一种抗人淀粉样β肽的纳米抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物化学与分子生物学领域，涉及一种抗人淀粉样β肽(amy IoidP，Αβ) 的纳米抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是进行性认知功能障碍和行为损害为 特征的中枢神经系统变性疾病。2015年9月Alzheimer's disease international，（ADI)的 报告数据显示：目前约每3.2秒就有一人罹患老年痴呆，在老年痴呆患者中60-70%为阿尔 茨海默病性痴呆，随着老龄人口基数和比例的持续增加，AD带来患者个人的痛苦和社会、家 庭的压力将越来越严重。
[0003] 淀粉样肽(amyloidi3，Ai3)是存在于人脑的天然产物，其在神经细胞发育(Heo C， et al.J Neurochem.2007;102(2):493-500·)、睡眠调节（Kang JE，et al.2009;326 (5955): 1005-7)、抗菌（Soscia SJ，et al .PLoSOne 2010;5:e9505.)等方面发挥积极的调 节作用。但遗传学分析发现Αβ前体蛋白（amyloid precursor protein，APP)(Goate A,et al.Nature.1991;349(6311):704-6;Jonsson T，et al.Nature.2012;488(7409):96-9)或 与其代谢相关的基因如早老素发生突变与家族性AD的是否发生相关（Kamino K，et al.Neurosci Lett.1996；208(3):195-8；Sherrington R,et al.Nature.1995；375(6534): 754-60.)，因此人们认为Αβ肯定与AD的发生相关。在AD发生过程中自由Αβ经历先增加后减 少的过程(Maia LF，et al.EMBO Mol Med.2015;7(7):895-903·)，可能正是由于Αβ的代谢 失衡，Αβ在某种未知条件的诱导下逐渐聚集形成可溶的Αβ聚集体以及不溶的Αβ纤维沉积。
[0004] 动物模型研究和临床实验均发现普通抗体都可以在一定程度上干扰A邱勺代谢，但 在缓解AD病情发展方面没有获得理想的结果。仔细分析治疗过程发现，其治疗机理主要是 通过药物与血液内A邱勺结合打破血液与脑脊液A邱勺平衡，促使脑脊液内Αβ跨越血脑屏障进 入血液;或者是通过抗体跨越血脑屏障起到直接治疗效果，但实际所用药物主要是IgG类抗 体，血液内极低的Αβ水平和抗体难于跨越血脑屏障的缺陷，大大限制了其治疗效果(Bard F,et al.Exp Neurol.2012；238(I):38-43.)〇
[0005] 为了提高抗体跨越血脑屏障的能力，目前通常对抗体进行包埋修饰或将靶标抗体 与具有跨血脑屏障能力的蛋白（脑血管内皮细胞相关抗原抗体或具有特殊转胞吞作用的蛋 白）构建成嵌合体。无论哪一种策略，都进一步增加了抗体的制备成本。而分子量较小（12-15kD)等电点较高(p I >9.2)的来自驼科动物重链抗体可变区的纳米抗体在不进行任何修饰 的条件下可以非常高效的跨越血脑屏障（Li T，et al.FASEB J.2012;26(10):3969-79.)， 因此纳米抗体在脑疾病治疗中具有很好的应用前景；另外，获得的纳米抗体和普通抗体一 样可以用于以Αβ为靶标的诊断、检测与治疗。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的之一是提供一种抗淀粉样β肽的纳米抗体。
[0007] -种抗淀粉样?3肽的纳米抗体，所述纳米抗体氨基酸序列包括框架区FR和互补决 定区⑶R，其特征在于，所述的框架区FR由下组的FR的氨基酸序列组成:如SEQ ID NO. 1所示 的FRl，如SEQ ID NO. 2所示的FR2,如SEQ ID NO. 3所示的FR3,如SEQ ID NO.4所示的FR4;所 述的互补决定区⑶R由下组的⑶R的氨基酸序列组成：如SEQ ID NO.5所示的⑶R1，如SEQ ID N0.6所示的CDR2，如SEQIDN0.7所示的CDR3。
[0008]进一步地，所述的抗淀粉样β肽的纳米抗体，其具有SEQ ID NO.8所示的氨基酸序 列。
[0009] 本发明目的之二是提供一种上述所述的纳米抗体在制备治疗淀粉样抑太代谢失衡 引起的疾病的药物中的应用。优选地，所述的淀粉样抑太代谢失衡引起的疾病为阿尔茨海默 病。
[0010] 本发明目的之三是提供一种上述所述的纳米抗体在制备检测淀粉样抑太的检测试 剂中的应用。
[0011] 本发明还提供一种DNA分子，其编码本发明所述的抗淀粉样β肽的纳米抗体。
[0012] 本发明的有益效果：
