专利名称：从木片中提取松材线虫的dna的方法、松材线虫的lamp引物组和从木片中检出松材线虫的方法
技术领域：
本发明涉及从含有松材线虫的木片提取松材线虫的DNA的方法；由与松材线虫 的DNA的特定区域进行退火的引物组成的LAMP引物组，从木片中检出松材线虫的方 法；和使用松材线虫的基因扩增的检出方法。
背景技术：
松材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)是在日本的森林中造成最大危害的松材线
虫病的病原体。松材线虫是来自北美的入侵物种，由于日本的松树对松材线虫不具有抵 抗性，因此受到严重危害，现在，除了北海道和青森县，蔓延到全部都府县。在松材线虫病的诊断中，必须从枯死的松木片检出松材线虫。一般而言，目前 通过从木片中分离松材线虫，由观察形态进行检出，在该松材线虫的分离中使用贝尔曼 法。贝尔曼法(例如，参照非专利文献1)，是以纸巾包住木材片并将其浸泡于盛满水的 漏斗中的方法。在木材片中存在线虫时，该线虫沉淀于漏斗底部。此后，以显微镜确认 沉淀的线虫形态，判断是否为松材线虫。但是，贝尔曼法在从木片中分离线虫时需要很长时间，除此以外关于线虫形态 的专业知识和显微镜等高价仪器是不可缺少的。因此，至今的松材线虫检出只能在具备 能够识别线虫的人才和具备仪器的专业机构进行。换而言之，目前不存在能够容易地进 行松材线虫检出的方法。非专利文献1 真宫靖治、二井一祯、小阪肇、神崎菜摘(2004)材线虫。(线 虫学实验法，日本线虫学会编，日本线虫学会，茨城)，134-153。
发明内容
在食品和医疗领域等中，提出有使用DNA扩增的病原体检出方法。但是，如后 所述，由于松材线虫在树木中存在，因此，即使使用在其它领域中进行的现有方法也存 在无法实际应用的特殊情况。本发明是鉴于这样的情况而作出的，目的在于提供一种容易地从含有松材线虫 的木片提取松材线虫的DNA的方法、松材线虫的LAMP引物组和能够使用基因扩增而容 易地检出松材线虫的松材线虫的检出方法。g卩，本发明是一种从木片中提取松材线虫的DNA的方法，特征在于，在含有分 解角蛋白的酶的溶液中浸泡含有松材线虫的木片，提取松材线虫的DNA。另外，本发明是一种LAMP引物组，特征在于，由能够与松材线虫的核糖体 RNA基因(rDNA)的特定区域进行退火的序列表1至4所示的各碱基序列F3、B3、FIP 和BIP的引物组成(在本说明书中将该引物组称为第1引物组)。这里，本发明的LAMP 引物组也可以含有如序列表5所示的碱基序列Loop-F的引物(在本说明书中将除了碱基 序列F3、B3、FIP和BIP的引物以外，还含有Loop-F引物的引物组称为第2引物组)。这些引物组能够在含有松材线虫的木片中使分解角蛋白的酶发挥作用从而提取的松材线 虫的DNA的扩增中使用。本发明还是一种松材线虫的检出方法，特征在于，具备在含有分解角蛋白的 酶的溶液中浸泡含有松材线虫的木片，提取松材线虫的DNA的阶段；和对提取的松材线 虫的DNA进行扩增而检出的阶段。这里，对松材线虫的DNA进行扩增而检出的阶段 中，能够使用第ILAMP引物组或第2LAMP引物组，利用LAMP法进行扩增而检出松材 线虫的rDNA的特定区域。另外，本发明还是一种松材线虫的DNA检出方法，特征在于，具备使用第 ILAMP引物组或第2LAMP引物组，利用LAMP法进行扩增而检出松材线虫的rDNA的 特定区域的阶段。发明的效果根据本发明，由于以松材线虫在木片中存在的状态从木片中提取松材线虫的 DNA,因此，能够不从该木片分离松材线虫而提取松材线虫的DNA。由此，能够使实际 应用使用松材线虫的DNA的检出变为可能。另外，根据本发明，能够利用LAMP法进行扩增而检出松材线虫的rDNA的特定 区域。因此，能够以更高精度容易且廉价地进行松材线虫基因的扩增和检出。
