和电解质到视网膜下腔44的通道，并且将废物从视网膜下腔44排出的通道畅通。
在健康的眼睛里，视网膜下腔44仅仅是一虚的空间，在感光分子42和RPE40的顶端部分之间仅存很小的分离。然而，在许多眼睛疾病，诸如视网膜脱离(detachment)那样的情况下，感光分子42会和顶端的RPE膜40分离。另外，如有必要神经视网膜28和色素上皮30及32，在做眼科手术时会人工地分离。正如图1B和1C所示，一种组织植入10会被置入到视网膜下腔44中去。显微构建带有贴壁IPE细胞14的晶状体囊12被显示出已被植入眼球26，在那儿，IPE细胞30能够接触到感光分子42，并且提供代谢支持。可溶性的基底(substrate)16被显示在显微构建晶状体囊12的下表面20和脉络膜36之间，就象组织植入物10的置入开始之后那样。然而，可溶性的基底16将溶解并被从基底空间44移走，仅让已被植入的显微构建晶状体囊12和附着的IPE细胞留在视网膜下腔44那儿。
图2是一幅聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane)PDMS显微构建印记46的扫描电子显微照片(SEM)，它体现本发明的特点。网格线48大约为5μm宽、相隔大约50μm。PDMS印记的结构高度为7μm(从底至面)。网格线48可以被涂以例如象聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine)的化合物，通过用印记46接触表面层，放置到一个表面层上。
图3为一张用显示在图2中的显微构建印记46接触之后的显微构建晶状体囊组织的SEM照片。它已被用2％的聚乙烯酒精(PVA)和0.1mg/mL的荧光素的混和物涂覆。明亮的部位显示荧光素溶液的微印记(microprinting)。微模线(micropattern lines)50遵循与印模46相同的模型(pattern)和空间，印模46是通过与晶状体囊表面接触而产生的。
图4显示了一幅PDMS印记52的扫描电子显微照片SEM，它带有一个由圆井56的阵列给出的拓扑结构的印记表面54。这样，印记52的印记表面54具有圆形的凹陷(depressions)56，在凹陷56处得不到涂层，而印记表面54的其余部分接受分子的涂覆，这些分子然后被转移到任何与其接触的表面。用分子，譬如PVA分子、粘浆分子或者别的抑制性的分子涂覆印记52、然后让印记52与一个表面相接触(诸如晶状体囊表面)、让这些分子留在所述表面除它们自己圆表面以外任何的地方。这样的一个抑制性分子的模格(micropattern)允许细胞在该表面生长并仅仅附在这些圆面积上。因为未经修饰的晶状体囊表面允许细胞贴附其上生长，抑制性的模型被要求供作为模格化的生长。圆56的直径大约50μm。
图5是一幅人眼晶状体囊58的扫描电子显微照片SEM，该人眼晶状体囊58接受一个由如图3所描述的PDMS印记52得到的PVA抑制性分子的微型模格60。标尺长度为25μm。它证明，RPE细胞62在由微型模格60所确定的模型(Pattern)中生长，该微型模格60通过印记52被沉积在晶状体囊58上。细胞在这个模型中长达24天处在存活状态。通过控制网格线的宽度，细胞可以在或大或小的程度相分离。稀的网格线(grid lines)允许细胞相互接触，允许从接触处运送上皮(细胞)的形成，使细胞生长。
在显微构建的组织基层上细胞的附着可以通过显微构建的组织的布置(placement)而得以加速或增强，所述的布置是在一个平底的离心管内随待在显微构建的组织上成长的细胞一起进行布置。离心是以低速，如在每分钟5000转到大约15000转的速度下进行，将细胞快速地沉积到显微构建的组织上去，并且导引被沉积细胞在显微构建的组织上生长。
显微构建的组织被放置在一个载体基质上或者涂在一个载体基质上，在其处理过程中以及在其植入动物体的过程中会有帮助。显微构建组织会被涂在仅仅一个侧面上，或者，在本发明的一些实施例上，显微构建的组织会被涂在两个侧面上。显微构建的晶状体囊显微构建的内界膜、显微构建的布鲁赫膜，或者别的显微构建的膜组织以这样的方法来处理和植入会有帮助，例如，一个载体基质使显微构建的组织变得更具刚性以及更加容易处理。另外，一载体基质是用于防止组织的折叠和弯曲，使得组织片以平整的、被展开的样态被植入。这样的一个离心展开提供了最大的供被植入细胞生长的表面面积，并且为被植入的细胞提供最大的接触液体和周围组织的机会。可生物降解的载体基质体现了本发明的特点，并且是柔性的，方便适应视网膜的形状。最好，所述的载体基质是生物可降解的，这样，在置入眼球后，会被宿主体在一个所希望的时间内所吸收。该所希望的时间可以是大约一个星期到几个月，最好是几个星期到大约两个月，更好的是，体现本发明的特征的一个载体在植入视网膜后在大约两个星期到大约六个星期就生物降解。
帮助组织处理和组织植入到眼球的可生物降解的基质材料包括例如胶原(collagen)；葡糖胺基聚糖类(glycosaminoglycan)；脱乙酰壳多糖(chitosan)；聚羟基链烷酸酯类(hydroxy alkanoates)；聚α-羟酸(poly-α-hydroxy acids)，包括但不限于聚乙二醇酸(PGA)、聚乳酸(polylactic acid)(PLA)，和PGA-PLA混合物，合金和共聚物(PLGA)；聚二氧六环酮(dioxanones)；聚(ε-已内酯)；聚正酯；聚酐类(poly-anhydrides)；聚磷腈类(phosphazenes)；聚氨基酸(polyamino acids)；和别的化合物、聚合物、共聚物、合金、混合物和这些材料的组合。
图6显示一晶状体囊(被染成蓝色)在“聚乳酸/聚乙二醇”的载体基质上。标尺为1mm长。载体基质层及包囊物可以被染色(也就是用trypan blue或rhadamine)，在移植手术中，改善待移植的组织的血管化，这些包囊物和载体基质可用于晶状囊膜、内界膜、布鲁赫膜及其它膜组织，包括角膜、羊膜、浆膜、粘膜、神经组织。
图7显示一在聚交酯/聚乙醇酸交酯载体基质上含有一人体晶状体囊的兔子视网膜的片段。被显示的该视网膜片段(section)在晶状体囊组织植入一只兔子眼球里的神经和色素视网膜之间的视网膜下腔中之后一个星期。该晶状体囊具有一平面的形状，而折叠或弯曲状会影响营养和废物的代谢。
有待修饰的组织可以借助于公知技术来获得，这些公知技术可以是在手术或在尸体解剖用的切除，活组织检查。这些都是普通技术人员所理解的。在为获得它们的过程中，需要小心避免膜组织的污染或损坏，在其后紧接着进行标准的消毒操作步骤。这将会被大家所理解，即，方法和装置适合于修饰任何膜组织，包括但不限于眼睛膜组织。
在以下的讨论中，为修饰组织用的方法和装置将使用原有的晶状体囊组织作为示范的膜组织。方法和装置这样就适合于修饰内界膜组织和其他的组织，并且也可以被用于修饰内界膜和其他组织。本发明所提供的组织修饰对于改变目标t组织的性质以提供更加有利的基底给细胞附着和有利生长，也对改变晶状体囊组织的物理和生物性质以使跨组织的液体和溶液的交换更迅速有效果。
诸如晶状体包膜组织和内界膜这样的膜组织可获自于捐赠者的眼睛或者取自于病员(自体的组织)，通过公知的技术，譬如在作白内障切除手术后接着摘取晶状体的摘出。例如，晶状体囊组织可获自于一个作完白内障切除后的眼睛(在做巩膜切开手术或角膜切开术之后也可以)。用这种办法，在作切开手术后粘弹体接着被置入先前的空腔。该粘弹物通常可买Healon(Pharwacia、kalamazoo，MI)或者用viscoat(Alcon、Fort Worth，TX)。然后，用一种载束针进行晶状体囊切手术。该针通常是扎在先前的囊中央心，形成一个囊瓣(capsule flap)。然后用晶状体囊刀针抬高这个囊瓣(flap)。用钳子(Utrata钳、镊)去夹住囊的瓣并且将其拉进一个圆形fashion。在一个被控制的fashion中拉住囊转360°将会导致一个圆的连续的囊破裂，使白内障暴露。晶状体和晶状体囊然后就会被取下。
