一种抗破伤风毒素的中和性单克隆抗体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种抗破伤风单克隆抗体多肽，以及所述基因和多肽在制备破伤风治 疗药物中的应用，属于基因工程和免疫球蛋白技术领域。
【背景技术】
[0002] 破伤风是由破伤风梭状芽孢杆菌(破伤风杆菌，Clostridium tetani)引起的感染 性细菌性疾病。在厌氧条件下（如被污染的坏死性伤口），这种无所不在的杆菌可产生一种 毒性极强的神经毒素一破伤风痉挛毒素。破伤风痉挛毒素可阻断中枢神经系统中的抑制性 神经递质，引发肌肉强直和痉挛，亦即破伤风的典型表现。破伤风可在任何年龄发病，即便 有了现代加强监护的条件，病例死亡率也非常高。一切开放性损伤，均有发生破伤风的可 能。绝大多数破伤风病例与生育相关，多发于发展中国家，主要见于不洁分娩和产后卫生条 件较差的新生儿和孕产妇。儿童和成人受伤后发生破伤风也是一个严重的公共卫生问题。 近年来，地震、山体滑坡、泥石流、洪水、台风等自然灾害频发，极大地增加了受伤灾民和救 灾人员感染破伤风导致死亡的危险性。据报道，印度洋海啸发生两周半以后，印尼亚齐发生 了 106例破伤风，其中20例死亡。2005年巴基斯坦地震后同样报告了破伤风病例。此外，由于 破伤风毒素的毒性非常强烈，仅次于肉毒毒素，约IOOng的破伤风毒素便可以致人死亡，因 此极有可能被用于生物战剂。1996年召开的生物武器公约缔约国政府专家特设小组第五次 会议确定的生物战剂标准与战剂病原体清单中，破伤风毒素被列为用于攻击人的毒素。安 全、有效的破伤风治疗药物对于普通民众和部队的平、战时均具有特殊意义，在进行野外作 战、执行维和任务及抗震救灾时可作为药品储备及安全保障。
[0003] 任何创伤都有发生破伤风的可能，破伤风抗体是治疗破伤风的快速有效药物，目 前市场上的破伤风治疗药物有破伤风马抗毒素(TAT)和破伤风人免疫球蛋白（HIGT)，但是 它们在使用时均存在一定的缺点：
[0004] TAT的主要组成成分是经胃酶消化后的马破伤风免疫球蛋白，由于对人体来说TAT 是异源蛋白，因此在应用中皮试阳性率高(高于50%)，注射后过敏反应时常发生，常见的不 良反应有：1.过敏休克:可在注射中或注射后数分钟至数十分钟内突然发生;患者突然表现 沉郁或烦躁、脸色苍白或潮红、胸闷或气喘、出冷汗、恶心或腹痛、脉搏细速、血压下降、重者 神志昏迷虚脱，如不及时抢救可以迅速死亡;轻者注射肾上腺素后即可缓解;重者需输液输 氧，使用升压药维持血压，并使用抗过敏药物及肾上腺皮质激素等进行抢救。2.血清病:主 要症状为荨麻疹、发热、淋巴结肿大、局部浮肿，偶有蛋白尿、呕吐、关节痛，注射部位可出现 红斑、瘙痒及水肿；一般系在注射后7~14天发病，称为延缓型。亦有在注射后2~4天发病， 称为加速型。HIGT由乙型肝炎疫苗免疫后再经破伤风类毒素免疫的献血员中采集破伤风抗 体效价高的血浆或血清，经低温乙醇法提取的特异性免疫球蛋白制剂，含丙种球蛋白90% 以上。HIGT使用时无需皮试，可直接注射，但由于其属于血液制品，存在感染丙肝、艾滋等传 染病的潜在风险，而且受来源限制，产量较低，成本较高，市场上往往出现"一针难求"的现 象。
[0005] 基因工程破伤风中和抗体是通过哺乳动物细胞表达系统表达、纯化得到的具有中 和破伤风毒素功能的重组产品，它具有成分明确、理化性质稳定、副作用低、可无限量大规 模生产制备的优点。在作为军队战略储备时，可解决战争中由于使用TAT过敏反应引起的战 斗减员和HIGT供应不足引起军队战斗力下降的问题;在国家抗震救灾及处置破伤风相关的 突发公共卫生事件中，可作为急救药物，减少破伤风发生率，稳定民心。此外，随着家养宠物 越来越多，被宠物咬伤的情况时有发生，基因工程破伤风中和抗体作为TAG和HIGT的更新换 代产品，其市场前景是非常大的。发明专利CN102690789B、CN101220096B、CN1305904C、 CN100391975C均曾公开过抗破伤风毒素的单克隆抗体，但是目前尚未出现一株具有优异的 中和活性和保护效果的单克隆抗体，以至于目前还没有任何一个单抗发展到商业化和产业 化的阶段。
[0006] 破伤风毒素全长1315个氨基酸，分子量为150kDa，共由A、B、C三部分组成，每部分 分子量均为50kDa<X片段是重链的C端，具有结合神经细胞的作用。破伤风毒素天然C片段 (TeNT-Hc)保留了完整毒素与神经节苷脂结合等许多性质，免疫效价与毒素相当，无毒性， 过敏原性低，是发展亚单位疫苗和基因工程疫苗的候选者，也是筛选获得破伤风中和性单 克隆抗体的理想抗原。CN200910135972.0公开了一种通过核苷酸序列优化使破伤风毒素受 体结合区Hc在大肠杆菌中获得高效可溶性表达的方法，并获得了具有优异保护效果的基因 重组Hc蛋白亚单位疫苗，本发明通过引用将该专利的公开内容并入到本申请的说明书内容 之中。
[0007] 基于现有技术存在的上述技术问题，本发明欲利用重组表达的破伤风无毒抗原 TeNT-Hc(CN200910135972.0)免疫小鼠，制备可大量生产的高效价抗破伤风中和性和保护 效果的单克隆抗体。
【发明内容】