具体实施例方式在本实施方式的松材线虫的检出方法中，例如在含有分解角蛋白的酶的溶液中 浸泡来自松属树木的木片，提取存在于该木片中的松材线虫的DNA，由此，不从木片中 分离松材线虫而提取DNA。接着，使用含有能够与松材线虫的rDNA内的特定区域进行 退火的引物的LAMP法用引物组，使用作为基因扩增方法之一的LAMP法对松材线虫的 DNA进行扩增而检出，由此进行从收集的木片的松材线虫的检出。如上所述，目前，利用贝尔曼法从木片中分离松材线虫后，通过使用显微镜进 行形态观察而鉴定松材线虫。相对于此，本发明人首先发表使用DNA的检出进行松材线 虫的检出的方法。但是，对存在有松材线虫的木片使用现有的DNA提取方法时，难以高效地从木 片中提取松材线虫的DNA，提取需要非常长的时间。另一方面，也考虑粉碎存在有松 材线虫的木片而提取DNA，进行精制，但是由于必须有用于粉碎木片的粉碎机等专门机 器，因此，在不具备这样的专门机器时，该方法的使用是困难的。换而言之，在不具备 这样的专门机器时，从木片中分离松材线虫而提取DNA，结果也需要与贝尔曼法同样程 度的劳力和时间。另外，即使使用了该方法，在提取液中也大量含有木质素等来自木片 的成分。因此，为了在利用DNA的扩增的检出中使用，也必须充分地进行提取的DNA 的精制。因此，本发明的发明人着眼于作为松材线虫体表的主要成分之一的角蛋白。发 明人进行了深入研究，结果发现，在含有松材线虫的木片中使分解角蛋白的酶发挥作 用，溶解松材线虫的体表，提取其中的DNA，从而完成了本发明。即，根据本发明，即 使省略或简化对收集的木片进行粉碎等的处理，也能够以短时间提取松材线虫的DNA。 另外，由于在DNA提取缓冲液中渗出的来自木片的成分也少，因此，能够省略或简化
4DNA精制过程。另外，作为新的基因扩增法之一，已知有由荣研化学社(枥木)开发的LAMP 法(Loop-Mediated Isothermal Amplification,环介导等温扩增技术)。LAMP法由于特异
性、扩增效率高和在反应系统中添加荧光色素，从而能够利用目测进行扩增的判断，因 此，能够以短时间进行基因的扩增和检出。另外，由于LAMP法是等温核酸扩增法，因 此，不需要特别的温度控制设备，另外，在LAMP法中使用的链取代型DNA聚合酶不需 要如PCR法地具备耐热性。因此，与PCR法等相比，能够更廉价地进行反应。因此， 在进行松材线虫的基因的检出时，如果能够使用LAMP法，则能够更容易且廉价地进行 松材线虫的基因扩增和检出。本发明的发明人进行了深入研究，结果发现能够特异地与 松材线虫的rDNA的特定区域进行退火的、序列表1至4所示的LAMP法用引物(LAMP 引物)组，从而使使用LAMP法的松材线虫的基因的检出成为可能。另外，通过使用序 列表5所示的Loop-F引物，能够以更短时间进行扩增和检出。以下详细说明本发明的优选实施方式。首先，详细叙述利用从存在有松材线虫的松木片(松材片)提取松材线虫的 DNA而得到的松材线虫的DNA提取液的配制。在本实施方式中，在含有分解角蛋白的 酶(以下称为角蛋白分解酶)的溶液(缓冲液、DNA提取缓冲液)中加入收集的松材片， 进行孵育而提取存在于松材片中的松材线虫的DNA，制成DNA提取液。对于缓冲液， 只要角蛋白分解酶具有活性即可，能够使用能够用于DNA提取的缓冲液，例如，能够例 示含有NaCl、Tris-HCL EDTA的缓冲液，此时，能够形成为NaCl: 100 150mM、 Tris-HCl 10 50mM、EDTA 0.1 ImM。这里，对本实施方式的角蛋白分解酶没有特别限定，例如，能够使用蛋白酶 K(E.C.3.4.21.64)。角蛋白分解酶分解作为松材片中的松材线虫体表主要成分之一的角蛋 白，溶解细胞而使核内的DNA在DNA提取缓冲液中溶出。因此，能够不从木片中分离 松材线虫，从松材片直接提取松材线虫的DNA。对角蛋白分解酶在DNA提取缓冲液中的 含量没有特别限定，例如，在提取缓冲液中能够含有7.5U/μ 1左右。另外，在配制DNA 提取液时，能够通过在DNA提取缓冲液中添加含有角蛋白分解酶的DNA提取试剂盒而 使用。该DNA提取试剂盒，例如能够使用ISOHAIR((株)Nippongene)。