[0013] 本发明提供了一种特异性的抗Αβ的纳米抗体，该纳米抗体对Αβ具有与已发表抗体 不同的氨基酸序列，可以将其对应的基因转入到原核的或真核表达体系中进行表达，获得 的抗体可以应用在各种以Αβ为靶标的疾病的治疗药物的制备以及仙的检测试剂的制备中。
【附图说明】
[0014] 图1为本发明纳米抗体的框架区、互补决定区的位置以及氨基酸序列示意图。
[0015]图2为SDS-PAGE电泳检测纳米抗体在IPTG诱导条件下的表达情况。M为蛋白质分子 量标准;泳道3为未加 IPTG诱导的全菌蛋白；泳道1与2为IPTG诱导后的全菌蛋白。
[0016]图3为SDS-PAGE电泳检测金属螯合层析分离纯化纳米抗体情况。M为蛋白质分子量 标准，泳道1为流穿液;泳道2-4为50mM咪唑洗脱;泳道5-11为150mM咪唑洗脱；泳道12-13为 500mM咪唑洗脱。
[0017] 图4为ELISA检测纳米抗体对不同序列(Αβ?2-35、六04〇、六042)与状态（单体、可溶聚集 体和纤维)Αβ的结合能力。对照组与实验组的区别是前者包被抗原未加入纳米抗体，后者加 入了纳米抗体。
[0018] 图5为MTT检测纳米抗体对Αβ处理细胞SH-SY5Y的保护情况。
【具体实施方式】
[0019] 下述非限制性实施例可以使本领域技术人员更全面理解本发明，本申请公开的 DNA序列和氨基酸序列可以按照本领域常用的其他方法获得。而且可以将本申请获得的新 的氨基酸序列对应的基因构建到任何合适的载体，用任何合适的表达体系进行表达。下述 内容仅仅是对本申请要求保护的范围的示例性说明，一些根据所公开的内容做出的改变和 修饰，也应当属于本申请要求保护的范围。本文实施例中所使用的药品及试剂若无特殊说 明均按常规途径获得。
[0020] 不同序列的Αβ(Αβ?2-35、Αβ40、Αβ42 )的单体、可溶聚集体和纤维购自杭州中肽生化有 限公司。
[0021 ]实施例1纳米抗体库的建立
[0022] 本发明使用的噬菌体展示库是以T7噬菌体为载体的非免疫库，建立步骤如下：
[0023] (1)提取2岁雄性羊驼外周血淋巴细胞的总RNA(ambi〇n?:PuerLinkTM RNA Mini Kit，Life Technologies :12183018A);以UP primer 1 为引物将提取的总RNA反转录为 cDNA，并采用两轮巢式PCR扩增VHH基因；其中第一轮PCR为以转录的cDNA为模版，以UP primer 1和DOWN primer 1为引物，PCR扩增后回收大小为650~750bp的条带，再以此为模 版，进行第二轮PCR扩增，上游和下游引物分别为UP primer 2和DOWN primer 2,回收得到 450~500bp的PCR产物；
[0024] UP primer I: 5'_GGTACGTGCT GTTGAACTGT TCC-3'
[0025] DOWN primer I: 5'-CTTGGTGGTCCTGGCTGCTCT-3'
[0026] UP primer 2: 5'_AAGCTTTTGT GGTTTTGGTG TCTTGGGTTC-3'
[0027] DOWN primer 2: 5'-AAGCTTGGGG TCTTCGCTGT GGTGCG-3'
[0028] (2)用EcoRI和Hindi Π 酶切上述PCR产物，即为VHH基因片段；
[0029] (3)用T4 连接酶连接 ?7 载体（T7Select?l〇-3Cl〇ning Kit, Merck Millipore Novagen'70550-3)和VHH基因片段，将连接产物进行包装，然后进行扩增(方法见实施例 2)，得噬菌体原始文库。
[0030] 实施例2 T7噬菌体的液体扩增
[00311 (1)活化宿主菌:在50ml LB培养基(含0 · lmg/mL羧苄青霉素，简称Carb-LB)中接种 大肠杆菌BLT5403,37°C170r/min过夜培养，得一代宿主菌；
[0032] (2)在Carb-LB液体培养基中接种1 %的一代宿主菌，摇床培养，到OD6qq为0.5-1.0， 得二代宿主菌；
[0033] (3)用T7噬菌体感染二代宿主菌，37°C200r/min培养2-3h，观察溶菌情况，溶菌完 全立即停止培养。将溶菌产物在8000g离心10min，并回收上清，上清即为扩增的噬菌体。测 定滴度。
[0034]实施例3 T7噬菌体滴度的测定
[0035] (1)在培养皿中倒入Carb-LB底层培养基，冷却、凝固；
[0036] (2)溶解顶层培养基，冷却，加入Carb后45°C保温；
[0037] (3)用无菌LB液体培养基梯度稀释扩增的噬菌体；
[0038] (4)300yL二代宿主菌与50yL不同梯度稀释的噬菌体混匀，加入4mL预热Carb-顶层 培养基，迅速倒入有底层培养基的平皿中，晃动平皿使之分布均匀；
[0039] (5) 37°C倒置培养3_4h，直到看