一旦晶状体(lens)和晶状体囊(lens capsule)被取下，膜组织(也就是晶状体囊、内界膜或其他眼睛组织)会被维持在体外状态或者准备好植入体内。膜组织然后被置于玻璃、塑料或聚合物基底上。玻璃基底(substrate)可以是譬如盖玻片。该塑料基底可以是例如一种组织培养盘。聚合物基底可以是一种可生物降解的聚合物。可生物降解的薄膜可以包括聚乳酸，聚乙二醇酸，聚乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)，包括PLGA(50∶50乳酸比乙二醇共聚物)，聚乳酸聚合物(PLLA)，或者聚乙烯乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)，聚正酯类，聚酐，聚磷腈(polyphosphazene)和它们的混和物(二元)及共聚物。使用生物可降解的聚合物薄膜可以在美国专利US5,512,600中找到。
例如，在美国专利US5,512,600中讨论的方法和在《biomedical MaterialsResearch》第34卷87-93(1997年)由Giordano及其他著作者撰写的论文中所讨论的方法可以被用来维护健康的晶状体囊、内界膜或别的体外和体内的膜组织。生物可降解的(也就是说在置入动物体内会溶化的)聚合物薄膜包括聚乳酸聚合物(PLLA)，聚乙二醇酸聚合物，聚正酯类，聚酐、聚磷腈、聚乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)，包括PLGA(50∶50乳酸比乙二醇酸共取物)，并且聚乙烯乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)薄膜可以被置于塑料培养皿的底面。晶状体囊或别的膜组织随后被放置在该表面上，并且用吸移管使其展平。膜组织和聚合物膜相互被移植在一起。该薄膜在活体内溶解，让膜组织留在后头。该薄膜对膜组织提供较大的操作自由度；例如，聚合物薄膜阻止晶状体囊发生卷曲，而且正是现有技术中存在的一个方法上的问题。另外，进一步处理膜组织可以使用以下的步骤。
晶状体组织(或者其他的膜组织)可以被置于一个适合细胞生长的环境里，例如一种组织培养的培养箱(incubator)或环境腔。在本发明的一个实施例里，晶状体囊组织被埋入磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中并且被维持在37℃的温度下在一个95％氧气-5％二氧化碳的气体中。在培养箱培养之后，用经过灭菌的吸移管(pipette)将磷酸盐缓冲盐水吸掉，并且让晶状体囊平放在无菌的培养皿(petri dish)的底面上。然后晶状体囊被浸泡在胰蛋酶(trypsin-EDTA)中1小时除去任何晶状体上皮细胞，并且接着，浸泡在青霉素/链毒素中30分钟使之消毒。然后晶状体囊在PBS盐水中漂清三次，接着，再用蒸留水漂清。每次漂洗都要仔细地用无菌的移吸管来进行。最后，晶状体和培养皿在紫外线光线下至少消毒三个小时。
在另外一个实施例中，使用一个界面腔(interface chamber)，在那里晶状体囊组织(或别的膜组织)被放在湿滤纸上，湿滤纸盖住一个充满磷酸盐缓冲盐水的盘子。并且被维持在37℃的温度下处在95％氧气-5％二氧化碳的气体中。众所周知，在公知技术中许多种盐水溶液，如碳酸氢盐(bicarbonate)—缓冲盐水(saline)或者别的盐水溶液，可以被用来代替PBS。可供选择的培养液(譬如象RPMI、DMEM或Hamm′s F12(生命技术、MD))可以被添加进去或者替换本方法中所用的盐水，并且，生长因子、抗体、血清(serum)和别的材料也可以被添加到盐水中或者添加到用于维持晶状体囊组织的培养液中。
修饰组织的方法包括整体修饰的方法和表面修饰方法。整体修饰方法又包括一些方法，即细胞的实体部分，本方法不局限于只修饰组织的表面部分。表面修饰的方法又包括组织在靠近组织的表面以及就在组织的表面被修饰，但是在别的组织的部位不作较大的修饰。
本发明的方法，它被应用于晶状体囊组织，无论是整体修饰还是表面修饰的方法，包括从一个眼睛里移出晶状体囊，将其在一个无菌的玻璃或塑料基底，诸如培养皿显微镜载片或玻璃盖片(coverslip)上展平，晶状体囊被埋入磷酸盐缓冲盐水或其他的合适的液中，接着还要对晶状体囊作进一步的处理。大家会明白，类似的处理可以应用于对内界膜组织，布鲁赫膜、羊膜或别的组织。
诸如培养皿那样的基板和诸如显微镜载片这样的玻璃基板可以被用标准的操作步骤来作无菌处理，这样的方法有用紫外线光照射，浸没在酸中紧接着在蒸镏水中重复漂洗，或者用别的公知的操作来处理。另外，塑料和玻璃基板可以在有表面涂层或没有表面涂层的情况下使用。表面涂层包括胶原、胶原凝胶、纤连蛋白(fibronectin)，层粘连蛋白(laminin)，盐水涂层，诸如聚甲基硅烷(polymethyl silane)，如聚-L-赖氨酸的一种聚合物涂层或者其他公知的涂层。
本发明的实施例中，基底(substrate)被制作用来作为膜组织，例如“组织—培养”塑料或以被放在70％的乙醇溶液中漂洗以除去灰尘和油，并且用空气干燥。接下去的干燥步骤，该组织培养塑料可以被用一种溶液覆盖，这种溶液包含有一种所希望的胞外基质分子[也就是4mg/ml胶原，在PBS中的I类大鼠尾巴，浸在PBS中的25mg/ml取自人血浆的纤连蛋白(fibronectin)][胶原和纤连蛋白可以从Sigma，St.Louis，Mo买到]。在一个小时后，塑料可以被放在无菌蒸镏水中漂洗两次，并且被允许在紫外线下通宵干燥一夜。如果晶状体囊基质没有立刻被加印过，它们被在4℃的温度下储藏。
为修饰诸如晶状体囊组织这样的膜组织整体修饰的方法包括为修饰厚度、通透度和晶状体囊组织的其他性质。在一个整体修饰方法的实施例中，这样的进一步的处理包括使用一种准分子激光器去除晶状体囊的表面，以便使晶状体囊的总体厚度减小。例如，晶状体囊可以被用激光或离子束或者采用机械方法摘除(be ablated)，以致使总体的厚度与布鲁赫膜的厚度极为接近。
一种激光器，诸如准分子激光器(也就是一种氟化氩激光器(Lambda Physik，201E型)可以被用来提供激光脉冲，用于剥离(ablate)晶状体囊的表面。例如，在大约10至20纳秒的持续脉冲时间内，以大约1至50赫兹的频率发生激光脉冲，其脉冲能量密度在大约300至500毫焦/平方厘米，这样的能量密度可以以所希望的方式剥离(ablate)晶状体囊的表面。每一个脉冲能去除组织的深度在大约5至50微米之间。因此，重复的脉冲能够将晶状体囊组织的厚度减小到所希望的总体厚度。可以采用那些已经应用于角膜手术的方法，并且，这些方法适合于在晶状体囊组织的光剥离中采用。这样的角膜光剥离的方法公开在美国专利US4、665、913和US5、634、920以及US5、735、843中。
在整体修饰方法的另一个实施例中，将组织放置到玻璃基板上之后，进一步的处理包括使用激光器，如一种YAG激光器用于在晶状体囊中产生微孔(micropores)。这样的整体修饰通过提供微孔，改变了晶状体囊组织的特性，以使跨组织的液体和溶液的快速交换得以实现。在本发明的实施例中，微孔的直径尺寸在纳米级或者更小。这样，以整体修饰方法生成的微孔尺寸在大约0.01微米至大约10微米，最好是在0.1微米至大约1微米。一种铒YAG激光器可以被用来提供持续时间在10至大约50纳秒之间的脉冲，其能量级在大约1至50毫焦之间，最好是在大约1至大约20毫焦之间，这样能按本发明的方法在晶状体囊组织中做出孔来。
在整体修饰方法的另外一个实施例中，在将膜组织置入一玻璃基板上之后，进一步的处理包括使用一种离子束来在晶状体囊中加工出微孔，从而提供一为细胞附着更有利的基底，并且，使跨组织间的流体和溶液的迅速交换得以实现。请看，例如《科学》杂志第178卷93-98(2000年)Goplani及他人合著的论文，《材料研究学会论文集会刊》第540卷题目为”在被辐照材料中微结构处理“，第255-260页(1999年)、和在《核材料》杂志中Ohmichi与他人合著的论文(第248卷第354-359页1997年)。在本发明的实施例中，微孔的直径尺寸在几十个纳米至几Tm之间。
