图1菌落PCR产物电泳、重组蛋白电泳和Western Blot鉴定图。左边Marker泳道为 DNA分子量标准，泳道1中的菌落PCR片段出现在预期位置。中间为纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，在预期位置出现明亮条带。右边为以抗PSMA单克隆抗体和抗His标签抗体的 Western Blot鉴定图。
【具体实施方式】
[0025] 下面通过单域重链抗体(多肽)的制备、分析及应用，对本发明做进一步说明，这些 具体实施例不应以任何方式被解释为限制本发明的应用范围。
[0026] 实施例1
[0027] 前列腺特异性膜抗原膜外区的真核表达
[0028] 采用RNAiso Plus试剂提取高表达PSMA的LNCaP细胞中总RNA，利用RT-PCR方法得 到编码PSMA胞外区片段的DNA片段，使用Not I与BamH I两种限制性内切酶将其插入真核表 达载体pRAG2a，通过T4DNA连接酶连接为重组质粒。重组质粒热击转化到TOP 10感受态细胞 培养过夜，将鉴定正确的克隆送测序验证。提取阳性克隆的质粒，使用脂质体 Lipofectamine 2000将DNA质粒转染至HEK-293细胞中培养，于不同时相点收集上清，进行 SDS-PAGE电泳检测。培养一定时间后，按照HisTrap FF Crude试剂盒操作纯化该蛋白。将纯 化后的蛋白进行SDS-PAGE后，电转至PVDF膜上，5 %脱脂奶粉封闭后，分别加入PSMA抗体和 His抗体，4°C过夜;漂洗后，加二抗室温下孵育Ih，再次漂洗，加入显色液进行显影(图1)。 [0029] 实施例2
[0030]抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体（即针对抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗 体)的淘选与鉴定
[0031]采用固相淘选的方法从驼源天然抗体噬菌体展示文库(为参考文献:〃涂追，许杨， 刘夏，等.驼源天然单域重链抗体库的构建与鉴定[J].中国生物工程杂志，2011，31 (4): 31 -36."中构建的展示文库）中淘选针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体。前列腺特异性 膜抗原膜外区的表达按照上述的实施例1进行，第一轮淘选时，采用磷酸盐缓冲溶液(PBS， pH7.4)稀释上述合成的PSMA胞外区蛋白至150yg/mL (第2-4轮包被浓度分别为100、50、50μ g/mL)，在酶标板上每孔加入IOOyL，4°C包被过夜。PBST (含0.5 % Tween 20)洗板5次，3 % BSA-PBS在37°C封闭2h，洗板3次，加入与0.5%BSA-PBS孵育过的噬菌体抗体库IOOyL(约含2 X IO11CFU)，37°C孵育lh，用PBST洗板5次(逐轮增加3次），再用PBS洗板10次(逐轮增加5次）。 再以10(^1冼脱液(甘氨酸-盐酸4!12.2)洗脱吸附的噬菌体(37°(3,51^11)，用5(^1^1^8-HCl (lmol/L，pH 9.0)中和洗脱物，取IOyL用于滴度测定，其余洗脱物扩增后用于下一轮淘 选。
[0032]经过四轮淘选后采用浓度为5yg/mL的PSMA胞外区蛋白包被酶标板，洗板、封闭同 上。加入扩增纯化的噬菌体克隆37°C孵育15min，100yL/孔，37°C孵育lh。洗板后加入稀释度 为1: 5000的HRP-anti-M13抗体，IOOyL/孔，37°C孵育 Ih JBST洗板5次，加 TMB工作液IOOyL/ 孔，室温20min，每孔加入50yL硫酸(浓度为2mol/L)终止反应，测定450nm吸光值。以前一轮 扩增的噬菌体抗体库直接包被酶标板作为阳性对照，以PBS替代噬菌体克隆为空白对照，用 间接phage-EL ISA法测定菌体颗粒的结合活性。
[0033] 表1间接phage-ELISA加样表
[0035] 将ELISA阳性克隆送测序公司进行序列测定，得到抗前列腺特异性膜抗原单域重 链抗体噬菌体阳性克隆的插入片段DNA序列，具体为(SEQ ID NO. :2):