供给上述松材线虫的DNA提取的木片大小、收集方法不限定本发明，能够任 意设定。另外，对收集木片的树木种类也没有特别限定，例如，能够例示作为松属树木 的黑松、赤松、琉球松、红松、五针松、樟子松、欧洲黑松、海岸松、欧洲山松、辐射 松、西黄松、西部白松、台湾黑松、油松、乔松、湿地松、刚松、扭叶松、北美乔松、 火炬松、长叶松、北美短叶松、刺针松、白皮松、马尾松等。另外，也可以在上述的 DNA提取液中，进行公知的DNA精制处理，提供给后述的利用LAMP法的扩增。另外， 使用角蛋白分解酶的DNA提取法，不只限定于存在于木片中的松材线虫，当然也能够使 酶作用于松材线虫其本身，提取DNA。接着，详细叙述本发明的LAMP引物的设计。本实施方式中，确定松材线虫碱 基rDNA的ITS (Internal Transcribed Spacer,内转录间隔区)区域的碱基序列，基于该碱 基序列，使用引物设计支持软件，进行对松材线虫特异的LAMP法用引物的设计。具体 而言，首先通过PCR法使松材线虫和拟松材线虫(最接近松材线虫的近缘物种)的rDNA的ITS区域扩增，使用ABI3 100DNA sequencer (Applied Biosystems)确定该区域的碱基序 列。使用荣研化学(株)在WEB上提供的LAMP弓I物设计支持软件(Primer Explorer V4) 解析两种碱基序列信息，设计LAMP引物，使得只有松材线虫的DNA扩增。这里，本实施方式的LAMP引物设计时，对rDNA的ITS区域内的标的基因，分 别规定从3'末端一侧的称为F3c、F2c、Flc的3个区域和另外朝向标的基因的5'末端 一侧的称为Bi、B2、B3区域，对这6个区域设计F3、B3、FIP和BIP的4种引物。另 外，使与F3c、F2c、Flc各区域互补的区域分别为F3、F2、Fl,另外，使与Bi、B2、 B3各区域互补的区域分别为Blc、B2c、B3c。具体而言，序列表1所示的F3引物设计为具有与F3c区域互补的序列的F3区域。另外，序列表2所示的B3引物设计为具有与B3c区域互补的序列的B3区域。另外，序列表3所示的FIP引物设计为在3'末端一侧具有与rDNA的ITS区域 中规定的F2c区域互补的序列的F2区域，在5'末端一侧具有与Flc区域相同的序列。另外，序列表4所示的BIP引物设计为在3'末端一侧具有与B2c区域互补的序 列的B2区域，在5'末端一侧具有与Blc区域相同的序列。此外，本实施方式含有序列表5所示的Loop-F引物。由此，由于能够增加扩 增操作时DNA合成的起点，使扩增反应加速，因此，能够以更短的时间进行松材线虫的 DNA扩增和检出。序列表5所示的Loop-F引物设计为具有与Fl区域和F2区域之间的 区域互补的序列。接着，说明对提取的DNA通过使用上述引物组的利用LAMP法的扩增操作。利用LAMP法的扩增操作，例如，能够如下地进行。首先，混合反应试剂(例 如，Bst DNA聚合酶、反应用缓冲液(reaction mix)、引物组、蒸馏水)，配制扩增反应 液。另外，也可以一并混合后述的荧光·目测检出试剂。除了引物组的反应试剂，能够使用例如由荣研化学社市售的L00pamp(注册商 标，以下相同)DNA扩增试剂试剂盒。Loopamp DNA扩增试剂试剂盒由以下含有成分 构成2 倍浓度反应用缓冲液(2 X Reaction mix) 40mM Tris-HCl (pH8.8)、2OmM KCL 16mM MgSO4> 2OmM (NH4) 2SO4、0.2%Tween20, 1.6MBetaine、各最终浓度为 2.8mM 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ； Bst DNA Polymerase 8units/μ 1。另外，对后述的荧光·目 测检出试剂，也能够使用例如由荣研化学社市售的Loopamp荧光·目测检出试剂。接着，在该扩增反应液中，添加上述的松材线虫的DNA提取液，例如以63°C进 行孵育。