膜组织可以被冷冻干燥，目的在于暴露到离子束中。可供选择的方案有，膜组织可以被整体干燥，然后在微孔被加工出之后被重新水合(rehydrated)。一种离子束，如一个120MeV的Si28离子束可以被用于辐射组织。在将组织暴露在离子束中之后，接着膜组织可以被重新水合。使用胶原酶(collagenase)和其他蛋白酶(protease)或蛋白溶解酶(proteolytic enzyme)的生物蚀刻在下文中讨论，如果大孔被要求，这种蚀刻工艺可以被用于扩大微孔。
在整体修饰方法的实施例中，膜组织的处理包括蛋白酶沉积到膜组织上，使能对膜组织的表面和内部进行蚀刻(etch)、以为组织提供所需要的拓扑结构(topology)和表面粘附(粘连)性能。在这种方法的一些实施例中，沉积步骤包括用载有酶的微接触印记(printing shamp)去接触晶状体囊或别的膜组织。使得能够对组织的表面和内部进行生物学上的蚀刻。在将酶印到组织上之后，白蛋白(albumin)或一种酶抑制剂(enzymeinhibitor)可以被用来阻止在给定的时间之后的反应。例如在20℃的温度下，在一个恒温的水浴中，择优地用胶原进行高达26小时的不同时间长度的培养(incubation)，并且通过添加EDTA到最终为50mM的浓度阻止胶原酶反应。使用胰蛋白酶(trypsin)的培养可以在大约0至5℃的温度下进行大约6至大约18小时(也就是在一个没有钙或镁的胰蛋白浓度为0.25％的平衡盐溶液中的培养)。在用胰蛋白酶进行的培养做完之后，胰蛋白酶溶液可以被移走，并且在用含有二价阳离子(如钙和镁)，总量约为1至大约5mM的洗液中漂洗之前膜组织被在37℃的温度下培养20至30分钟(也可选用含有胰蛋白酶抑制剂，如大豆胰蛋白酶抑制剂)。也可选择在移走溶液和用含有大约1至5mM的二介阳离子的平衡盐溶液对膜组织漂洗之前，让膜组织用分散酶(大约0.5至大约3U/ml)或者别的蛋白酶(proteolytic enzyme)在平衡盐溶液中(在37℃温度下基本上没有二价阳离子的情况下)培养高达几小时。
在整体修饰方法的实施例中，例如，诸如胶原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotryptsin)，分散酶(dispase)、游离酶(liberase)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)，胃蛋白酶(pepsin)，木瓜蛋白酶(papain)，和别的蛋白水解酶(proteases)，可以用来作为在蒸馏水、磷酸盐—缓冲盐水或别的缓冲溶液中的溶液，浓度范围在大约0.01mg/ml至大约100mg/ml之间，最好是在1mg/ml或大约20mg/ml之间，被施敷到一个微接触印记(microcontact printing stamp)的表面。该组织表面，如晶状体囊组织，可以在空气中接触或者浸泡在一种盐水溶液中接触。在此，蛋白酶在缺钙的情况下是活性的，诸如像胰蛋白酶(trypsin)，螯合剂例如(EDTA)和(EGTA)在溶液中的浓度范围最好在大约1至大约10mM。在这样的情况下，当根据需要向溶液中加入钙和或镁，酶的作用就会停止。总之，酶作用会被过量的不含酶的溶液稀释或者通过加入一种合适的酶抑制剂而停止。(例如胰蛋白酶可以被一种胰蛋白酶抑制剂所抑制，这种胰蛋白酶抑制剂有像大豆胰蛋白酶那样的抑制剂，T-9003，sigma化学公司st.Louis，Mo)。
在整体修饰方法的另一个实施例中，内界膜或晶状体囊组织的处理包括用失活的酶，诸如用失活的胶原酶去浸润组织，然后再用激光照射使之活化过来。例如，在一个实施例中，一个非常小的区域，组织的直径尺寸小于一微米(micron)通过一种“α—光子共焦激光系统”的照射被激活化。酶以这种方法被激活化对降解(degrade)或者对在一个激活被发生的小区域内去改变组织产生作用，而附近区域未被该共焦激光系统激活仍旧处于不变状态。被激活的酶会被水冲走或被水失活。适合于本发明的酶包括但不限于胶原酶(collagenase)、胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotryptsin)、分散酶(dispase)、游离酶(liberase)、木瓜蛋白酶(papain)、胃蛋白酶(pepsin)、嗜热菌蛋白酶(thermolysin)和其他蛋白酶(proteases)。
在表面修饰方法的一个实施例中，微接触加印(microcontact printing)技术被用于构建生物分子的化学微型模格(micropatterns)到组织上。例如，晶状体囊组织的表面修饰可以包括将生物分子的模型沉积到晶状体囊组织上去。这样的模型(patterns)，会包括几何图形或线性模型的反复重复，或者会包括仅仅几个或者是单独一个模型(pattern)而它不是由较小的模型单元构成。这样，表面修饰的模型可以包括沉着在组织表面上的生物分子的线列或者生物分子的弯曲布置，一长串列的圆形模型(series of circularly-shaped patterns)，诸如生物分子的环或点，或者，一长串的另外的形状，包括单一模型的多种形状。有多种选择方案，这种模型可包括实质上被沉积的生物分子覆盖的延伸的面积，或者实质上缺乏沉积的生物分子的延伸面积(extended areas)。这将会使我们明白，这些方法包括任何包含有线条、形状、或者沉积有分子的区域，也包括位于沉积有生物分子的区域之间的缺乏沉积分子的区域的合适模型。这样的微型结构总的来说是要增进在修饰过的膜表面上细胞的附着和生长。然而，在本发明的实施例中，微型模格(micropatterns)被做在这样的地方，即，被修饰了的膜组织的区域变成不适合，或者很少适合细胞附着和生长。在这样的情况下，细胞附着和生长可以被导引至并且限制在未经这般处理过的膜组织的那些区域。
微接触印记(printing stamps)可以包括整个要被沉积到靶组织上去的模型(pattern)，或者包括所要的模型的一部分。在此，印模(stamp)包括一个所要模型的一部分，往组织表面多次使用微接触印模(microcontact printing stamp)结果就提供了我们所要的在组织表面的生物分子的模型。在此，印模(stamp)，包括整个模型，生物分子可以以我们所要的图模被沉积到微接触印模自身上去。
在一个微接触印模上生物分子的模型(pattern)可以被印模上的生物分子的布局(placement)来确定，或者被印模的表面图案所确定。在此，生物分子的模型是由印模的表面图形所确定的，该几何模型(geometric pattern)可以包括局部高出的纹(ridges)，在此，印模与生物分子的一个源相接触，这种接触使这样的生物分子沉积到高起的表面上，在没有高起的表面部分实质上没有生物分子被沉积在其上。在这样的一个微接触印模中沉积在组织上的生物分子图型是遵照所述的高起表面上的图型。有方案可供选择，所述的图型可以包括凹域，凹沟或裂缝(fissures)，诸如在一个表面上的刻痕(scratch)，在此，印模与生物分子源接触的作用是将这样的生物分子沉积到表面的主要部分，而在表面的凹域上实质上没有生物分子被沉积。在这样的一个带凹域的微接触印模中生物分子会被沉积在一个组织的实质性部位(substantial portion)，而那些实质上缺乏沉积生物分子的区域是顺着凹表面的图型。
在这些方法的一些实施例中，图型的尺寸在几个微米或者更小的级别上。因此，本发明的表面修饰方法的实施例中单个印模的总体构成的尺寸在大约0.1微米至大约20微米之间，最好是在大约0.5微米至大约5微米之间。
适合于沉积到组织表面的生物分子包括蛋白质、肽(缩氨酸)(peptide)、有机分子、寡糖(oligosaccharides)、和短链聚合物，包括但不限于胶原(collagcen)、透明质酸(hyaluronic acid)、硫酸角蛋白(keratin sulfate)，聚甲基丙烯酸甲酯(polymethylmethacrylate)，聚苯乙烯(polystyrene)，聚甲基苯乙烯(polymethyl styrene)、聚赖氨酸(polylysine)，聚乳酸乙二醇酸(PLGA)衍生出来的聚赖氨酸、聚赖氨酸肽(polylysinepeptides)，和诸如十八烷基三氯硅烷(octadecyltrichlorosilane)(OTS)之类的盐水聚合物。表面修饰包含生物分子的沉积，表面修饰目的旨在改变组织的生物特性，比如处于显微构建组织上面的细胞的附着的能力或放便性。例如，疏水性的分子的沉着是为了使在晶状体囊组织上的选择的细胞附着点失活。