[0008] 基于上述发明目的，本发明首先筛选获得抗破伤风毒素重链C片段的，即破伤风毒 素的受体结合区的单克隆抗体，所述抗体的轻链可变区的CDRUCDR2和CDR3区，以及重链可 变区的⑶Rl、⑶R2和⑶R3区的氨基酸序列选自下述序列组合：
[0009] (I)SEQ ID N0:1 第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID N0:3第26-33、51-58、97-104位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为 TYl ；
[0010] (2)SEQ ID N0:5第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID N0:7第26_ 33、51-58、97-104位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为 TY5；
[0011] (3)SEQ ID N0:9第27-37、55-57、94-102位氨基酸序列，以及SEQ ID N0:11 第26- 33、 51-58、97-108位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为 TY8;或者
[0012] (4)SEQIDN0:13第27-32、50-52、89-97位氨基酸序列，以及SEQIDN0 :15第26- 34、 52-58、97-107位氨基酸序列，具有该序列组合序列的单克隆抗体在本发明中被命名为 TYllo
[0013] 在一个优选的实施方案中，所述抗体的轻链可变区，以及重链可变区的氨基酸序 列选自下述序列组合：
[0014] (I)SEQ ID NO: 1，以及SEQ ID N0:3;
[0015] (2)SEQ ID N0:5,以及SEQ ID N0:7;
[0016] (3)SEQ ID N0:9,以及SEQ ID N0:11;或者
[0017] (4)SEQ ID NO: 13,以及SEQ ID NO: 15。
[0018] 在一个更为优选的实施方案中，所述抗体的轻链恒定区，以及重链恒定区的氨基 酸序列均为下述序列组合:SEQ ID NO: 17,以及SEQ ID NO: 19。
[0019] 第二，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体轻链的核苷酸序列，编码所述抗 体轻链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID N0:18所示，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列 选自下述序列：
[0020] (I)SEQ ID NO:2;
[0021] (2)SEQ ID N0：6；
[0022] (3)SEQIDN0:10;或者
[0023] (4)SEQ ID N0：14〇
[0024]第三，本发明还提供了一种编码上述单克隆抗体重链的核苷酸序列，编码所述抗 体重链恒定区的核苷酸序列由SEQ ID N0:20所示，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列 选自下述序列：
[0025] (I)SEQ ID N0：4；
[0026] (2)SEQ ID N0：8；
[0027] (3)SEQIDN0:12;或者
[0028] (4)SEQ ID N0：16〇
[0029] 第四，本发明还提供了一种含有编码上述单克隆抗体重链和/或轻链的核苷酸序 列的表达载体。
[0030] 优选地，所述载体为pMH3S分泌型真核表达载体。
[0031 ]第五，本发明还提供了一种含有上述表达载体的宿主细胞。
[0032] 优选地，所述细胞为CHO细胞。
[0033] 第六，本发明提供了上述单克隆抗体在制备破伤风治疗药物中的应用。
[0034] 最后，本发明为了克服目前单株抗体活性不高的技术难题，提供了一种药物组合 物，所述组合物含有至少一种上述的单克隆抗体，以获得具有多株抗体协同效应的中和活 性和保护率。
[0035] 优选地，所述组合物含有四种单克隆抗体。所述四种单克隆抗体的轻链可变区，以 及重链可变区的氨基酸序列为下述序列组合：
[0036] (I)SEQ ID NO: 1，以及SEQ ID NO:3;
[0037] (2)SEQ ID N0:5,以及SEQ ID N0:7;
[0038] (3)SEQIDN0:9，W&SEQIDN0:lUP
[0039] (4)SEQ ID NO: 13,以及SEQ ID NO: 15;
[0040]具有上述(l)-(4)序列组合序列的单克隆抗体在本发明中分别被命名为TY1、TY5、 TY8和TYll;所述抗体的轻链恒定区，以及重链恒定区的氨基酸序列均为下述序列组合:SEQ ID NO: 17,以及SEQ ID NO: 19。
[0041] 本发明公开的四株单抗均具有良好的特异性，能够特异地与TeNT-Hc和TT蛋白结 合，而与其他蛋白无结合活性。单株抗体对小鼠能够明显延长小鼠死亡时间，具有部分保护 活性，TYl、TY5、TY8、TYl 1单株抗体对小鼠两倍致死剂量的毒素保护率分别为50 %、30 %、 40%和40%。四株抗体各50yg联合使用时即可完全保护小鼠低于两倍致死