这里，LAMP法的反应由下述工序进行。(1)序列表3的FIP引物与模板DNA 进行退火。(2)利用BstDNA聚合酶的作用，以FIP引物的F2区域的3'末端作为起点， 合成与模板DNA互补的DNA链。(3)序列表1的F3弓丨物与FIP引物的外侧进行退火， 以该3'末端为起点，利用BstDNA聚合酶的作用，边解开先前合成的FIP的DNA链， 边延长DNA的合成。(4)由F3引物合成的DNA链和模板DNA形成双链。(5)另一方面，从F3引物的DNA链解开的来自FIP引物的DNA链形成单链 DNA。该DNA链在5'末端一侧具有互补的区域Flc、Fl,发生自退火而形成环状。(6) 序列表4的BIP引物组在上述的(5)中形成环的DNA链进行退火。以该BIP引物的3'末端为起点，进行互补的DNA的合成，在(5)中形成的环解开而延长。另外，序列表2 的B3弓丨物与BIP弓丨物的外侧进行退火。以B3弓丨物的3'末端为起点，利用BstDNA聚 合酶的作用，边解开先前合成的BIP引物的DNA链，边延长DNA的合成。(7)通过上 述(6)的过程形成双链DNA。 (8)另一方面，由在(6)的过程中解开的BIP引物合成的 DNA链，由于在两端具有互补的序列，因此，发生自退火而形成环状，成为哑铃样的结 构。(9)以在上述(8)形成的哑铃样结构的DNA链为起点，通过FIP引物和随后的BIP 引物的退火，进行DNA扩增循环。用于扩增操作的孵育时间，例如能够为60分钟。通过在LAMP法中的退火反应 和DNA链合成，在该孵育期间能够使DNA扩增为IO9 IOw倍。本实施方式中，接着，对进行了扩增操作的反应液进行是否含有松材线虫的 DNA的确认。S卩，在提供给检出的松材片中存在松材线虫时，通过扩增操作，松材线虫 的DNA被扩增而检出。另一方面，如果在提供给检出的松材片中不存在松材线虫，即使 进行扩增操作，松材线虫的DNA也不被扩增，因此不被检出。在反应液中是否含有被扩增的DNA，例如能够通过荧光目测检出而确认。荧光 目测检出是添加荧光目测试剂使之反应，通过目测确认反应液的颜色。具体而言，如果 反应液发出荧光，则能够判断为阳性，即松材线虫的DNA被扩增，如果反应液不发出荧 光，则能够判断为阴性，即松材线虫的DNA不被扩增。该反应液的荧光能够利用紫外线 照射装置更明确地判断阳性和阴性的不同。如上所述对本实施方式进行了说明，但本发明不受此限定，能够为其它实施方 式。例如，在LAMP法中的DNA扩增的检出方法不限定于荧光目测检出，能够任意变 化。具体而言，由于作为扩增副产物的焦磷酸镁的影响引起扩增反应液出现白浊，通过 测定此时的扩增反应液的浊度，可以检出松材线虫的DNA扩增。对基因的扩增，也能够 使用公知的各种核酸扩增方法，例如能够使用PCR(Polymerasa Chain Reaction)法进行。此外，使用本发明的LAMP引物，利用LAMP法对DNA进行扩增而检出方法， 不限于从木片中直接提取松材线虫的DNA的情况，也能够适用于利用贝尔曼法等将松材 线虫从木片中分离而提取DNA的情况。以下，通过实施例更详细地说明本发明。但是，本实施例不对本发明产生任何 限制。(实施例1)在本实施例中使用的松材片从森林综合研究所本所院内10棵枯死的黑松采集。 其中5棵是松材线虫感染的黑松(人为地接种松材线虫使之枯死的黑松)，其余5棵是没 有松材线虫感染的黑松(以健全状态伐倒后，为了防止松材线虫感染，在网室中隔离的 黑松)。从收集的松材片提取松材线虫的DNA，配制松材线虫的DNA提取液。具 体而言，首先在1.5ml微量离心管中加入Iml DNA提取缓冲液(IOOmM NaCl、IOmM Tris-HCl (pH8.0)、ImM EDTA)。接着，在微量离心管中的该DNA缓冲液中添加40 μ 1 含有作为角蛋白分解酶的蛋白酶K的DNA提取试剂盒(ISOHAIR，(株)Nippongene)的 Lysis buffer和50 μ IEnzyme solution，充分搅拌。接着，在微量离心管内的溶液中加入收 集的约0.06g松材片，以55°C孵育20分钟，接着以94°C孵育10分钟。