微接触印模可以用任何能保留住一适合的图型的材料来制造，比如玻璃、陶瓷、金属、塑料、聚合物，或别的材料。在本发明的较佳实施例中，微接触印模包括有聚二甲基硅氧烷(dimethylsiloxane)(PDMS)，它是商业上能购到的(也就是Sylgard 184from Dow Corning、Midland MI 48640)。微接触印模可以从含有所要图型的主模板(masters)在PDMS中做成，比如这种模板可以是线状网格图型。
可选择的方案有，要加工成型的模型是由沉积到组织上去的模型(图型)来确定的，印模可以包括一个简单的表面，例如一个平表面，它适合载带生物分子。这样的印模可以包括针(pins)，有槽(开缝)的销、杆，它可以有圆形、三角形、方形，其它多边形或不规则形状的周边。
在表面修饰方法的实施例中，晶状体囊组织被掩膜来进行部分覆盖，而不是晶状体囊组织的表面的整体全面覆盖，然后被用紫外线辐照，目的旨在使组织的暴露部分的胞外基质(ECM)变性。使专为细胞粘着用的分子失活，并且抑制或阻止细胞在被暴露的部位而不是被覆盖的区域粘连和生长。
在本发明的方法的这个实施例中基底(substrate)的部分可以被去活性，阻止细胞的附着和生成，然后在特定的部位再激活。通过使蛋白质失活，细胞的生长就被限定在有限的区域。一个失活的基底阻止成长细胞的附着、传播或者两者。例如，0.2％聚乙烯醇(polyvinyl alcohol)溶液和粘质是用来对基底去活性的。
通过施布一种去活性物质于基底，一个表面可以被去活性，而该表面的一部分可以被重新恢复活性，例如，0.2％PVA被施加到晶状体囊的表面，目的旨在使晶状体囊的表面失去活性。失去活性的晶状体囊表面曝光于来自于准分子激光器的激光微模型(miropattern of light)，这一暴光使得在晶状体囊表面刻上一被激光刻出的微模图型(micropattern)。例如，一幅微型模图可以通过晶状体囊表面透过掩膜的照射在晶状体囊表面产生。被剥落的显微模图通过移走或改变失活物质，重新激活基底的一些部位使细胞生长并且传播进入剥落区域，这样，引导细胞按所要的模图生长。
掩膜步骤可以包括将网格(grid)放置到组织上去，在此，格栅(grid)包含有一种材料，其作用是去阻止表面的辐照。所述的网格可以用包括金属、玻璃、塑料、陶瓷、聚合物、蛋白质等材料或别的材料使吸收或反射紫外线辐射。
在掩膜方法的一个实施例中，掩膜的步骤包括使用微接触加印技术将保护分子的模型施加到晶状体囊组织上表面上去，其作用是在有保护分子覆盖的区域阻止ECM变性。这样，掩膜步骤的网格(grid)可包括一在表面上的涂层，其作用是将表面与辐照隔离。这样的一层涂层可以包括一种蛋白质，最好是富酪氨酸和氨基酸残留渣，它吸收紫外线光，还包括一种聚合物，其作用是吸收紫外线，或者一种小分子，其作用是屏蔽紫外光线，例如，“对氨基苯甲酸”(para-amino benzoic acid)(PABA)。
本行业技术人员将理解，表面修饰方法和整体修饰方法每种可以被应用于单一组织。这样，例如相同的晶状体囊组织可以被表面修饰处理，也可被用整体修饰的方法处理，修饰的作用是提供显微构建的晶状体囊组织。
显微构建的组织适合于为生长细胞的基底之用。一种在显微构建的组织上生长细胞的方法包括提供一种用上述之一的方法制造出来的显微构建组织，并且将细胞施加到该显微构建的组织上去。例如，显微构建的组织可以包括一显微构建的带有印在其表面上印记的晶状体囊，例如一种胶原的印记，而细胞可以包括IPE细胞、RPE细胞、干细胞，或者别的细胞。在本发明的较佳实施例中包含有自体组织和细胞，显微构建的组织，而细胞是取自于同种动物。
本发明还提供使用显微构建组织的方法，它包括将显微构建组织移植到一种动物身上的手术方法。在较佳实施例中，将显微构建组织移植到一个动物体的方法，包括用手术方法来将显微构建的组织移植到一个动物的眼球里。在最佳实施例中，显微构建的组织移植进入一种动物的眼睛，包括显微构建的晶状体囊移植到一种动物的视网膜内或者视网膜附近。在一些实施中，被移植的组织进一步包括在显微构建晶状体囊组织上生长的细胞。在另外的一些实施例中，被移植的组织包括RPE细胞、IPE细胞、干细胞或在显微构建晶状体囊组织上生长的别的细胞。可供选择的方案有，可溶性的聚合物基底可以被用于生长细胞，这种细胞是供移植用的。在进一步的实施例中，被移植的组织包括RPE细胞、IPE细胞、干细胞或别的细胞，它们生成在显微构建的膜组织上或生长在可溶解的聚合物基底上，在那儿，细胞和组织被取自于与被接受移植的动物同样的动物。
从一个眼球分离和移出RPE细胞的方法可以在《视网膜研究进展》杂志第10卷(1991年)上的作者为Pfeffer.B.A，的论文“人类细胞培养的改进的方法论以及猴子视网膜色素上皮细胞”第10章，编辑Osborn，N.，和chader，J.；中可以发现。这些方法也可以被应用于IPE细胞。该细胞可以从一个捐赠者的眼睛移出或者从病人的完整的眼睛里移出，包括最终接受显微构建的带细胞的组织的移植。收集细胞的方法在活组织检查(in a biopsy)中获得，作为一种自体移植的手术步骤，这可以在作者Lane，c.，和其他合著人在《Eye》杂志第3卷第27-31页(1989年)发表的论文中找到。为获得RPE和IPE细胞的进一步方法可以在作者Abe及其他合著人在1999年，作者Thumann与其他合著人在1999年；作者Lappas与其他合著人在2000年，以及作者Thurmann与其他合著者在2000年撰写的论文中找到。
IPE细胞、RPE细胞、干细胞或者别的细胞可以被浸泡在盐水中，例如磷酸盐—缓冲盐水，其密度大约104个细胞/毫升至大约107个细胞/毫升。已分离的RPE细胞、IPE细胞、干细胞或其他细胞可被施加到显微构建组织上，例如，加到显微构建的晶状体囊组织通过小心地移吸一种含有IPE细胞和RPE细胞干细胞或其他细胞的溶液到浸没在PBS中的显微构建的组织上，接着是将细胞和组织维持在37℃的温度下，并处于无菌的浓度为95％的氧气与5％的二氧化碳的混合气体中12小时。该PBS可以用一无菌的移吸管来移走，并且晶状体囊被展平放置在无菌的培养皿(petridish)或其它容器的底面上。晶状体囊然后被浸泡(be soaked)在胰蛋白酶-EDTA中为时1小时以除去任何晶状体上皮细胞，并且接下去用青霉素、链霉素进行30分钟的消毒灭菌。此后，晶状体囊可以被在PBS溶液中漂洗三次，接下去再在蒸馏水中漂洗三次。每次漂洗需小心地用无菌的移液吸管来进行。最后，晶状体囊和它的载片在紫外线的照射下进行消毒灭菌至少三小时。
在施布细胞之前，显微构建的组织，例如晶状体囊，内界膜，布鲁赫膜和其他组织可以被修饰并且按上述方法被显微构建。可供选择的方案有，除这样的修饰和显微构建之外，微观流体通道或者微观流体通道(microfluidic channels)的模型可以布置在待修饰的膜表面，一种细胞和分子的悬浮液可以被提供给膜表面。例如，一种微观流网络(Delamarche及合著者的文章中曾经有过描述《科学》杂志第276卷第779-781页，1977年)，在此，被结合起来作为一个整体它可以为了修饰该膜被施布到膜组织表面，在这样的一个步骤中，一个沟槽或者一串列的沟槽可以被在PDMS上形成，或者在别的生物兼容性材料上形成，一旦将PDMS放置到一个膜组织上面的时候，该沟槽就形成一定的水道，膜组织的表面用作一水道壁面。细胞或生物分子可以带进水道与膜组织表面接触，通过带生物分子或细胞的溶液，或者既带细胞又带生物分子的溶液在水道内的流动，细胞或生物分子就与膜组织表面接触。细胞和生物分子这样就沉着在膜组织被暴露的表面上，该膜组织形成一个通道的壁面，细胞和生物分子还可对膜组织被暴露的表面进行修饰。