[0036] ATGGCCCAGTTGCAGCTCGTGGAGTCTGGGGGAGGATTGGTGCAGGCTGGGGGCTCTCTGAGACTCTCCTGTGCAGC CTCTGGACGCACCTTCAGTAGGTATGCCGTGGGCTGGTTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGAGCGAGAGTTTGTATCAG GTCTTAGTTGGACAGGTAGTAGTACACTCTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCTTCTCCAGAGACAACGCC AAGAAAATGGTGTATCTGCAAATGAACACGCTGATGCCTGAGGACACGGCCGTTTATTACTGTGCAGCTCGAAAAAC ACGCGGTAAAAGTTATGAGTACTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCAGAACCCAAGACACCAAAACCAC AAGCGGCCGC
[0037] 其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. :1所示：
[0038] QLQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGRTFSRYAVGWFRQAPGKEREFVSGLSWTGSSTLYADSVKGRFTFSRDNAKK MVYLQMNTLMPEDTAVYYCAARKTRGKSYEYWGQGTQVTVSS。即本发明抗前列腺特异性膜抗原的单域 重链抗体，其能与PSM蛋白的膜外区发生特异性结合。
[0039] 实施例3
[0040] PSMA表达细胞的ELISA和荧光免疫检测
[0041 ] 胃癌细胞MKN45不表达PSMA，而前列腺癌细胞LNCaP表达PSMA，以这两种细胞为例， 采用实施例2中淘选获得的抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆进行细胞 水平的ELI SA和荧光免疫检测。向96孔板中分别种入LNCaP细胞(表达PSM)和MKN45细胞(不 表达PSMA)各I X IO4个，培养过夜。4%多聚甲醛固定，每孔滴加 IOOyL的3%过氧化氢液，用 以阻断内源性过氧化物酶活性，37°C孵育30min JBS洗板3次，5 %BSA-I3BS封闭，加入IOOyL 抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆，于37°C孵育lh。其后PBS漂洗，添加 HRP-ant i -Ml 3抗体、TMB工作液和OD45Q的测定同实施例2。阳性对照使用噬菌体替代细胞，空 白对照使用PBS替代添加的噬菌体克隆，重复3次。
[0042]向24孔板中的每孔中添加细胞爬片后种入LNCaP细胞和MKN45细胞各4X IO5个，培 养过夜。取出爬片，4%多聚甲醛固定，漂洗，滴加3%过氧化氢在爬片表面，用以阻断内源性 过氧化物酶活性。其后TBS洗3次，5 % BSA-PBS封闭30min。滴加 IOOyL展示本发明所述纳米抗 体的噬菌体克隆孵育lh，以不加噬菌体克隆的细胞爬片为空白对照。其后添加稀释度为1: 2000的anti-M13单克隆抗体孵育30min。洗片后滴加30μ1稀释度为1: 200的FITC-山羊抗小 鼠二抗，避光孵育30min，并用DAPI染色液进行复染，置于荧光显微镜下观察。
[0043] 结果表明：由于不表达PSMA的MKN45细胞测值在统计学上与空白对照存在差异，表 明该噬菌体能够与其发生非特异性结合;但是LNCaP细胞测值显著高于MKN45细胞，表明这 一部分差异来自于PSMA和抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆的特异性 结合。同时，细胞免疫荧光表明LNCaP细胞能够与针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体 阳性克隆结合，而MKN45细胞以及未加抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克 隆的细胞爬片为阴性，表明淘选出的抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆 能够有效地与PSM表达阳性的细胞发生特异性结合。
[0044] 实施例4
[0045]抗前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体在大肠杆菌中的表达
[0046] 提取实施例2中针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体阳性克隆的噬菌粒为模 板，设计特异性引物扩增目的基因，扩增条件:94°C5min预变性;94°C30s、55°C30s、72°C40s 共30个循环；最后72°C再