接着，使用本发明的试剂盒和上述DNA提取液，利用LAMP方法进行扩增和检 出操作。具体而言，首先在0.2ml微量离心管中以下述份量分别注入本发明的引物组、 Loopamp DNA扩增试剂试剂盒(荣研化学(株))的各试剂，和Loopamp荧光·目测检出 试剂(荣研化学(株))，制成反应液。引物组以如下方法得到利用PCR法使松材线虫 和拟松材线虫的 rDNA 的 ITS 区域扩增，使用 ABI3100DNA sequencer (Applied Biosystems) 确定该区域的碱基序列后，使用荣研化学(株)在WEB上提供的LAMP引物设计支持软 件(Primer Explorer V4)解析两种碱基序列信息，设计LAMP引物，使得只有松材线虫的 DNA扩增。2 X Reaction Mix 12.5 μ 1Primer FIP (序列表 1) 1.0 μ 1 (40pmol/ μ 1)Primer BIP (序列表 2) 1.0 μ 1 (40pmol/μ 1)Primer F3(序列表 3) 1.0 μ 1 (5pmol/μ 1)Primer B3(序列表 4) 1.0 μ 1 (5pmol/μ 1)Primer Loop-F (序列表 5) 1.0 μ 1 (20pmol/μ 1)Bst DNA Polymerase 1.0 μ 1荧光·目视检出试剂1.0 μ 1蒸馏水3.5μ 1合计23.0 μ 1接着，在该扩增反应液中加入2μ1上述的DNA提取液，充分搅拌，在63°C的条 件下放置1小时。1小时后，通过目测确认扩增反应液是否发出绿色荧光。在表1中表示其结果。 发出绿色荧光的判断为阳性时，表示为〇，不发出荧光判断为阴性时，表示为X。[表1]使用由松材线虫的感染引起枯死的黑松(感染线虫)和由人为的伐倒引起枯死的 黑松(未感染线虫)的松材片，利用LAMP法的松材线虫检出结果。
权利要求
1.一种从木片中提取松材线虫的DNA的方法，其特征在于在含有分解角蛋白的酶的溶液中浸泡含有松材线虫的木片，提取所述松材线虫的 DNA。
2.—种LAMP引物组，其特征在于由能够与松材线虫的rDNA的特定区域进行退火的序列表1至4所示的各碱基序列 F3、B3、FIP和BIP的引物组成。
3.如权利要求2所述的LAMP引物组，其特征在于还含有序列表5所示的碱基序列Loop-F的引物。
4.一种松材线虫的DNA检出方法，其特征在于具备使用权利要求2或3所述的LAMP引物组，利用LAMP法进行扩增而检出所述 松材线虫的rDNA的特定区域的阶段。
5.—种松材线虫的检出方法，其特征在于，具备在含有分解角蛋白的酶的溶液中浸泡含有所述松材线虫的木片，提取所述松材线虫 的DNA的阶段，和对提取的所述松材线虫的DNA进行扩增而检出的阶段。
6.如权利要求5所述的松材线虫的检出方法，其特征在于对所述松材线虫的DNA进行扩增而检出的阶段中，使用由序列表1至4所示的各基 碱序列F3、B3、FIP和BIP的引物组成的第ILAMP引物组或由序列表1至5所示的各碱 基序列F3、B3、FIP、BIP和Loop-F的引物组成的第2LAMP引物组，利用LAMP法进 行扩增而检出所述松材线虫的rDNA的特定区域。
全文摘要
本发明提供一种不从来自松属等树木的木片分离松材线虫而提取松材线虫的DNA并检出的方法。该方法包括从收集的含有松材线虫的木片提取松材线虫的DNA的方法；由与松材线虫的DNA的特定区域进行退火的引物组成的LAMP引物组；和使用该引物组，利用LAMP法进行DNA的扩增而检出的从木片中检出松材线虫的方法。
文档编号C12N15/09GK102016030SQ20088012905
公开日2011年4月13日 申请日期2008年10月23日 优先权日2008年5月7日
发明者相川拓也, 神崎菜摘, 菊地泰生 申请人:独立行政法人森林综合研究所