被分离出来的RPE细胞、IPE细胞、干细胞或其他细胞也可以被施布到一个膜组织上，该膜组织被一模片(stencil)部分地覆盖。适合于本发明的模片具有由孔或通道构成的模型，这些孔或通道是贯穿其表面的。这样的模片(stencil)盖住其下的膜组织，当模片被施加到一膜组织上时，而孔或通道的模型(pattern)的作用是让其下的膜组织的一部分被暴露。一个用于对组织进行显微构建的模片可以有厚度比模片的整体厚度还要厚的隆起凸缘(rim)，为了帮助提供机械强度。一个具有这样的孔或通道模型的模片可以被施加到待修饰的膜组织的表面，其作用是导引在膜组织上的细胞的生长或者调节膜组织对外表面的制剂(agents)的暴露和处理。在这种方法的一些实施例中，所述的模型(pattern)的尺寸大小可以在几个微米或更小，或者在几微米，这样，模型可以在大约0.1微米至大约100微米之间，最好是在1微米至大约75微米之间，更好的方案是在大约5微米至大约50微米。一个模片(盖)可以用任何合适的生物材料来形成，例如，PDMS或PLGA/PEG聚合物。一种合适的模片材料可以是固体或胶状的，并且最好是柔软的。模片(盖)适合贴合于移植到动物眼球用的膜组织，它可以用与那些在论文中所描述的相同的方法来制作，例如Folch及其他合著者J.Bioned.Mater.Res.52期、第346-353页(2000年)。
显微构建的晶状体囊组织移植进入视网膜下腔可以用任何能接触进入视网膜下腔的方法来实现。通过顺眼睛的横向切开巩膜就可以进入视网膜通过一个更前位的切开通过玻璃体的玻璃体液进入视网膜下腔。这种进入并植入视网膜包括视网膜下腔的作业步骤已经被作了叙述；请看论文Abe及其他著者合著的Tohoku J.Exp.Med第189卷第295-305页1999年，Abe及其他合著的Tohoku J.Exp.Med第191卷第7-20页2000年，Lappas及其他合著的Graefes′s Arch clin Exp Ophthalmol，第238卷第631-641页2000年，Thumann及其他人合著的Arch.Ophthalmol.第118卷.第1350-1355页(2000)，美国专利US5,962,027和美国专利US6,045,791。
可供选择的方案有，一种显微接触印模(stamp)，或者一种模板(stencil)可以被施加到一个体内的眼睛膜，例如，进入一个完整无损的活的眼球里的布鲁赫膜里，这可以通过标准的外科手术，包括用一种气体、盐水、矿物油或别的生物可兼用液体浸制形成一个细胞泡(bleb)进入眼睛的视网膜下腔，并且一个模盖或者显微接触印模的这种应用可以被进行湿化，也就是出现正常体液，PBS或其他人造生理溶液矿物油或者别的生物可兼容液体。可供选择的方案有，这样的显微接触印模(microcontact printingstamp)或者模盖的应用会被进行干燥，也就是在缺乏正常人体体液或人造生理溶液、比例通过用一种惰性气体(如氮气或氩气)去填充视网膜下腔。
一个完整的布鲁赫膜可以现场显微构建制备，用刮削(scraping)或者清理布鲁赫膜以除去RPE细胞在施布印模或模板(stencil)之前。然后一个印模或模盖可以被用来提供一个所要的模型(pattern)在膜表面上。例如一种具有一个通道模型的PDMS模盖(stencil)，它可以被施布到布鲁赫膜的表面。细胞可以附着和生长在被通道暴露的膜表面上。相似情况，溶液中的生物分子与膜表面相接触可以对被通道暴露的膜表面进行接触、修饰或粘附于其上。通道的模型其作用是提供一个适合于用来导引生物分子的沉积的模型，并且该模型导引所加入细胞的生长，例如，RPE、IPE细胞、干细胞或其他所加入的细胞，或者使取自眼球其他部分的内源细胞(endogenous)重新生长。另外，可选择的方案有一个显微接触的印模载有层粘连蛋白(laminin)、纤连蛋白(fibronectin)，或其他所要的涂层剂(coating agent)，可以被施布到眼球膜表面。在进一步的可作选择体现本发明的方法中，内眼球膜可以通过巩膜，例如通过巩膜穿刺、巩膜切开形成巩膜窗，或者其他方法被接触到。取接触巩膜的优点这类方法中为了进入要手术的眼球膜可以不需要横过玻璃体液(vitreous humor)。
图1A为可溶性底物上的显微构建膜组织的剖面图。
图1B为一动物眼的剖面图，在其视网膜下移植了可溶性底物上的显微构建膜组织。
图1C为图1之详图，显示眼球内视网膜下、视网膜和显微构建组织。
图2为本发明中用于制作显微构建膜组织的显微接触印记。
图3为本发明中与显微接触印记连接的显微构建晶状体囊膜组织。
图4描述了一种聚二甲基硅氧烷(dimethylsiloxane)(PDMS)印记，该按本发明的方法将微模型施加到膜组织上。
图5描述了在晶状体囊膜上生长的细胞，晶状体囊膜已被用PDMS印记微型晶格化处理加工过。
图6是一在聚乳酸/聚乙二醇载体基质上被显微构建处理过的晶状体囊膜的显微照片。
图7是一被移植后一星期的兔子视网膜块的光学显微照片(photomicrograph)，该视网膜包含有一种在聚乳酸/聚乙二醇载体基质上显微构建加工过的晶状体囊膜(lenscapsule)。
具体实施例方式
例1显微接触加印术(Microcontact printing)被用来在晶状体囊组织上沉着显微尺寸的生物分子模型(pattern)。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)印模被从含有间隔为50微米的网格线(grid lines)的拓扑模型(topological pattern)的主模铸成。聚(二甲基硅氧烷)PDMS印模被用主模制成，所述的主模(master)被用硅片(silicon wafer)显微构建做成。聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)模印被用于在晶状体囊组织上显微构建出许多模型(pattern)。如图1中所示的是PDMS模印的一扫描电子显微照片(SEM)，该模印用来将显微模型(micropattern)沉着到一片人眼晶状体囊组织上。
如图2显示的该PDMS印模具有一个由六角形阵列(5μm宽的线条)所给出的表面拓扑结构。每条线间隔大约50μm。如图所示，被用图1所示的PDMS印模加印过的一个人体晶状体囊。该PDMS印模被用于沉积六角形的PVA模型和荧光素(fluorescein)溶液(2％PVA和0.1mg/ml荧光素)到晶状体囊上。这个例子显示印模的作用是在与印模相对应的模型表面上产生一个模型。
例2一种带有圆形模型的PDMS印模的扫描电子显微照片SEM，这种圆形模型用于显微构建组织，图4显示了这幅SEM照片。如图显示，印模(stamp)具有一个圆井(其直径约为50μm)阵列所给出的表面拓扑结构(surfacetoplogy)。当该释放模被用抑制性分子，诸如PVA或者粘液(mucilage)涂覆，并该印模贴合(applied)到一个晶状体囊上去的时候，该抑制性分子就被转移到晶状体囊上去。图5显示一个已被用一种PDMS印模(它具有一个如图2所示的印图)印图后的晶状体囊的表面，在其上有RPE细胞生长。这个例子表明印模的作用是将印图印到晶状体囊表面上，在该表面上被印的图型是与印模上的图型一致的，并且细胞按照印模上的印图(pattern)长成这样的图型。
这样，本发明的印模的贴印能够让抑制性分子按图型沉积，该图型能导引生长在一个被模印过的基底上生长着的细胞的生长。因为该晶状体囊自动地得以生长，例如PVA这样的抑制性分子被择优按模型图生长。在基底上的印模(它被处理用来抑制生长)的使用会要求使用活化的分子来在基底上构图生长(to pattern growth)。
例3晶状体囊组织的表面掩膜(Masking)、然后用紫外线辐照被暴露的表面，而不照射被掩膜的表面，掩膜的实施是通过将SEM网格放置到晶状体囊组织的表面得以实现的。一个SEM网格(其间隔距离为50微米)被布置到一个被暴露的表面上，该表面是搁放在一个浸没在磷酸盐缓冲盐水中玻璃盖玻片(glass coverslip)上的一个被切开的晶状体囊组织被暴露的表面。该晶状体囊组织的表面和SEM网格没有被浸没在磷酸盐缓冲盐水中，而是高出磷酸盐缓冲盐水的水平面。紫外线光被直接照射到晶状体囊组织的暴露表面，其作用是照射没有立即静止在低于SEM网格材料的晶状体囊组织。在照射之后，SEM网格被移走。晶状体囊表面包含一个线模格，它包括没有被辐照过的组织(在SEM网格材料以下的区域)，它将包含有辐照过的组织的区域包围起来。
例4平的基底和保证基底一旦被植入眼球的视网膜下腔或其他区域中不会弯曲或弯折将有助于视网膜色素上皮细胞和虹膜色素上皮细胞的单层培养物的生长。一种可生物降解的基质涂料被发现可以阻止晶状体囊组织上弯折和卷曲。这样的一种生物可降解基质(它阻止基质卷或折弯)适合于用来作为移植到眼球用的视网膜色素上层细胞和虹膜色素上皮细胞的单层培养物的生长用的基底。
一种生物可降价的聚合物基质，它是由聚[(dl-丙交酯/乙交酯(dl-lactide.glycolide)]制成的，制作的方法是，在不同量的二氯甲烷(dichloromethane)中溶解50毫克的一种90∶10的聚(dl-丙交酯/乙交酯)的混合物，做成100毫克/ml(0.5ml二氯甲烷)，150毫克/ml(0.33ml二氯甲烷)和200毫克/ml(0.25ml二氯甲烷)的溶液。这里所述的聚(dl-丙交酯/乙交酯)是warrington PA 18976 polysciences公司的出品。
在做切除白内障手术过程中获得的人眼晶状体囊在作无菌消毒前在紫外线照射下及4℃的温度下被存放在磷酸盐缓冲盐水中，(紫外线为254nm，存放时间为3小时，然后用0/0 5％的胰蛋白酶-(乙烯二胺基四乙酸)[trypsin-(ethylene diamine tetraaceticacid)]在37℃的温度下处理10分钟来除去非变性上皮细胞。被处理过的晶状体囊被在一放在培养皿中的单层石蜡膜中铺展播散并且在其一面涂以聚-d-乳酰乙醇酸(PLGA)可生物降解的基质，所述的基质为单一浓度，通过从一移液吸管中往晶状体囊表面分滴5μl或20μl的PLGA溶液来铺展，在此所述的Parafilm(是Pechiney塑料包装公司Neenah，WI54956的产品)。PLGA溶液被允许在5毫米直径的圆范围上铺展，在该面积的圆范围内有被展开平放的晶状体囊。溶剂在一化学通风橱中挥发(蒸发)。
五只新西兰白兔体重为2.5至3.5公斤，经历了晶状体囊/PLGA复合物的植入遵照以下标准ketamine 40毫克/公斤和Xylazine(5毫克/公斤)来麻醉(anesthesia)进行手术。滴入0.5％Tropicamide和2.5％Phenylephrine眼药水到左眼的结膜囊内(每五分钟三次)。先作标准三通道玻璃体切割术，用42号针头将约0.5ml平衡盐液注入黄斑区形成一个视网膜泡，再进行视网膜切开，直径为1毫米，用视网膜下钳子将晶状体囊膜/PLGA通过切开口插入，直至视网膜下腔。再通过气液交换使视网膜重新复位。
被做好手术的眼球在晶状体囊/PLGA植入后一个星期被移出，并且固定在1.25％的戊二醛(glutaraldehyde)1％的低聚甲醛(paraformaldehyde)，在二甲胂酸盐(cacodylate)在四氧化锇(osmium tetroxide)中，在一个分级的series of酒精中干燥，再被埋在环氧树脂中，被切割成1μm的切片(sections)并被用甲苯胺蓝(toluidine blue)染色。
移植体植入后一个星期(post-implantation)进行的组织学研究表明，晶状体囊平展贴附在布鲁赫膜上。这可用一个兔子视网膜的片块来说明，该视网膜具有一晶状体囊/PLGA移植体(implant)，是取自在移植后一星期，如图7所示。有一个局部的损坏感光分子层，和一重叠搭接的视网膜分离(detachement)，估计可能是在先前被细胞泡所占的那块面积。PLGA几乎完全溶解在全部表面里。五个移植块展示了涂有PLGA的晶状体囊在手术中是很容易处理的，并且有足够的刚性，这样移植体就会在视网膜下腔中呈平整的状态。没有证据表明有明显的炎症反应。
这个实例表示PLGA大大地改变了在视网膜下腔植入中晶状体囊的手术处理，并且待移植的晶状体不会卷曲。而未处理过的晶状体囊会卷拢成多层或在移植过程中会弯折，用生物可吸收基质涂覆(例如在本实施例中所用的PLGA涂覆)处理过的晶状体囊在完成移植后在视网膜下腔中保持相对平整性。因为PLGA会在几个星期之内降解掉，事后的对于植入体的免疫反应的考虑可以被消除掉。本例显示出被改进了的被涂覆的显微构建晶状体囊的机械特性，本例叙述了涂覆显微构建的组织(例如晶状体囊、内界膜、布鲁赫膜和别的组织)，克服未被处理过的组织的机械强度薄弱的缺点，并且提供一个改进了的为组织和细胞移植用的基底。
例5一个治疗AMD的例子，它是要将RPE细胞或者IPE细胞的悬浮细胞移植以治疗拯救视网膜疾病。本发明提供新颖的组织工程技术来精密地人工改进自体人类组织作为一个细胞移植，诸如IPE细胞、RPE细胞、干细胞及其它合适的组织包括膜组织，例如晶状体囊(也就是人类晶状体囊)，内界膜、布鲁赫膜组织、角膜组织、羊膜组织、浆膜组织、粘膜组织和神经组织。
一种抑制性分子的显微几何结构，它被布置在一个合适的基底的表面上。合适的基底包括人体眼球晶状体囊、胶原凝胶、胶原-纤连蛋白(fibronectin)，和涂有层粘连蛋白(laminin)的塑料，和溶解性聚合物(例如PLGA或PLLA)。人体眼睛晶状体囊可以在做白内障切除手术时获得。视网膜色素上皮细胞RPE的培养物是在这些被显微加工的表面上生长，并且用扫描电子显微技术，原子力显微技术和荧光显微技术被作技术分析。在自体组织的显微构建表面和合成构成的表面和膜之间的种种比较然后就被进行。
这些比较表明单个RPE细胞可以被导引在生物表面上的微环境中生长。虽然，所有被研究的表面是适合于显微加工，包括人眼晶状体囊，这将令大家明白，不同组织的制作工艺方法会被用于改变“细胞对细胞”的距离以及生物因子和细胞粘连分子的微环境。
例6在本例中，分离的RPE细胞被贴附在晶状体囊膜组织上，该组织已被用一模盖(stencil)局部的覆盖、并且它们在晶状体囊上面的生长由模盖模型(stencil pattern)定向导引。纤连蛋白(取自于人体血浆、25μg/ml在PBS中)被涂到一个搁置在一浸没在磷酸盐缓冲液中的盖玻片(coverslip)上的一块被切除的晶状体囊组织上。一个PDMS模盖具有一规则的六角形孔(大约50μm对角线长)的模型，孔与孔相距约10μm，被无菌地搁置在一块被切除的晶状体囊组织上面。纤连蛋白促进模盖与晶状体囊的粘连以及促进加入进的细胞的粘连(adherence)。分散在细胞生长培养基础(medium)(107个细胞/毫升)中的RPE细胞被无菌地加入到在晶状体囊表面上的盐溶液中所述的晶状体囊组织局部地被模盖所覆盖。晶状体囊、模盖、玻片盖、加入进来的细胞和细胞培养液被维持在一个组织培养箱的组织培养皿中，并且被维持在合适的培养条件下，在接近37℃的温度下，在95％氧气与5％二氧化碳的混合气氛中维持。所述的模盖的六角形孔的模型留有暴露于RPE细胞的做基础衬底的(underlying)膜组织一些部位。所述的RPE细胞与暴露的晶状体囊组织相粘附，并且在其被模盖导引(directed)的六角模型中生长。作为结果的显微构建的带有粘附的RPE细胞的晶状体囊组织适合于移植到动物的眼睛。
例7在本例中，一个显微接触的印模被贴合到一个体内的眼睛膜上，提供一显微构建的膜表面，它适合于细胞的生长。这样的显微构建的膜表面适合于细胞的生长，它对于在眼病的治疗或由眼睛膜或眼球细胞的缺陷所引起的一些情况下有帮助。例如，在一个眼球中，它具有一个病变的RPE细胞区域，或者在该区域中的PRE细胞已不能正常地起作用，摘除这样的失去作用的RPE细胞，并且选择性地加入细胞显微构建作为衬底的布鲁赫膜，能有效地治疗眼睛。
视网膜下腔细胞泡(subretinal bleb)被用于进入一员病人眼睛的视网膜区域，该员病人带有疾患的RPE细胞。接着一个三通道玻璃体切割术和穿过神经视网膜的小通道的穿孔之后，所述的细胞泡通过注射无菌盐水进入视网膜下腔而形成，被细胞泡暴露的RPE细胞通过刮削或者其他的清除布鲁赫膜的方法，例如通过在脉络膜神经手术中所用的技术，被从布鲁赫膜的一个部分移出。一种显微接触印模(它有一直径为50μm相隔10μm的许多圆形成的模型)被用取自于人体血浆存放在PBS中的25μg/ml的纤连蛋白来涂覆，被卷成圆筒形形状，并嵌入进一根针里。该根针与一个含有PBS的针筒相连接。该显微接触印模和PBS被慢慢地注射进入在视网膜下腔中的细胞泡(bleb)里，然后利用该根针的作用以及针递送PBS的作用将卷拢的印模展开。该显微接触的印模被布置与暴露的布鲁赫膜相接触。一个被涂覆过的微接触印模的这般摆放有将纤连蛋白的模型沉积到被暴露的布鲁赫膜上去的作用。现场制作完整的用于显微构建的布鲁赫膜，其作用是提供一为适合导引被加进去的细胞的生长或者适合于眼球其他区域的内源性细胞的再生长的模型(pattem)。在15分钟之后，微接触印模通过贯穿神经视网膜的通路(pathway)被从细胞泡移出。在一可供选择的治疗中，微接触印模与布鲁赫膜接触大约1分钟多至大约1小时。在微接触印模被移去之后，一个在PBS(106个细胞/毫升)中RPE细胞的扩散被缓慢地注射到细胞泡里。在进一步可供选择的处理中，微接触印模被用生物可降解的材料来制作，微接触印模不移走，当细胞被加进时和加进之后继续留在原位。然后将手术工具从眼球移开，闭合切开的口子并且对病人进行标准的手术后处理。该RPE细胞的增生会覆盖布鲁赫膜暴露的部位，并且有助于维持布鲁赫膜的健康，也有助于叠加神经视网膜的支持。
在本例中，一个模盖(stencil)被置于体内的眼膜上面，提供一个显微构建的膜表面，它适合于细胞的生长。一个视网膜下腔细胞泡被用于进入病人眼睛的一个视网膜区域，该病人的RPE细胞已病变。在一个三通道玻璃体切割术并穿刺出一个贯通神经视网膜的小通道之后，通过将无菌盐水注射到视网膜下腔空间形成该细胞泡。所述细胞泡暴露的RPE细胞被从布鲁赫膜的一个部位移走，移走的方法是通过刮削(scraping)或其他的清除布鲁赫膜伤口的办法来进行，这样的方法就象是在脉络膜(choroidal)的新血管再生手术(neovascular)中所用的技术。纤连蛋白(取自人体血浆，25μg/ml，在PBS中存放)扩散进入细胞泡去涂覆被暴露的布鲁赫膜并且促进一个被加进的模盖(stencil)的粘连。一个模被用PDMS制成并且具有一个尺寸为60μm(跨其最宽的尺寸)相互间间隔为10μm的许多六角形的模型，所述的模盖(stencil)在PBS中被卷拢成圆筒状，并且被塞进一根针里。该模盖和PBS被缓慢地注射进在视网膜下腔里的细胞泡，再借用针的作用和被针射出的PBS液的作用将本来卷拢的模盖展开铺开。该铺平的模盖被置入到被暴露的布鲁赫膜上。这种在原位将模盖置入到布鲁赫膜上的做法其作用在于在被暴露的布鲁赫膜上提供一个模型(a pattern)，还在于导引被加进的细胞的生长或者取自眼睛的其他部位的内源细胞的再生生长。在模盖置入后，一种IPE细胞在PBC(105个细胞/毫升)中的扩散液被缓慢地注射进所述的细胞泡内。然后医疗器具被从眼睛移开，闭合切开的伤口并给病人以标准的手术后的处理。该IPE细胞的增生覆盖了被模盖的缝隙所暴露的布鲁赫膜的一些部分，并且有助于维持布鲁赫膜的健康和有助于在神经视网膜上面的支持。
权利要求
1.一种修饰膜组织的方法，它包含有施加一个生物分子的微型模格到一接触表面上去，并且用所述的接触表面去接触所述的组织以转移至少一部的在所述组织上的生物分子模格。
2.如权利要求1所述的方法，它进一步包含将该膜组织暴露到活细胞中的步骤。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是细胞被从一个由虹膜色素上皮细胞(IPE)、视网膜色素上皮细胞(RPE)和干细胞所组成的组中选出。
4.如权利要求3所述的方法，其特征是所述的细胞为自体细胞。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的组织是人体组织。
6.一种修饰来自于动物的膜组织的方法，它包括用一种基底去接触膜组织，然后再对该膜组织进行修饰。
7.如权利要求6所述的方法，其中基底包含一选自一个由玻璃；塑料；胶原；葡糖胺基聚糖类；脱乙酰壳多糖；聚羟基链烷酸酯类(polyhydroxyalkanoates)；聚α-羟酸(polyα-hydroxyacids)，包括聚乙二醇酸(PGA)，聚乳酸(PLA)和PGA-PLA混和物，合金和共聚物(PLGA)；聚二氧六环酮类(dioxanones)；聚(ε-己内酯)(polyε-caprolactone)；聚正酯类；聚酐类；聚磷腈；聚氨基酸和其它复合物，聚合物，共聚物、合金；混合物和这些化合物的结合物。
8.如权利要求7所述的方法，其中基底(substrate)包含有一种可生物降解的聚合物，它被从由聚乳酸(poly-lactic acid)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)、聚正酯类(polyorthoesters)、聚酐(polyanhydride(S)，聚膦嗪(polyphosphazines)，聚乳酸乙二醇酸共聚物(poly-lactic acid glycolic acid copolymers PLGA)，聚乙烯乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)，以及它们掺和物和共聚物组成的组中选出。
9.如权利要求6所述的方法，在此，膜组织包含有选自由晶状体囊组织，内界膜(inner limiting membrane)组织，角膜组织，布鲁赫膜组织，羊膜(anmiotic)组织、浆膜(serosal)组织，粘膜(mucosal)组织和神经组织(neurological tissue)的膜组织。
10.如权利要求6所述的方法，在此，改变膜组织的方法步骤包括膜组织的整体修饰(bulk modification)，其特征是所述的整体组织的修饰包括一个选自由机械切除、光消融、离子切除、水解蛋白酶的沉着和水解蛋白酶的光活化组的一种修饰。
11.如权利要求10所述的方法，其特征是所述的整体组织修饰是用来增加膜组织对电解质的通透性。
12.如权利要求10所述的方法，其特征是整体组织的修饰包含所述的膜组织表面的切除(ablaton)，以使将膜组织整体的厚度减小。
13.如权利要求12所述的方法，其特征是所述的切除步骤是要减小膜组织的整体厚度至大约2至5μm。
14.如权利要求10所述的方法，其特征是所述的整体组织修饰包含通过选自由激光光切除和离子切除的组中选出的方法来在膜组织内产生微孔和小窝。
15.如权利要求6所述的方法，改变(修饰)膜组织的步骤包括膜组织的表面修饰(surface modification)。
16.如权利要求15所述的方法，表面修饰步骤包括生物分子的微图式沉积到膜组织上。
17.如权利要求16所述的方法，其特征是生物分子被选自一个由蛋白质、肽、有机分子、低聚糖和短链聚合物组成的组。
18.如权利要求17所述的方法，其特征是所述的生物分子包含有选自由聚(甲基丙烯酸树脂)、聚苯乙烯、聚(甲基苯乙烯)，胶原、角蛋白、透明质酸，葡糖胺基聚糖类(glycosaminoglycan)，十八烷基三氯硅烷(octadecyltrichlorolsilane)，硅烷聚合物，聚赖氨酸，聚乳酸乙二醇酸衍生的聚赖氨酸和聚赖氨酸肽类。
19.如权利要求15所述的方法，其中，表面修饰包含处理膜组织表面去阻止细胞生成，然后施以选自由摘除(分离)一微型模格(micropattern)到表面上去，让细胞在所述的微型模格上有效生长，并且以接触表面去接触表面，使生物分子的微型模格沉着，使细胞得以在所述的微型模格上生长组成的组的治疗方法。
20.如权利要求15所述的方法，它进一步包含为膜组织的部分表面掩膜的工序和用紫外线辐照膜组织的工序，以使膜组织的暴露部分的胞外质(ECM)变性，所述的掩膜(masking)工序使得减低或阻止掩膜部分中胞外母质(ECM)的变性。
21.如权利要求20所述的方法，其中，掩膜工序选自一个组，这个组是由将网格定位(放置)到组织上面和施加保护分子的微型模格到膜组织的表面上去的工序构成的。
22.如权利要求21所述的方法，其中施布工序(applying step)包含有一个接触表面去接触膜组织的表面，作用在于施加一个保护分子的微型模格到膜组织的表面上去。
23.如权利要求6所述的方法，其中所述的动物是人。
24.一种用于在修饰的膜组织表面上生长细胞的方法，包括用一种基底接触膜组织，修改膜组织，和施布细胞到经修改的膜组织上。
25.如权利要求24所述的方法，其中，基底(substrate)包括一种选自玻璃；塑料，胶原，葡糖胺基聚糖类(glycosaminoglycans)，脱乙酰壳多糖(chitosan)，聚羟基链烷酸酯类(polyhydroxyalkanoates)，聚α-羟基酸(poly α-hydroxy acids)，包括聚乙二醇酸(PGA)，聚乳酸(PLA)，聚乳酸-聚乙醇酸交酯类混合物(polylactide-polyglycolide)(PGA-PLA)，合金或共聚物(PLGA)，聚二氧六环酮(polydioxanones)，聚ε-己内酯，聚正酯类(ortho esters)，聚酐类(polyanhydrides)；聚磷腈类(polyphosphazenes)聚瞵嗪，聚氨基酸类(poly amino acids)，其它化合物、聚合物、共聚合物、合金、混合物或上述化合物的组合。
26.如权利要求25所述的方法，其中，基底包括有一种可生物降价的聚合物、它选自一个由聚乳酸(poly-lactic acid)、聚乙二醇酸(polyglycolic acid)，聚正酯类(polyorthoesters)、聚酐类(polyanhydrides)、聚膦嗪(polyphosphaxines)、聚-乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)，聚乙烯基乙二醇/聚乳酸共聚物(PEG/PLA)和它们的混和物及共聚物。
27.如权利要求24所述的方法，其中，膜组织包括选自晶状体囊组织、内界膜组织、角膜组织、布鲁赫膜组织、羊膜组织，浆膜组织，粘膜组织和神经组织的膜组织。
28.如权利要求24所述的方法，它进一步包括在一个膜组织的表面提供微型模格。
29.如权利要求24所述的方法，其中细胞选自一个由虹膜色素上皮细胞(IPE)、视网膜色素上皮细胞(RPE)和干细胞组成的组。
30.如权利要求24所述的方法，其中膜组织和细胞自同一动物获得。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述的动物是人体。
32.一种经显微构建制成的膜组织，采用修改取自一种动物的膜的方法来制备，包括用基底去接触膜组织，并且修改该膜组织。
33.如权利要求32所述的显微构建制成的膜组织，其中，膜组织包括选自由晶状体囊组织、内界膜组织、角膜组织、布鲁赫膜组织、羊膜组织、浆膜组织、粘膜组织和神经组织组成的组的膜组织组成的组。
34.由权利要求24的方法制备的一种微加工膜组织，它具有在所述组织上生长的细胞。
35.具有权利要求34的细胞的显微构建组织，其中细胞包括选自由虹膜色素上皮细胞(IPE)、视网膜色素上皮细胞(RPE)和干细胞组成的组中的细胞。
36.一种培养生长用于移植细胞的方法，它包括提供一种可溶解的聚合物基底，将所述的可溶性聚合物基底浸润在磷酸盐缓冲盐水中，并且将上皮细胞施布到可溶性的基底中去。
37.如权利要求36所述的方法，其中，基底包含一种选自一个由聚乳酸、聚乙二醇酸、聚正酯类、聚酐、聚膦嗪、聚乳酸乙二醇酸共聚物(PLGA)、聚乙烯基乙二醇/聚乳酸(PEG/PLA)共聚物和它们的混和物及共聚物。
38.一种微加工膜组织，包含有一种取自动物的膜，所述的膜组织具有至少一个表面，一个在所述膜组织表面上的分子微型模格和支持基质层(support substrate)。
39.如权利要求38所述的微加工制成的膜组织，其中，所述的支持基质层包含一可生物吸收的材料。
40.权利要求39的用显微构建方法做成的膜组织，其中，所述的可生物吸收材料被选自一个可生物吸收材料的组，该组由胶原(collagen)，葡糖胺基聚糖类(glycosaminoglcans)，脱乙酰壳多糖(chitosan)；聚羟基链烷酸酯类(polyhydroxyalkanoates)；聚α-羟基酸(poly α-hydroxy acids)，包括聚乙二醇酸类(polyglycolic acid)PGA；聚乳酸类(polylactic acid)PLA；和聚乳酸聚乙二醇酸(PGA-PLA)混合物、合金和共聚物(PLGA)；聚二氧六环酮(polydioxanones)；聚ε-己内酯(ε-caprolactone)；聚正酯(poly ortho esters)；聚酐类(polyanhydrides)；聚磷腈类(poly phosphazenes)；聚氨基酸类(poly amino acids)；和其它化合物，聚合物，共聚物，合金，混合物和这些化合物的组合。
41.权利要求38、39或40的用显微构建方法做成的膜组织，其中，该膜组织包含有选自一组的膜组织，该组是由晶状体囊组织、内界膜组织、角膜组织、布鲁赫膜组织、羊膜组织、浆膜组织、粘膜组织和神经组织组成的。
42.如权力要求38、39、40或41所述的显微构建膜组织进一步包含有在所述组织上生长的细胞。
43.所述的用显微构建法做成的组织具有权利要求42的细胞，其中，该细胞包含选自一个组的细胞，该组是由IPE细胞、RPE细胞和干细胞组成。
44.一种用显微构建法做成的膜组织，它具有一个组织表面，它包含有一印模板，所述的印模板(stencil)具有一显微构建做成的通道，通道是贴壁于所述的膜组织的表层，所述组织表层的部分通过所述的印模板通道(stencil passages)被暴露。
45.权利要求44的用显微构建方法做成的膜组织，其中膜组织包含选自一个组的膜组织，这个组是由晶状体囊组织、内界膜组织、角膜组织、布鲁赫膜组织、羊膜组织、浆膜组织、粘膜组织和神经组织所组成。
46.一种用显微构建方法做成的膜组织，其组织表面有在所述的组织表面上生长的细胞，它包含有一个模板，它具有被显微构建加工而成的通道模型(pattern)，通道贴壁于所述的膜组织的组织表面，所述的组织表面有部分通过印模板通道被暴露，并且，所述的细胞生长在所述的被暴露的部分。
47.用显微构建方法加工成的组织，它具有权利要求46的细胞，其中，细胞包含有选自一个组的细胞，该组是由IPE细胞、RPE细胞和干细胞所组成。
48.用显微构建方法加工成的膜组织，它具有一种组织表面，包含有一个在所述膜组织的所述组织表面上的模型(pattern)，该膜组织是通过所述组织表面与导引自微观流网络的溶液之间的接触而形成的所述膜组织的组织表面上的一个模型。
49.权利要求48的用显微构建方法做成的膜组织，其中，膜组织包含有选自一个组的膜组织，该组是由晶状体囊组织、内界膜组织、角膜组织、布鲁赫膜组织、羊膜组织、浆模组织、粘膜组织和神经组织所组成。
50.一种用显微构建做成的膜组织，它带有一组织表面，该表面具有在其组织表面上生成的细胞，所述的细胞在一个通过所述组织表面与导引自微观流网络的溶液之间相接触来导引的模型里生长。
51.采用显微构建做成的具有权利要求50的细胞，其中，细胞包含有选自一个组的细胞，该组是由IPE细胞、RPE细胞和干细胞组成。
52.在被修饰过的如权利要求24的膜组织上生长细胞之方法，其中，施布细胞到修饰过的膜组织上，它包含有离心方法。
全文摘要
本发明提供膜组织修饰方法和设备，可将修饰组织上生长的细胞进行移植。特别是应用于修饰晶状体囊膜组织和内界膜组织，并使虹膜色素上皮细胞(IPE)，视网膜色素上皮细胞(RPE)，干细胞以及其它细胞在修饰膜组织上生长。另外讨论生物可降解复合物基底的应用。膜表面可以用印记接触，用印模板(stencil)覆盖的方法进行修饰，印模板具有可以接触到膜表面的通道。膜组织修饰方法可用印记(stamp)这样的接触表面接触使膜组织上留下生物分子的显微模格(micropatterns)，另外还可用机械切除，光切除，离子束切除，以及蛋白分解酶的作用进行膜组织的修饰。用生物可吸收材料包括已修饰的膜组织有助于膜组织移植到动物体内。通过膜组织原位印模板放置技术或用显微接触印记原位(in situ)接触技术，膜组织可以在完整的动物体内进行修饰。
文档编号C12N5/06GK1512856SQ02810810
公开日2004年7月14日 申请日期2002年5月31日 优先权日2001年6月1日
发明者哈维·A·菲什曼, 马克·布鲁门克拉恩茨, 斯戴茜·福朗西尼·本特, 克里丝廷·李, 菲利普·Jr·修尔, 戴尼尔·V·帕兰克, 卡拉场·V·比尔堡, Jr 修尔, V 帕兰克, V 比尔堡, 福朗西尼 本特, 哈维 A 菲什曼, 布鲁门克拉恩茨, 廷 李 申请人:利兰·斯坦福初级大学董事会, 利兰 斯坦福初级大学董事会